RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, arşiv formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku çekirdeklerinden RNA ve DNA'yı sıralı olarak çıkarmaktır. Bu, hem RNA'yı hem de DNA'yı çıkaracağımız doku çekirdeklerini toplamak için bir protokoldür. Bu protokolün temel avantajı, doku bloğundaki kesin olarak hedeflenen bölgelerden RNA ve DNA verimlerini iyileştirmesidir.

Bu işlem büyük oranda arşiv halindeki prostat kanseri dokularında gelişmiştir. Diğer arşiv dokusu türlerine de uygulanabilir. Doku karot alma adımları araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmadığı için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir.

Çoğu araştırma laboratuvarı bunun yerine dokuları daha hızlı tüketen ve örneğe önemli ölçüde heterojenlik katan kesitler kullanır. Mikroskop slaytını gözden geçirerek ve ince noktalı kalıcı bir işaretleyici kullanarak ilgilenilen bölgenin ana hatlarını çizerek başlayın. Daha sonra, mikroskop lamı üzerindeki ilgilenilen bölgeyi kaplayacak kadar büyük bir parafin film bölümü kesin.

Ardından, filmi slaytın üzerine sıkıca yerleştirin ve kaymasını önlemek için filmi kenarlardan sarın. İnce noktalı kalıcı bir işaretleyici kullanarak, tüm dokuyu ve doku içindeki ilgilenilen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin. Ardından, filmi slayttan çıkarın ve ilgili doku bloğuna aktarın.

Filmi, tüm dokunun ana hatları blokta gözlemlenen doku şekliyle eşleşecek şekilde çevirerek veya döndürerek yönlendirin. Kaymayı önlemek için film bölümünü bloğun yüzeyine sıkıca bastırın. Kalıcı işaretleyicinin ucunu kullanarak, ilgilenilen bölgenin ana hatları boyunca sığ ancak görünür girintiler yapın ve ardından filmi çıkarın.

Daha sonra, ucu bir mililitre ağartıcı içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne daldırarak ve zımbayı birkaç kez yukarı ve aşağı kaydırarak 0,6 milimetrelik zımba setinden alıcı zımbayı temizleyin. Yıkamayı yüzde 70 etanol içeren tüp ve ardından su ile tekrarlayın. Şimdi temizlenmiş zımbayı ilgilenilen bölgeye üç milimetre derinliğe kadar bastırın ve geri çekin.

Çekirdeği, kalemle zımbadan dışarı iterek düşük bağlayıcı bir mikro santrifüj tüpüne bırakın. Doku çekirdeklerini içeren mikrofüj tüplerine bir mililitre ksilen ekleyin ve on saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Ardından üç dakika boyunca 50 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirin.

İnkübasyonun ardından, oda sıcaklığında maksimum hızda iki dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, mumsu kalıntıyı katılaştırmak için çekirdekleri beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Şimdi, bir pipet ucu kullanarak süpernatan ile birlikte menisküs çevresinde biriken parafini dikkatlice çıkarın.

Ardından, ksilen tedavisini tekrarlayın. Parafin ksilen karışımını çıkardıktan sonra, bir mililitre yüzde 100 etanol ekleyin ve on saniye boyunca kuvvetlice girdaplayın. İki dakika boyunca maksimum hızda santrifüjledikten sonra etanolü dikkatlice atın.

Homojenizasyona başlamadan önce etanol yıkamasını bir kez daha tekrarlayın. Deparafinleştirilmiş çekirdekleri homojenizasyondan önce 700 mikrolitre yüzde 100 etanol içinde yeniden süspanse edin. Çekirdekleri ince parçacıklar halinde öğütmek için orta ayarda motorlu bir doku homojenizatörü kullanın.

Optimum DNA ve RNA verimi için doku çekirdeklerinin tamamen homojenizasyonu gereklidir. Daha sonra, ayrı 15 mililitrelik tüpleri yaklaşık on mililitre çamaşır suyu, RNase nötralize edici çözelti ve yüzde 70 etanol ile doldurun. Numune homojenizasyonundan sonra, homojenizatör probunu her bir temizleme solüsyonunda sırayla yıkayın.

Yıkama aşamasında homojenizatörü en yüksek hızda çalıştırın. Probu bir mendille silin ve bir sonraki numuneyi homojenize etmeden önce probun tamamen kurumasını bekleyin. Prob bıçaklarında artık doku parçaları olup olmadığını görsel olarak inceleyin ve bulunursa probu tekrar temizleyin.

Homojenizasyonun ardından, numune hacmini yüzde 100 etanol ile bir mililitreye getirin, ardından 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Etanolü dikkatlice aspire edin ve proteinaz K ekstraksiyonuna başlamadan önce peletleri yaklaşık 15 ila 20 dakika havayla kurutun. Peletleri 150 mikrolitre proteinaz K sindirim tamponunda yeniden süspanse edin ve peleti gevşetmek için tüpleri hafifçe vurun.

Daha yüksek DNA geri kazanımı için gece boyunca proteinaz K sindirimi önerilir. 10 mikrolitre sıcaklığa dayanıklı proteinaz K ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın. Hafif çalkalama ile 56 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Tüpleri buz üzerinde üç dakika inkübe edin. Soğuduktan sonra, tüpü maksimum hızda 15 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, peletleri rahatsız etmeden, RNA saflaştırması için her bir süpernatanı dikkatlice yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

DNA ekstraksiyonu için uzatılmış bir doku sindirim süresi içeren yazılı protokoldeki optimize edilmiş prosedürü kullanarak RNA ve DNA'yı çıkarın. RNA ve DNA, bu yöntem kullanılarak eski formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku örneklerinden elde edilebilir. Nükleik asitler, numune yaşı üç ila 14 yıl arasında değişen prostat kanseri örneklerinden birlikte ekstrakte edildi.

Ortalama verim 2.270 nanogram RNA ve 820 nanogram DNA idi. İlginç bir şekilde, doku örneğinin yaşı ile nükleik asit geri kazanımı arasında anlamlı bir ilişki yoktu. Genel olarak, RNA ve DNA verimleri numuneler arasında ilişkilendirildi, ancak çoğu durumda, DNA'ya göre iki kattan fazla RNA geri kazanıldı.

Bu protokolle ekstrakte edilen genomik DNA'nın performansını göstermek için, arşiv prostat kanseri örneklerinden bisülfite dönüştürülmüş DNA ekstraktları, metilasyona özgü PCR ile amplifiye edildi. ALU tekrarlayan elementler metilasyon kontrolü olarak kullanıldı ve numuneler arasında çok az değişiklik gösterdi. Prostat kanserinde hiper-metillenmiş olduğu bilinen bir gen olan GSTP1, iyi huylu örneklerden ekstrakte edilen DNA kullanıldığında metilasyona özgü PCR ile saptanabilir bir amplifikasyon göstermedi.

Agresif prostat kanseri olan hastalardan alınan DNA örnekleri, agresif prostat kanserinde GSTP1'in metilasyonunun arttığını gösteren, sessiz prostat kanseri hücrelerinden daha düşük saptanabilir QPCR döngüsü eşik değerleri sergiledi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik RNA için üç ila dört saat içinde ve gece boyunca sindirimi takiben, uygun şekilde yapılırsa DNA için dört saat içinde yapılabilir. Bu teknik, moleküler patoloji araştırmacılarının çeşitli kanserlerde tanısal DNA ve RNA biyobelirteçlerini keşfetmelerini sağlamalıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, arşiv dokusu bloklarında tam olarak haritalanmış ilgi alanlarından DNA ve RNA'nın çıkarılması için doku çekirdeklerinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.