Name: RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin, arşiv formalin sabit parafin gömülü doku çekirdeklerinden RNA ve DNA ekstraksiyonunu. Bu yöntem prostat kanseri örneklerinde nükleik asit verimini artırır ve hassas bölge hedeflemesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Movember/Prostat Kanseri Kanada'dan JMSB, DMB, PCP ve JL'ye bir ekip hibesi ve Ontario Kanser Araştırmaları Enstitüsü (JMSB, DMB ve PCP) ve Baba Kingston/Üniversite Hastaneleri Kingston Vakfı/Kingston Genel Hastanesi (DMB, PCP) için Motosiklet Sürüşü tarafından desteklenmiştir.

1. Doku Delme <ol><li> mikroskop lamı gözden geçirin ve ince nokta kalıcı bir kalem kullanarak ilgi bölge (ler) özetlemektedir. mikroskop lamı üzerine ilgi bölgeyi kaplayacak kadar büyük parafin filmin bir bölümünü kesip. sıkıca slayt filmi yerleştirin ve kaymasını filmi tutmak için kenarları boyunca filmi sarın. ama dışında - - bölge (ler) ince nokta kalıcı bir kalem kullanarak, anahat dokunma tutarak, tüm doku ve doku içinde ilgi bölgesi (ler) özetlemektedir. </li><li> filmi çıkarın ve ilgili doku bloğuna transfer. (Şekil 1) saygısız veya tüm doku anahat bloğunda doku gözlenen şeklini eşleşecek şekilde çevirerek filmi yönlendirin. sıkıca kaymayı önlemek için blok yüzeyine film bölümüne basın. </li><li> kalıcı bir kalem ucunu kullanarak, bölge (ler) arasında anahat boyunca (~ 0.2 mm) sığ fakat görünür girintileri yapmakmenfaati arasında fark, daha sonra filmi çıkarın. Yük, ayrı 1.5 veya 2.0 ml mikrosantrifüj tüpleri içine ağartıcı,% 70 etanol ve 1 ml su. </li><li> ucu tüp içeren ağartıcı batırılan ise yukarı ve aşağı birkaç kez yumruk kaydırarak tarafından belirlenen 0.6 mm zımba gelen reseptörü (kırmızı) yumruk temizleyin. % 70 etanol ve su ile yukarıda yineleyin (yani ağartıcı sağlamak için kritik bir kaldırılır). </li><li> 3 mm derinliğe kadar ilgi bölge içinde, doku içine yumruk basın ve yumruk çekme. kalemle yumruk dışarı iterek 1.5 ya da 2 ml&#39;lik tüp bağlama düşük içine çekirdek bırakın. -20 ° C (uzun süreli) veya kısa süreli kullanım için 4 ° C&#39;de çekirdekleri saklayın. </li><li> 1.4 adıma ve sonraki bölgeler veya numune ile devam etmek için uygun yumruk temizleyin. </li></ol> 2. FFPE doku çekirdekleri Deparaffinize <ol><li> Doku iç 1 ml ksilen ilave edilmesi ve 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın 1.5 ya da 2 ml&#39;lik tüplerde Carryout Parafinden arındırma lamların. Hea50 ° C&#39;de 3 dakika boyunca t. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) ve 5 dakika boyunca buz üzerinde, maksimum hıza (21.130 x g) ve yeri tüp 2 dakika süreyle santrifüj (mumsu artık madde üzerine katılaşmaya sağlar). </li><li> Dikkatle ksilen tedavi bir pipet kullanarak süpernatant ile menisküs etrafında biriken parafin kaldırmak ve tekrar (2.1-2.2 adımlar). </li><li> 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde, etanol (% 100) ve girdap 1 ml ilave edilir. RT (maksimum hız) 2 dakika süreyle santrifüj ve dikkatli bir şekilde etanol atın. bir zamanlar yukarıdaki adımı tekrarlayın. </li></ol> Deparafinize Damar 3. Homojenizasyon <ol><li> Homojenizasyondan önce etanol (% 100), 700 | il çekirdekleri yeniden süspanse edin. Motorlu bir doku homojenleştirici kullanılarak ince bir doku parçacıklar halinde çekirdek öğütmek (~ orta ayara, 1 dakika). carry-over kontaminasyon en aza indirmek için her bir numune arasındaki homojenleştirici probu temizleyin. <ol><li> ~ Ağartıcı RNaz nötrleştirme çözeltisi ve% 70 10 ml etanol ile 15 ml tüpler doldurun. Örnek homo sonragenization, yukarıda belirtildiği üzere temizleme çözeltilerinin her homojenizer probu yıkayın. yıkama aşamasında en yüksek hızda homojenleştirici çalıştırın. </li><li> doku ile prob silin ve sonda bir sonraki numune homojenize önce tamamen kurumasını bekleyin. Görme kalan doku parçaları için prob bıçakları inceleyin. Eğer bulunursa, tekrar probu temizleyin. Günlük temizlik çözümleri (çamaşır suyu, etanol ve RNaz nötralize çözeltisi) değiştirin. </li></ol></li><li> Homojenizasyondan sonra, daha fazla% 100 etanol (~ 300 ul) eklenmesi ile 1 ml numune hacmi getirmek. 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj dikkatlice RNA ekstraksiyonu ile devam etmeden önce yaklaşık 15-20 dakika süreyle etanol ve hava kuru pelet aspire. </li></ol> Proteinaz K ile 4. Sindirim <ol><li> pelet gevşetmek için 150 ul Proteinaz K sindirimi Tampon pelet ve fiske tüp tekrar süspansiyon. ısıya dayanıklı proteinaz K 10 ul ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın (yok) Tüp vorteks. hafif bir sallama ile 15 dakika boyunca 56 ° C&#39;de tüp içinde içeriği inkübe edin. </li><li> boru 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe izin verin. Tam soğutma takip eden aşamada etkin çökeltme için çok önemlidir. en yüksek hızda 15 dakika süreyle santrifüj. </li></ol> DNA 5. Ayrı RNA <ol><li> Dikkatle RNA saflaştırılması için yeni bir 1.5 ml, pelet bozmadan, süpernatant aktarın. </li><li> DNA saflaştırma için pelet (topak -20 ° C&#39;de 1 gün öncesine kadar 2-8 ° C&#39;de veya uzun süreler için için, oda sıcaklığında 2 saat süre ile muhafaza edilebilir) tutun. </li></ol> 6. RNA saflaştırma <ol><li> 15 dakika boyunca 80 ° C&#39;de RNA içeren süpernatant inkübe (bu kez fazla değil). Sonraki kısaca kapağın içinden damla toplamak için tüp santrifüj. </li><li> bağlama koşulları ayarlamak ve pipetleme karıştırın 320 ul Tampon RLT ekleyin. Daha sonra, 720 | il etanol (% 100), ve vorteks ekleyin. </li><li> transferi 62 ml toplama tüpüne yerleştirilmiş (kitinde) RNA döndürme kolonuna kurdu ve kalan içeriği kenara olabileceğiniz çökelti dahil numune 00 ul. ≥8,000 xg&#39;de 15 sn santrifüj, flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. </li><li> Aktarım ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için borunun kapak içinde birikebilen damlacıklar santrifüj içeren bir kolona numunenin geri kalan ve akış-through atın. </li><li> , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 350 ul Tampon FRN ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. </li><li> Yavaşça, 70 ul tampon RDD 10 ul DNaz I stok solüsyonu karışımı spin kolon zarına doğrudan ekleyin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için, döndürme kolonuna santrifüj 500 ul Tampon FRN ekleyin ve bir sonraki aşamada kullanım için akış-through kaydedin. Bir spin kolon yerleştirin küçük RNA&#39;ların kurtarma geliştirmek içinYeni 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü ve döndürme kolonuna önceki adımda elde edilen akış oranı uygulanır. </li><li> ≥8,000 xg&#39;de 15 sn santrifüj, flow-through atın ve bir sonraki adımda toplama tüpü yeniden. , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 500 ul Tampon RPE ekle flow-through atın ve bir sonraki adımda toplama tüpü yeniden. </li><li> ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 500 ul Tampon RPE ekleyin ve flow-through ile toplama tüpü atın. </li><li> Yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin 5 dakika boyunca maksimum hızda kapağı ve santrifüj açın. flow-through ile toplama tüpü atın. </li><li> Yeni bir 1.5 ml&#39;lik spin sütunu yerleştirin doğrudan spin kolon zar üzerine RNaz içermeyen su 20 ul, ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca tüp inkübe edin. 1 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüje RNA elute edin. -80 ° C&#39;de elüt RNA numunesi saklayın. </li></ol><ol><li> Proteinaz K tamponu 45 ul adım adım ilavesiyle RNA ekstraksiyonu sırasında elde edilen pelletini (400 mM Tris 7.5, 400 mM NaCI, 3 mM MgCI2,% 4 SDS); 45 ul H2O; ve yüksek gücü proteinaz K, 400 ug </li><li> 24 saat boyunca 56 ° C&#39;de yukarıda belirtilen çözelti inkübe (tavsiye edilen) ya da gece boyunca karıştırılmıştır. Kısaca 2 çalkalama olmaksızın sıcak ve 90 ° C &#39;de Performincubation kapağın içerisinden damla toplama mikrosantrifüj tüpü santrifüjlenir. </li><li> Örnek, oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve daha sonra 4 ul RNaz A (100 mg / ml) ekleyin izin verin. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca örnek inkübe edin. </li><li> örnek 200 ul Tampon AL ekleyin ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır. Daha sonra,% 100 etanol içinde 200 ul ekle ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır. ≥8,000 x g&#39;de 1 dakika için sağlanan spin kolon, bir yerde bir 2 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde, ve santrifüj Numunenin tamamı aktarın. </li><li> ile toplama tüpü atın-Akmasına ve yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin. , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn, spin kolona santrifüj 700 ul Tampon Aw1 ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. </li><li> , ≥8,000 xg&#39;de 15 sn, spin kolona santrifüj 700 ul Tampon Aw2 ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. Daha sonra, ≥8,000 xg&#39;de 15 sn için spin kolon, santrifüj% 100 etanol 700 ul ve akış yoluyla sahip toplama tüpü atın. </li><li> Yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin 5 dakika boyunca tam hızda spin kolon kapağını ve santrifüj açın. flow-through ile toplama tüpü atın. </li><li> yeni bir 1.5 ml&#39;lik bir toplama tüpü içinde spin kolon yerleştirin ve ısıtılmış nükleaz içermeyen su (50 ° C) 25 ul ekle. 10 dakika boyunca 50 ° C&#39;de sütun ve tüp inkübe edin. maksimum hızda 1 dakika için santrifüj, kolona nükleaz içermeyen su (RT) 25 ul ekle ve boyunca inkübeOda sıcaklığında 1 dakika. </li><li> maksimum hıza (21.130 x g) ve genomik DNA (toplam DNA, yaklaşık 50 ul) ihtiva eden hasat akış yoluyla 1 dakika için santrifüjleyin. -20 ° C&#39;de sütun Mağaza (durumda başka bir elüsyon sonra gereklidir). </li></ol>

<ol><li>Kern, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+your+new+cancer+biomarker+may+never+work%3A+recurrent+patterns+and+remarkable+diversity+in+biomarker+failures%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures.</a> Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).</li>
<li>Beltran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Next-generation+Sequencing+of+Advanced+Prostate+Cancer+Identifies+Potential+Therapeutic+Targets+and+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Urol%22%5BJournal%5D)">Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity.</a> Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).</li>
<li>Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+selection+bias+with+tumor+tissue+retrieval+in+molecular+epidemiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies.</a> Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).</li>
<li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLOS ONE. 2 (12), e1261(2007).</li>
<li>Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemical+modification+of+RNA+from+formalin-fixed+samples+and+optimization+of+molecular+biology+applications+for+such+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples.</a> Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).</li>
<li>Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+paraffin+embedded+material+for+genetic+and+epigenetic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
<li>Turashvili, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+quantity+and+quality+from+paraffin+blocks%3A+defining+optimal+fixation%2C+processing+and+DNA%2FRNA+extraction+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques.</a> Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+laser+capture+microdissection+for+analysis+of+retinal+mRNA%2FmiRNA+expression+and+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation.</a> Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).</li>
<li>Bonin, S., Stanta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+extraction+methods+from+fixed+and+paraffin-embedded+tissues+in+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).</li>
<li>Bonin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicentre+validation+study+of+nucleic+acids+extraction+from+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues.</a> Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).</li>
<li>Montaser-Kouhsari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+Coring+for+Large-scale+Studies+in+Molecular+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Immunohistochem.+Mol.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).</li>
<li>van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+a+fully+automated+high-throughput+DNA+extraction+method+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+for+KRAS%2C+and+BRAF+somatic+mutation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis.</a> Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).</li>
<li>Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coextraction+and+PCR+Based+Analysis+of+Nucleic+Acids+From+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Lab.+Anal%22%5BJournal%5D)">Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens.</a> J. Clin. Lab. Anal. , (2014).</li>
<li>Hennig, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+extraction+of+DNA+and+RNA+from+a+single+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+section+for+analysis+of+both+single-nucleotide+polymorphisms+and+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression.</a> Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).</li>
<li>Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+method+of+DNA+extraction+from+small+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+molecular+oncologic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing.</a> BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30(2014).</li>
<li>Torrente, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed+laryngeal+biopsies%3A+Comparison+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques.</a> Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).</li>
<li>Okello, J. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+in+the+recovery+of+nucleic+acids+from+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+autopsy+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues.</a> Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).</li>
<li>Abramovitz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+RNA+extraction+from+FFPE+tissues+for+expression+profiling+in+the+DASL+assay%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay.</a> BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22AllPrep+DNA%2FRNA+FFPE+Handbook%22">AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook</a>. , (2012).</li>
<li>Laurent, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+discussions+and+preliminary+findings+on+extracellular+RNA+measurement+methods+from+laboratories+in+the+NIH+Extracellular+RNA+Communication+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracell.+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium.</a> Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).</li>
<li>Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment ">https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment </a> (2012).</li>
<li>Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR%3A+a+novel+PCR+assay+for+methylation+status+of+CpG+islands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).</li>
<li>Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+repetitive+element+DNA+methylation+by+MethyLight%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight.</a> Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).</li>
<li>Yegnasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypermethylation+of+CpG+Islands+in+Primary+and+Metastatic+Human+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer.</a> Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).</li>
<li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

ilgi doku bölgeleri arasında DNA ve RNA, başarılı bir çıkartma için doğru karot kritiktir. Bu protokol, 0.6 mm çapında çekirdek izole edilmesi için, bir doku zımbanın kullanımını tarif ve mikroskop notasyonları aktarma işlemini FFPET blokları, ilgili kayar özetlenmektedir. üreticinin protokolüne değişiklikler etkin yaklaşık protokolü amaçlanmıştır olan mikrotom bölümleri 50 kat daha kalın olan çekirdeklerden nükleik asitleri, elde etmek için gerekli oldu. çekirdek doku kesitlerinde daha fazla parafin akrabası, tekrarlanan ksilen ve etanol tedavi adımlarda çekirdek etkili parafinden arındırma içerebilir beri istendi. Post-Parafinden arındırma lamların adımların başarısı, uygun mekanik doku çekirdekleri homojenizasyon ve verimli proteinaz K sindirimi bağlıydı. proteinaz K sindirimi daha da iyileştirme yapılabilir. Bu kayda değer olduğunu bu yöntem tanımladıhistopatoloji slaytlar mukabil tanımlandığı gibi bloğun yüzeyi üzerinde ilgili fies alanları. 3 ya da 4 mm derinliğinde olabilir çekirdek hasat dokusu gibi, bu protokol, kullanıcıların hücreleri veya dokular blok yüzeyinin altında yatıyordu ne endişe olabilir. Bu geçerli bir endişe olmasına rağmen, (referans 27 gözden) birden fazla çalışmalar doku çekirdekleri sadakatle yinelenen veya üç çekirdek ilgi alanından örneklenir, özellikle patolojik doku blokları histolojik ve moleküler özellikleri temsil ettiğini göstermiştir. Bu protokolde kabul edilen modifiye ticari çıkarma seti aynı doku hem DNA ve RNA eş zamanlı çıkarma olanak olarak, protokol değerli biyolojik malzeme tasarrufu sağlar ve aynı örnekten iki sonuçlanan nükleik asitler arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. RNA ve DNA eşzamanlı çıkarma yarıya emek ve doku tükenmesi keser ve gen İfade kesin entegre analiz sağlarsalgılamanın yanı sıra DNA&#39;da bulunan epigenetik ve genetik özellikler. bu temsili doku çekirdeklerinden hem RNA ve DNA verimleri beri tipik sırasıyla 600 ve 300 ng aşan ve en güncel PCR ve yeni nesil dizileme uygulamaları genellikle 10-100 ng gerektirdiğinden, bu protokol ile saflaştırılmış örneklerin çoğu yeterli vermelidir birkaç alt analizler için malzeme. Bu protokol bağımsız laboratuarlarda arasında tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir (Selvarajah ve diğ., Prep olarak.). Bu protokol ile ilgili RNA RT-PCR veya popüler bir birden fazla analit platformu kullanılarak gen ekspresyon analizi için yeterli kalitede ve DNA metilasyon spesifik PCR deneylerinde iyi performans göstermiştir. Yeni nesil dizileme kurtarılmış nükleik asitlerin programı değerlendirmeyi amaçlayan ileri çalışmalara gereksinim duyulmaktadır. Bu nedenle, çok sayıda modifikasyonlar uygun fo render ince FFPET bölümleri için tasarlanmış ticari olarak temin protokolü için yapılmıştır0.6 mm FFPET çekirdeklerinden RNA ve DNA r eş çıkarma. protokol prostat kanseri örneklerinin büyük bir kohort ve meme, beyin ve mesane kanserleri alınan örneklerin sınırlı sayıda sürekli yüksek verim gösterdi. Genel olarak, protokol büyük iyi açıklamalı doku koleksiyonları hedeflenen gen bazlı analizler yürütmek için olanak sağlamak gerekir. Önemlisi, protokol çoğu downstream uygulamalar için FFPET ilgi bölgelerin verimli odaklı örnekleme nispeten küçük eller zamanında ve yeterince yüksek verim sağlar.

Genomik biyomarker araştırma doğru ve güvenilir hastalık durumunu yansıtmak ve klinik olarak yararlı bir şekilde bunu. 1 Biyomarker gelişme iyi açıklamalı doku örneklerinin retrospektif analizi güvenen moleküler korelasyonun tespit etmeyi amaçlamaktadır. Hastalıklı ve normal doku örnekleri olarak taze donmuş doku uzman biyobankalar ya da klinik arşivlerinde formalin-sabit parafine gömülü doku (FFPET) blok olarak ya depolanır. Taze dondurulmuş doku, yüksek kaliteli nükleik asitlerin ekstre sağlar ve yaygın olarak genomik biyomarker bulma çalışmalarında kullanılmıştır. 2,3 Bununla birlikte, daha az doku örnekleri biyobankalar mevcuttur ve bu doku okuyan büyük örnekleri, sıradışı kategoriye doğru bir eğilimi getirmektedir banka dokuya daha fazla yetenekleri ile özel merkezlerde görülen hastalık ve hastaların. 4 FFPET, aksine, hastalıklı insan ve hayvan dokuları için varsayılan depolama yöntemidir. FFPET blokları hücresel m sürdürürkenorphology, sabitleme işlemi, çapraz bağlantılar nükleik asitlere diğer hücre bileşenleri olarak kullanılabilirler. Çapraz bağlı, RNA ve DNA geri kazanılabilir, fakat sadece bozulmuş, çok parçalı bir formları. 5,6 Bununla birlikte, bu, DNA ve RNA fragmanları mRNA ekspresyonu, DNA hipermetilasyonu ve hedef sıralama dahil tahlillerin genişleyen tadını analizine uygundurlar. 7,8 büyük miktarda ve araştırma için kullanılabilir FFPET çeşitliliği Bu fırsattan yararlanmak için, verimli ve güvenilir bir çıkarma protokolü için bir ihtiyaç vardır. dokuda biyobelirteç araştırmaları büyük bir kısmı kanser üzerinde duruluyor. hastalıklı dokunun diğer türleri gibi, kanser, doku, genellikle hücre korunması ve hücre türü önemli bölgesel heterojen gösterir. biyobelirtecin araştırma moleküler özellikleri ile hastalıklı dokunun bileşenleri ilişkilendirmek için yeteneği bağlı olduğundan, bu sürecin önemli bir adımdır iyi d korunmuş ve zenginleştirilmiş doku kesin hasat olduğunuçalışılan hastalığı bulunanlarda. FFPET iki zenginleştirme teknikleri sıklıkla kullanılmaktadır: lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), ve mikrotom kesit. LCM yüksek doku hasadı odaklı sağlayan ve heterojen dokularda spesifik, iyi korunmuş hücre tipleri izole etmek için kullanılabilir. 9,10 Ancak LCM örneklerin büyük sayılar için alıcı engelleyici zaman pahalı ekipman gerektirir ve. Mikroskobik kesit ince kesitler FFPET bloklardan kesilen bir daha yaygın kullanılan bir süreçtir. 11,12 Mikroskobik kesilmiş bölümleri genellikle hücre korunması heterojen doku içerir (örneğin, nekrotik vs iyi korunmuş) ve kompozisyon (örn, kanser genel dolayısıyla huylu parankimi) ve ayrı olarak incelenmiştir iyi moleküler özelliklerinin homojenizasyon neden olabilir. Böylece, ilgi konusu hücreler için zenginleştiren yüksek verimli bir yöntem için bir ihtiyaç vardır. Üçüncü bir yöntem, FFPET çekirdeklerinden nükleik asitlerin izolasyonu, bu zenginleşme sağlayan yüksek throug için uygundurprotokolleri hput ve ayrı doku çekirdeklerinden RNA ya da DNA izole etmek için başkaları tarafından kullanılmaya başlanmıştır. 7,13,14 Yayınlanmış protokollere bir dizi FFPET (Tablo 1) nükleik asitlerin çıkarılma yöntemlerinin belirtir. Ancak, RNA ve DNA aynı dokudan çıkarılan protokolleri değil doku çekirdekleri için, mikrotom doku bölümleri için optimize edilmiştir. Doku özgüllük arttı teklif 15,16 Benzer şekilde, yayınlanan protokolleri, ya doku çekirdek veya slayt microdissections yoluyla, prosedürleri belirtmek DNA ekstre ancak burada değil RNA. 7,17, aynı doku iç hem DNA ve RNA, çift çıkarılması için optimize edilmiş bir protokol için gösterilmiştir. Doku çekirdekleri FFPET blok eşleştirilmektedir çıkar bölgelerine dokusu mikrodizisi (TMA) zımbalar sokulmasıyla hasat edilir. haritalama bir marker kalem ile bir mikroskop lamı açıklama ve ilgili FFPE yüzeyine ek açıklama aktarılması ile gerçekleştirilirT bloğu (Şekil 1). Bu protokolün gelişmesine yol açmıştır Önceki çalışma çeşitli ticari olarak temin edilebilen nükleik asit emiş sistemleri bir mukayesesini de içerdi. Bu karşılaştırmada, ticari protokollere modifikasyonlar, aşağıda tarif edildiği gibi, en yüksek DNA ve RNA verimi ve kaliteyi (Selvarajah et al., Prep olarak) temin etmiştir. Doku çekirdekleri genellikle FFPET ekstraksiyon protokolleri 11,12,14,18 kullanılan 5-10 um mikronluk kesitler daha kalındır - 20 ve parafin daha değişken miktarlarda içerebilir. Bunu dengelemek için, Parafinden arındırma lamların ksilen ve etanol tedavileri tekrarlayarak ve motorlu homojenizasyon adımı (Şekil 1) tanıtarak tarafından geliştirilmiştir. Ayrıca, proteinaz K sindirimi süreleri DNA verimini artırmak için uzadığı tespit edildi. Genel olarak, bu protokol maliyet-etkin ve la hastalığın moleküler ve histopatolojik arasındaki bağlantıların kurulmasını sağlarrge, iyi karakterize popülasyonları. bütünüyle protokol özel ve pahalı ekipman için çok az ihtiyacı olan eller zaman 3 saat olmak üzere, 2 gün içinde güvenilir gerçekleştirilebilir. Adım-adım protokol üreticinin protokol değiştirilmiş bir versiyonu olarak bundan olduğunu. 21 özel reaktifler, ekipman ve üreticileri için Malzemeleri / Ekipman Tablosuna bakınız.

<table><tbody><tr><td>Plastik parafin filmi, "Parafilm 'M'"Bemis</td><td>&nbsp;</td><td>RK-06720-40</td><td>Herhangi bir jenerik parafin filmi</td></tr><tr><td>, Sodyum Hipoklorit, "Ultra Çamaşır Suyu"</td> yerine çalışacaktırAynı <td>şekilde</td><td>53-2879-2</td><td>Herhangi bir jenerik ağartıcı ikame olarak çalışacaktır. Temas halinde yanıklara neden olabilecek tehlikeli maddeler.</td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji sınıfı mutlak etanol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2818-500</td><td>Sigma-Aldrich E7023</td></tr>, <tr><td>Moleküler Sınıf H2O</td><td>G-Biosciences</td><td>786-293</td><td>Sigma W4502'nin yanı sıra Beecher Instruments için moleküler sınıf H2O</td></tr><tr><td>0.6 mm Punch Setinin</td> bir ikamesi olarak yeterlidir;<td>Estigen</td><td>MPO6[Sarı]</td><td>Ayarlanan Kırmızı alıcı zımbasını kullandığınızdan emin olun</td></tr><tr><td>İnce nokta kalıcı işaretleyici</td><td>Sharpie</td><td>10365796S</td><td>İşaretleyiciyi FFPE dokularında kullanmak hızlı bir şekilde kurumasına neden olur, bu nedenle birkaç tane gerekebilir</td></tr><tr><td>FFPE doku bloğu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FFPE bloğuna</td><td></td><td></td><td></td>karşılık gelen lekeli doku lamı</tr><tr><td>1.5 ml Mikro Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher BioReagents</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Düşük bağlayıcı tüpler (LoBind Mikro-Santrifüj Tüpleri)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Düşük bağlayıcı tüpler (LoBind Mikro-Santrifüj Tüpleri)</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Histoloji Ksilen</td><td>VWR</td><td>CA 95057-822</td><td>Fisher Scientific X5-500 ikame olarak yeterlidir</td></tr><tr><td>Moleküler Biyoloji Sınıf 2-Propanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep FFPE DNA/RNA Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>AllPrep DNA/RNA FFPE El Kitabı21Tamponlara göre tamponları hazırlayın</td></tr><tr><td>: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI çözeltisi</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>AllPrep DNA/RNA FFPE El Kitabı21</td></tr> <tr><td>sıcaklığa dayanıklı proteinaz K</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek etkili proteinaz K</td><td>Invitrogen</td><td>25530-049</td><td>Invitrogen 25530-015 ikame</td></tr><tr><td>RNAse nötralize edici çözelti olarak yeterlidir (Rnase AWAY)</td> <td>Moleküler BiyoÜrünler</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA 100 mg / ml</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>BD Integra Şırınga 3 ml 21G x 1/2</td><td>BD & nbsp;</td><td></td><td></td>305274</tr><tr><td>Motorlu doku homojenizatörü (TissueRuptor)</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>9001271</td><td>Fisher Scientific 14-261-29</td></tr>, <tr><td>yedek-20 & derece olarak yeterlidir; C ve -80 & derece; C Laboratuvar Dondurucu &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml tüpler</td><td></td><td></td><td></td>için rotorlu Mikro Santrifüj</tr><tr><td>Dijital Vorteks Karıştırıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetler ve filtre uçları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isıtma blokları veya su banyoları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Hidroklorür&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0234</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0241</td><td></td></tr><tr><td>Susuz Magnezyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Sigma</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Akrodisk 25 mm şırınga filtreleri, 0.45 & # 181; m Supor membran</td><td>Pall</td><td>PN 4614</td><td></td></tr><tr><td>Geri çekilebilir BD PrecisionGlide iğneli şırınga 3 ml</td><td>BD Integra</td><td>305274</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>BDH</td><td>3026</td><td></td></tr><tr><td>Multianalit gen ekspresyon platformu (nCounter > CAE kod seti ve Nanostring nCounter platformu</td><td>) Nanostring nCounter platformu, Nanostring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Florometrik nükleik asit miktar tayini (Qubit dsDNA HS Test Kiti ve Qubit&reg; RNA BR Test Kiti)</td> <td>İnvitrojen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna ve dna ekstraksiyon hem formalin sabit parafin gömülü doku Çekirdek hazırlanması

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalinle sabitlenmiş parafin gömülü doku (FFPET), moleküler araştırmalar için değerli, iyi açıklamalı bir substratı temsil eder. FFPET'in moleküler analizdeki faydası, hem heterojen doku bileşimi hem de nükleik asitlerin ekstraksiyonu sırasındaki düşük verim nedeniyle karmaşıktır. Bir literatür araştırması, bu sorunları ele alan protokollerin yetersizliğini ortaya çıkardı ve hiçbiri, FFPET'teki ilgi alanlarından RNA ve DNA'nın eşzamanlı olarak çıkarılması için doğrulanmış bir yöntem göstermedi. Bu yöntem her iki sorunu da giderir. Doku özgüllüğü, kanser ilgi alanlarının mikroskop lamları üzerinde haritalanması ve notasyonların FFPET bloklarına aktarılmasıyla sağlandı. Doku çekirdekleri, 0.6 mm mikroarray punchlar kullanılarak ilgi alanlarından toplandı. Nükleik asit ekstraksiyonu, doku sindirimini iyileştirmek ve nükleik asit verimini artırmak için homojenizasyon, deparafinizasyon ve Proteinaz K sindirim adımlarında modifikasyonlar ile ticari bir FFPET ekstraksiyon sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Modifiye edilmiş protokol, çok analitli bir gen ekspresyon platformunun yanı sıra mRNA ekspresyonunun ters transkriptaz bağlantılı gerçek zamanlı PCR analizi ve DNA metilasyonunun metilasyona özgü PCR (MSP) analizi dahil olmak üzere bir dizi aşağı akış analizinde kullanım için yeterli miktarda ve kalitede nükleik asit verir.

Bu protokol, doku çekirdekleri arasında DNA ve RNA geri kazanılması doku bölümleri için tasarlanmış ticari bir ekstraksiyon sisteminin modifikasyonlar için optimize edilmiş bir yöntemle temsil eder. Optimizasyon doku homojenizasyon giriş, DNA ekstraksiyonu için daha güçlü proteinaz K kullanımını ve doku sindirim süresi uzatma dahil. Grafikler ve istatistiksel analizler 2-yönlü ANOVA, lineer regresyon ve korelasyon dahil. Proteinaz Sindirim Optimizasyonları Ticari kit yüksek DNA verimi (Şekil 2A) ile sonuçlanan, daha kuvvetli bir proteinaz K ile ikame edilmiş bir oda sıcaklığı istikrarlı bir proteinaz K solüsyonu içermektedir. , DNA verimini artırmak için, sindirim, 2 den 24 saat kadar uzatıldı. Anlamlı bir fark iki zaman noktası arasında görüldü, ancak 24 saat sindirim sa daha tutarlı verim sağlamak için ortaya çıktıörnek olarak şunlar verilebilir. Ancak, daha fazla inkübasyon 48 saat daha DNA kurtarma geliştirmek vermedi (Şekil 2B; p = 0.74). FFPE Prostat Kanseri Doku Örnekleri tipik DNA Kurtarma Optimize edilmiş protokolü kullanarak, RNA ve DNA eş çıkarılan 3 ila 14 yaşındaki örnek yaş arasında değişen 333 prostat kanseri FFPET örneklerinden idi. Her örnekten, 3 doku çekirdekleri (± 0.13 mm 3 0.95&#39;lik ortalama toplam doku hacmi) girdi olarak kullanılmıştır. nükleik asitler moleküllerin boyut dağılımının değerlendirmelerini konsantrasyonlarını tahmin ve sağlayabilir diğer mikroakışkan bazlı jel-elektroforez yöntemleri bulunmakla birlikte, bu tür yöntemleri tekrarlanabilir nükleik asitler kantifikasyonunu vermeyin gibi flourometrically bazlı deneyler yapmak RNA ve DNA arasındaki farkı ayırt edemez. 22 Ve mikroakışkan bazlı jel-elektroforez sonuçları parçalanmış için güvenilir değildir, çünküFFPET türetilen nükleik asitler, 23 nükleik asit verimi (detaylar için reaktif listesine bakınız) florometrik ölçüldü. Ortalama verim RNA 2.270 ng DNA (Şekil 3A) 820 ng. Bu çalışmada incelenen tüm FFPET örneklerinin yaklaşık% 90 DNA ≥100 ng RNA&#39;nın ≥ 500 ng elde edildi. İlginçtir, FFPET numune ve nükleik asit kurtarma (Şekil 3B) yaş arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı. (R 2 = 0.39; p &lt;0.0001) Genel olarak, RNA ve DNA verimi örnekleri arasında korelasyon DNA&#39;dan daha fazlası gibi iki kat daha fazla bir RNA her bir örnek (Şekil 3C) geri kazanıldı, ancak. Pilot ve optimizasyon çalışmaları prostat dokuları üzerinde yapılan gibi, bir sonraki adım arşiv doku birkaç ek türleri bu protokolün performansını araştırmaktır. ile başlayan ameliyatla çıkarıldı ve otopsi FFPET örnekleri olmak temsilBu enfeksiyonlar iyi karaciğer (1 örnek vaka 1), beyin (1 kasasından 8 örnek), mesane (2 vakada 2 örnek), ve meme (3 olgudan 3 örnek) kanserleri, protokol DNA&gt; 100 ng vermiştir ve RNA% 90 numune (Şekil 3D). nükleik asit verimleri cerrahi dokularda daha otopsi dokularda düşük iken, temsilcisi sonuçları protokol farklı sitelerden kaynaklı kanserler arasında benzer verim ürettiğini göstermektedir. RNA değerlendirilmesi ve DNA bütünlüğü ve Mansap Analizi onların Temsilcisi Performans 47 8 seçilen FFPET prostat kanseri örneklerinde genler ve (bir pozitif kontrol olarak) taze PC-3 prostat kanseri hücre dizisi örneğin RNA ekspresyon analizi FFPET için optimize edilmiş ticari birden fazla analit gen ekspresyon platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. PC3&#39;de mRNA sayımları FFPET sa dan daha tipik yüksektiörnek olarak şunlar verilebilir (Şekil 4A). Bununla birlikte, tüm genlerinin göreceli ifade karşılaştırılması, FFPET prostat kanseri örnekleri RNA hem kaynakları RNA ekspresyon profili için uygun olduğunu gösteren, PC-3 RNA benzer sentezleme profilleri göstermektedir. Bu protokol ile ekstre edilmiş genomik DNA&#39;nın performansını göstermek için, FFPET örneklerinden bisülfitle dönüştürülmüş DNA ekstreleri metilasyonu ile çoğaltılmıştır spesifik PCR (MSP). 24 insan genomunda milyonlarca kopya içinde mevcut ALU tekrar eden kısımlar, çok fazla metilatlanmış bölgelerin MSP analizi, 25 genomik metilasyon kontrol olarak kullanılmıştır, ve numuneler arasında en az farklılıklar göstermektedir bekleniyordu. Şekil 4B&#39;de gösterildiği gibi, ALU MSP metilasyon seviyelerinde, farklı numuneler arasında görülen herhangi bir varyasyona az oldu. Bundan başka, GSTP1, prostat kanserinde, ancak huylu örneklerde hipermetile bilinen bir gen göre MSP deneyleri, 26 herhangi bir bulgulanabilir Amplif gösterdihuylu örneklerden DNA ications. Beklendiği gibi, düşük qPCR döngüsü eşik değerleri metile GSTP1 kopya zenginleştirme gösteren kanserli dokularda DNA tespit edilmiştir. Bu protokol ile geri kazanılmış, nükleik asitlerin kullanımı ayrıca nükleik beyin (post-mortem) selim karaciğerden ve elde asitler ve iki cerrahi bir müdahale göğüs kanseri örneklerinden hazırlanan tipik alt deneylerde test edilmiştir. İkisi de, RT-qPCR bazlı ekspresyon MSP deneyleri, meme kanseri ve karaciğer FFPET iyi performans, ancak RT-PCR deneyi, RNA bozulmuştur düşündüren, ölüm sonrası beyin tümörü örnek yüksek ölçüde sentezlenmiş bir mRNA (Şekil 4C) yükseltmek için başarısız nedeniyle gecikmeli doku fiksasyonu muhtemeldir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig1.jpg" /> Şekil 1:. FFPET Örnekleri için Ekstraksiyon Usulü Genel Bakış rakam ilgi nasıl bir alanı göstermektedirdoku bloğu bir mikroskop lamı gelen histopatolojik seçimine dayalı eşleştirilir. Üç 0,6 mm doku çekirdekleri daha sonra bir araya homojenize ve daha sonra RNA ve DNA hem de çıkarma tabi biyopsi yumruk kullanarak her doku alanından elde edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54299/54299fig2.jpg" /> . Şekil 2: İki proteinaz K (Sıcaklık Kararlı ve Yüksek Etkili Enzimler) ve ikincisi için inkübasyon Times bir Aralığı boyunca test (A) Proteinaz K Performans gelen ng Nükleik Asitler (DNA ve RNA) verimleri / FFPET mm 3 farklı tedarikçilerden. DNA ekstraksiyon k ile birlikte sıcaklık kararlı enzimi kullanılarak temsili FFPET numunesi üzerinde gerçekleştirilmiştirBaşka bir üreticinin daha güçlü enzim karşı. DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için en uygun Proteinaz K inkübasyon süresi belirlenmesi (B). yüksek konsantrasyonda proteinaz K sindirimi performansı 3 FFPET numuneleri kullanılarak üç farklı inkübasyon süreleri değerlendirilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hata temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54299/54299fig3.jpg" /> Şekil 3:. Nükleik Asitler (DNA ve RNA) Örnek Yıllara ve Temsilci Doku Türleri karşısında Toplam İçindeki FFPET Evi / mm 3 ng verimleri (A) Toplam formalin ile fikse parafine gömülü doku nükleik asitleri kurtarıldı. sunulmuştur nükleik asitler miktarları 333 FFPET örneklerinin ekstraksiyon dayanmaktadır Uoptimize protokol şarkı. Iyileşti toplam DNA ve RNA ve FFPET örneklerinin yaş arasında (B) Korelasyon arsa. Kullanılan ekstre FFPET örnekleri 333 prostat örneklerinde eşzamanlı ekstre DNA ve RNA verimi arasındaki 2012 (C) Korelasyon yaşındaki 2000 elde edildi. DNA ve RNA verimleri arasında pozitif bir korelasyon vardır. Ek arşiv doku türlerini kullanarak protokolü (D) Gösteri. Optimize edilmiş bir protokol 14 kanseri (meme, mesane, beyin) ve normal (karaciğer) örnekleri nükleik asitlerin ekstre edilmesi için kullanılmıştır. Hata çubukları SEM temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54299/54299fig4.jpg" /> Şekil 4: RNA ve DNA performans Tissu&#39;dan Co-özümlendiAlt Uygulamalar e çekirdek. (A) mRNA FFPE prostat kanseri dokular için taze PC-3 hücre hattı, kontrol için de geçerlidir. Her bir nokta ayrı ayrı çıkarılan 3 teknik çoğaltır ortalamasını temsil eder. Taze PC-3 hücre çizgisi RNA değerler sarı bar ve FFPET dokusu değerleri ile gösterilmiştir renkli noktalar ile temsil edilmektedir. FFPET prostat kanseri örneklerinin DNA (B) metilasyon spesifik PCR. Döngü eşik değerleri 50 ng / bisülfitle dönüştürülmüş DNA reaksiyon kullanılarak, beklendiği gibi yapılan 10 numune için elde edilmiştir. Tüm FFPET örneklerinden ALU MSP deneyleri benzer döngü eşik değerleri (p&gt; 0.67) vardı. GSTP1 MSP tahlilleri yüksek metilasyon (düşük devir eşiği) iyi huylu prostat oranla prostat kanserinde düzeyleri gösterdi. (C) ilave doku tipleri DNA ve RNA kalitesinin değerlendirilmesi. HPRT1 gen ifadesi ve alu gen metilasyon analizleri elde nükleik asitler (sırasıyla RNA ve DNA) gerçekleştirildi veyamal karaciğer (otopsi) ve beyin (otopsi) ve meme kanserleri (bütün FFPET). prostat sonuçları karşılaştırma için gösterilmiştir. Not: Benzer sonuçlar otopsi numune başarısız mRNA amplifikasyonu hariç her bir doku tipinden gözlenmiştir. Her nokta veya çubuk bir örnek temsil eder ve hata çubukları SEM temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54299/54299fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="12"> doku Çekirdekler </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Doku Girdi (mm3) </td><td rowspan="2"> Ekstre Nükleik Asit </td><td colspan="2"> onaylama </td><td colspan="3"> Kalite kontrolü: DNA </td><td colspan="4"> Kalite kontrolü: RNA </td></tr><tr><td> (Örnekleri arasında) </td><td> Numune yaşı (yıl) </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><html><td> PCR </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> Pikor ve diğ. </td><td> 43-129 </td><td> DNA </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Montaser-Kouhsari ve ark. </td><td> 18-29,5 </td><td> RNA </td><td> 763 </td><td> 0-25 </td><td></td><td></td><td></td><td> 843 </td><td> Veri yok </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bu kağıt </td><td> 1.71 </td><td> DNA ve RNA </td><td> &gt; 350 </td><td> 3-12 </td><td> 820 </td><td> 100-500 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 2270 </td><td> 100-500 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td>/ftp_upload/54299/check_mark.jpg &quot;/&gt; </td></tr><tr><td colspan="12"> Doku kesitleri </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> doku Girdi </td><td rowspan="2"> Ekstre Nükleik Asit </td><td colspan="2"> onaylama </td><td colspan="3"> Kalite kontrolü: DNA </td><td colspan="4"> Kalite kontrolü: RNA </td></tr><tr><td> (Örnekleri arasında) </td><td> Numune yaşı (yıl) </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr><tr><td> Heikal ve diğ. </td><td> 5 x 5 um </td><td> DNA </td><td> 12 </td><td> 7-22 </td><td> 88-300 </td><td> 103-351 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chung ve diğ. </td><td> 1 x 20 um </td><td> RNA </td><td> 9 </td><td> &gt; 5 </td><td></td><td></td><td></td><td> 16,000- 23,000 </td><td> 100-200 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Antica ve ark. </td><td> 2 x 4 mm </td><td> RNA </td><td> 18 </td><td> Veri yok </td><td></td><td></td><td></td><td> Bilinmeyen (621 ng / ul) </td><td> 80-202 + </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Ghatak ve diğ. </td><td> 5 x 5 um </td><td> DNA ve RNA </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> 14 256 </td><td> &lt;1030 </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> 16 000 </td><td> 109-400 + </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td> Hennig ve diğ. </td><td> 1 x 10 um </td><td> DNA ve RNA </td><td> 210 </td><td> 1-25 </td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td> Veri yok </td><td> Veri yok </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td></tr><tr><td colspan="12"> Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon </td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> Doku Girdi (mm2) </td><td rowspan="2"> Ekstre Nükleik Asit </td><td colspan="2"> onaylama </td><td colspan="3"> Kalite kontrolü: DNA </td><td colspan="4"> Kalite kontrolü: RNA </td></tr><tr><td> (Örnekleri arasında) </td><td> Numune yaşı (yıl) </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> Toplam verim (ng) </td><td> Fragman boyutu (bp) </td><td> PCR </td><td> NanoString </td></tr&gt; <tr><td> Kar ve diğ. </td><td> 1-2 </td><td> DNA </td><td> 110 </td><td> 0-2 </td><td> 430 </td><td> Veri yok </td><td><img alt="Onay işareti" src="/files/ftp_upload/54299/check_mark.jpg" /></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Doku çekirdekleri, bölme ve lazer yakalama microdissections için yayınlanmış olan DNA ve RNA ekstraksiyonu protokolleri karşılaştırması da içeren PCR ve Nanostring tahlilleri kullanarak bu yöntemlerin çeşitli molekül son nokta değerlendirme vardır.

Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Bu prosedürün genel amacı, arşivlenmiş formaline fikse edilmiş parafinle gömülmüş doku çekirdeklerinden sırasıyla RNA ve DNA ekstrakte etmektir. Bu, hem RNA hem de DNA ekstrakte edeceğimiz doku çekirdeklerinin toplanmasına yönelik bir protokoldür. Bu protokolün temel avantajı, doku bloğundaki hassas şekilde hedeflenmiş bölgelerden elde edilen RNA ve DNA verimini artırmasıdır.Bu prosedür büyük oranda arşivlenmiş prostat kanseri dokularında geliştirilmiştir. Ayrıca diğer arşivlenmiş doku türlerine de uygulanabilir. Doku örnekleme (coring) adımları araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmadığından, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.Çoğu araştırma laboratuvarı bunun yerine enine kesitler kullanır; bu durum dokuların daha hızlı tükenmesine neden olur ve örneğe önemli düzeyde heterojenlik katar. Mikroskop lamını inceleyerek ve ince uçlu kalıcı bir markör kullanarak ilgi bölgesini belirleyerek başlayın. Ardından, mikroskop lamındaki ilgi bölgesini kapatacak kadar büyük bir parafin film parçası kesin.Ardından, filmi kaymasını önlemek için kenarlarından katlayarak lamın üzerine sıkıca yerleştirin. İnce uçlu kalıcı bir markör kullanarak, tüm dokunun ve doku içerisindeki ilgi bölgesinin dış hatlarını çizin. Sonrasında, filmi lamdan çıkarın ve ilgili doku bloğuna aktarın.Filmi, tüm dokunun ana hattı bloktaki dokunun gözlemlenen şekliyle eşleşecek şekilde çevirerek veya döndürerek yönlendirin. Kaymayı önlemek için film kesitini bloğun yüzeyine sıkıca bastırın. Kalıcı işaretleyicinin ucunu kullanarak, ilgi alanının ana hattı boyunca sığ ancak görünür girintiler oluşturun ve ardından filmi kaldırın.Ardından, 0,6 milimetrelik punch setinden alınan reseptör punch'ının ucunu, bir mililitre çamaşır suyu içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne daldırıp punch'ı birkaç kez yukarı aşağı kaydırarak temizleyin. Yıkama işlemini %70 etanol içeren tüp ve ardından su ile tekrarlayın. Şimdi, temizlenen punch'ı ilgi bölgesine üç milimetre derinliğe kadar bastırın ve geri çekin.Çekirdeği, stilus ile punch'tan dışarı iterek düşük bağlanma özellikli bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Doku çekirdeklerini içeren mikro santrifüj tüplerine bir mililitre ksilen ekleyin ve on saniye boyunca şiddetle vorteksleyin. Ardından, 50 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğuna üç dakika boyunca yerleştirin.İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında maksimum hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, mumsu kalıntıların katılaşması için örnekleri beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Şimdi, menisküs çevresinde birikmiş olan parafini süpernatan ile birlikte bir pipet ucu kullanarak dikkatlice uzaklaştırın.Ardından, ksilen işlemini tekrarlayın. Parafin-ksilen karışımını uzaklaştırdıktan sonra, bir mililitre %100 etanol ekleyin ve on saniye boyunca kuvvetli bir şekilde vortekslenmesini sağlayın. Maksimum hızda iki dakika santrifüj ettikten sonra, etanolü dikkatlice dökün.Homojenizasyona başlamadan önce etanol yıkamasını bir kez daha tekrarlayın. Homojenizasyon öncesinde, deparafine edilmiş çekirdekleri 700 µL %100 etanol içinde yeniden süspanse edin. Çekirdekleri ince parçacıklar haline getirmek için orta ayarda motorlu bir doku homojenizatörü kullanın.Optimum DNA ve RNA verimi için doku çekirdeklerinin tamamen homojenleştirilmesi gerekir. Ardından, ayrı 15 mililitrelik tüpleri yaklaşık on mililitre çamaşır suyu, RNaz nötralize edici solüsyon ve yüzde 70 etanol ile doldurun. Örnek homojenizasyonundan sonra, homojenizatör probunu sırasıyla her bir temizleme solüsyonu ile yıkayın.Yıkama aşamasında homogenizatörü en yüksek hızda çalıştırın. Probun ucunu bir mendille silin ve bir sonraki örneği homogenize etmeden önce probun tamamen kurumasını bekleyin. Prob bıçaklarını kalıntı doku parçaları açısından görsel olarak kontrol edin ve eğer bulunursa, probu tekrar temizleyin.Homojenizasyonun ardından, numune hacmini %100 etanol ile bir mililitreye tamamlayın, ardından maksimum hızda 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Proteinaz K ekstraksiyonuna başlamadan önce etanolü dikkatlice aspire edin ve peletleri yaklaşık 15 ila 20 dakika boyunca havada kurutun. Peletleri 150 µL proteinaz K sindirim tamponu içinde yeniden süspande edin ve peleti gevşetmek için tüpleri hafifçe vurun.Daha yüksek DNA geri kazanımı için gece boyu proteinaz K sindirimi önerilir. 10 µL ısıya dayanıklı proteinaz K ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın. Hafif ajitasyonla 56 °C'de 15 dakika inkübe edin.Tüpleri üç dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Soğutmanın ardından, tüpü maksimum hızda 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, peletleri rahatsız etmeden, her bir süpernatantı RNA saflaştırma için yeni bir mikro santrifüj tüpüne dikkatlice aktarın.DNA ekstraksiyonu için uzatılmış bir doku sindirim süresi içeren yazılı protokoldeki optimize edilmiş prosedürü kullanarak RNA ve DNA ekstre edin. Bu yöntemle, eski formalinle fikse edilmiş parafinle gömülü doku örneklerinden RNA ve DNA geri kazanılabilir. Nükleik asitler, örnek yaşı üç ile 14 yıl arasında değişen prostat kanseri örneklerinden birlikte ekstre edilmiştir.Ortalama verim 2.270 nanogram RNA ve 820 nanogram DNA idi. İlginç bir şekilde, doku örneğinin yaşı ile nükleik asit geri kazanımı arasında anlamlı bir korelasyon saptanmamıştır. Genel olarak, örnekler arasında RNA ve DNA verimleri korelasyon göstermiş olsa da çoğu durumda DNA'ya kıyasla iki katından fazla RNA geri kazanılmıştır.Bu protokol ile ekstrakte edilen genomik DNA'nın performansını göstermek için, arşivlenmiş prostat kanseri örneklerinden elde edilen bisülfit konvertasyonlu DNA ekstraktları, metilasyona özgü PCR ile amplifiye edilmiştir. Metilasyon kontrolü olarak kullanılan ALU tekrarlayıcı elementleri, örnekler arasında çok az varyasyon göstermiştir. Prostat kanserinde hiper-metile olduğu bilinen bir gen olan GSTP1, benign örneklerden ekstrakte edilen DNA kullanıldığında metilasyona özgü PCR ile tespit edilebilir bir amplifikasyon göstermemiştir.Agresif prostat kanseri olan hastalardan alınan DNA örnekleri, indolent prostat kanseri hücrelerinden alınanlara göre daha düşük ve tespit edilebilir QPCR döngü eşik değerleri sergilemiştir; bu durum, agresif prostat kanserinde GSTP1 metilasyonunun arttığını göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik RNA için üç ila dört saat içinde, DNA için ise gece boyu süren sindirimin ardından uygun şekilde gerçekleştirilirse dört saat içinde tamamlanabilir. Bu tekniğin, moleküler patoloji alanındaki araştırmacıların çeşitli kanserlerde tanısal DNA ve RNA biyobelirteçlerini keşfetmelerine olanak sağlaması beklenmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, arşivlenmiş doku bloklarındaki hassas bir şekilde haritalanmış ilgi alanlarından DNA ve RNA ekstraksiyonu için doku çekirdeklerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-formalin-fixed-paraffin-embedded-tissue-cores-for-both

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video formalin ile fikse parafine gömülü malzeme DNA ekstraksiyonu için protokol göstermektedir. Bu doku kesitlerinde ksilen ile deparafinize olduğu bir çok günlük bir prosedür, etanol ile sulandırılır ve sonraki gen-spesifik veya genom analizi için DNA arındırmak ve izole etmek için proteinaz K ile tedavi edilir.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanserinden (NSCLC) doku ve sitoloji örneklerini korumak için kullanılan formalinle sabitlenmiş parafine gömülü tümör örneklerinin hazırlanmasını...

Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Tümör Örneklerinin Hazırlanması: Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinden (KHDAK) Doku ve Sitoloji Örneklerini Koruma Protokolü

Aşağıdaki videoda, formalin fiksasyonu ve parafin gömme ile bir dokunun morfolojisinin nasıl korunacağı açıklanmaktadır.

Formalinle Sabit Parafin Gömülü (FFPE) Doku Koruma: Doku Morfolojisini İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, RNA kromojenik in situ hibridizasyon için FFPE doku örneklerinin ön işleminde yer alan adımları göstermektedir. Ön işlem süreci, hücreler içindeki nükleik asit bütünlüğünün ve genel doku morfolojisinin korunmasına yardımcı olur.

RNA CISH için FFPE Doku Ön Tedavisi: RNA Kromojenik In Situ Hibridizasyon için Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Doku Kesitlerini İşleme Prosedürü

Floresans in-situ hibridizasyon (balık), histopatoloji ve moleküler teşhis tedavi kişiselleştirilmiş tıp yelpazesi için birlikte genellikle gereklidir. Balık görüntülenmeden önce izin veren yüksek kaliteli morfolojik, moleküler ve balık analizleri aynı örnek buna ek olarak bir sonrası fiksasyon adım tarafından bir roman çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku sabitleştirici.

HER2 için iletişim kuralı balık bir çapraz bağlama, Formalin ücretsiz doku sabitleştirici Cryo-koruma ve Formalin fiksasyon avantajları birleştirmek için kullanma

Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Parafin katıştırılmış örneklerden formalin sabit insan hastalıkların moleküler biyolojik değerli bir kaynağı temsil eder. Burada başlangıçta taze donmuş RNA ile tasarlanmış ve dokulara gelen arşivlenmiş mikroRNA'lar analizini 35 yaşına kadar saklı için en iyi duruma getirilmiş bir laboratuar tabanlı cDNA Kütüphanesi hazırlık protokolü, mevcut.

Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü

Kas hasarı altta yatan mekanizmaların belirlenmesi çok önemlidir. Burada parafine gömülü ve Drosophila torasik kasları bölümleri dondurulmuş hazırlamak için histolojik teknik sunuyoruz. Bu kas morfoloji ve protein ve diğer kas hücre bileşenleri lokalizasyonu analizi sağlar.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

Fonksiyonel T-hücre deneylerinde antijen kaynağı olarak kullanılacak insan doku özleri hazırlamak için basit bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku-türetilmiş antijenleri ile T-hücresi yanıtı ölçülmesine imkan...

Fonksiyonel Tahliller için Doku Antijenleri çıkarımı

Arşiv formalin sabit ve (FFPE) gömülü parafin klinik numuneleri hastalıkların araştırılması için değerli bir malzemedir. Burada microdissected FFPE doku derinlemesine proteomik analizini sağlayan bir örnek hazırlama iş akışını göstermektedir.

Formalin gelen Proteomic Numune Hazırlama parafin blok doku Sabit ve

Öğrenin, arşiv formalin sabit parafin gömülü doku çekirdeklerinden RNA ve DNA ekstraksiyonunu. Bu yöntem prostat kanseri örneklerinde nükleik asit verimini artırır ve hassas bölge hedeflemesi sağlar.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Daha fazla video keşfet