Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

Bu cam yüzey işlevselleştirme işleminin genel amacı, ilgilenilen hücrelerin nazikçe yakalanmasına ve serbest bırakılmasına izin vermektir. Bu yöntem, tümör anjiyogenezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve ilaç direncini gösteren hücre biyobelirteçlerinin taranmasını sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, hemen hemen her hücre tipi için tamamen özelleştirilebilir olmasıdır.

Hücre tipine özgü bir antikor olduğu sürece, yüzey yakalanması için uyarlanabilir. Bu yöntem kanser anjiyogenezi hakkında bilgi sağlayabilse de, daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimlerinin geliştirilmesi için saflaştırılmış örnekler gerektiğinden diğer hastalıklara da uygulanabilir. Bu yöntem için ilk olarak, desthiobiotin ve adivin ailesi arasındaki etkileşimi kullanarak, hücreleri yakalamak için geri dönüşümlü bir salım mekanizması geliştirmeye çalışırken aklımıza geldi.

Metin protokolüne göre bir oksijen plazma makinesinde bir cam yüzeyi beş dakika temizledikten sonra, 50 mikrolitre APTES ve 2.45 mililitre etanolü konik bir tüpte birleştirerek 2,5 mililitre% 2 sulandırılmış 3-Aminopropil trietoksisilan veya APTES çözeltisi hazırlayın. APTES solüsyonunu cam yüzeylere pipetleyin, ardından yüzeyleri örtün ve APTES tabakasını eşit şekilde dağıtmak için oda sıcaklığında 50 dakika boyunca bir platform çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Bu arada, fırını sekiz ve 24 oyuklu plakalar için 55 santigrat dereceye veya cam tabaklar için 90 santigrat dereceye ısıtın.

Plakaları çalkalayıcıdan çıkardıktan sonra, cam yüzeyleri metin protokolüne göre durulamak için etanol kullanın. %100 azot gazı ile yüzeyleri kurulayın. Daha sonra sekiz ve 24 oyuklu plakaları iki saat fırına veya cam tabakları bir saat fırına koyun.

Daha sonra, 37.5 mikrolitre DMSO'da mililitre DSB başına 1.5 miligram karıştırarak ve mililitre EDC başına beş miligram ekleyerek 2.5 mililitre d-Desthiobiotin veya DSB çözeltisi hazırlayın 0.1 mikrolitre 0.1 Molar MES tamponu, pH 6. Ardından iki çözümü birleştirin. 15 dakika sonra, DSB ve EDC arasındaki reaksiyonu söndürmek için bir mikrolitre BME ekleyin.

Sıcak APTES işlevli cam yüzeyleri fırından çıkarın ve beş ila 10 dakika soğumaya bırakın. Pipeti 70 derecelik bir açıyla tutarak ucu doğrudan yüzeye bakmayacak şekilde durulamak için cam yüzeylere MES tamponu ekleyin. Daha sonra tamponu kuyu köşesi gibi sabit bir noktadan boşaltın ve çekin.

Ardından, iki kez daha durulamak için MES tamponunu kullanın. DSB solüsyonunu cam yüzeylere uygulayın. Bunları bir Petri kabının içindeki nemli bir kağıt havluya aktarın, tabağın üzerini örtün ve buzdolabında 18 ila 24 saat inkübe edin.

Dört santigrat derecede inkübasyondan sonra, bu videoda daha önce gösterildiği gibi her bir cam yüzeyi üç kez durulamak için PBS kullanın. Daha sonra, Streptavidin veya SAV stok çözeltisini mililitre başına 0.4 miligrama seyreltin ve ince bir tabaka oluşacak şekilde cam yüzeylere eşit şekilde uygulayın. Camı 18 ila 24 saat inkübe ettikten sonra, her yüzeyi üç kez durulamak için 150 mikrolitre PBS kullanın.

Daha sonra bir kağıt havluyu deiyonize suyla ıslatın ve kuyucuklardaki nemi korumak için plakaları çevreleyen 14 santimetrelik bir Petri kabına düz bir şekilde yerleştirin. Petri kabını cam yüzeylerle örtün ve ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derece biyogüvenlik Seviye 1 buzdolabına koyun. Hücre yakalamayı gerçekleştirmek için, ortamı T175 hücre şişelerinden aspire edin.

Daha sonra hücreleri durulamak ve tamponu aspire etmek için PBS kullanın. Şişeye 10 mililitre Hücre Ayrışma Çözeltisi gibi enzimatik olmayan kaldırma maddesi ekleyin. Daha sonra 37 santigrat derecede altı dakika inkübe edin.

Altı dakika sonra, kaldırma maddesini seyreltmek için 10 mililitre soğuk HBSS ekleyin. Daha sonra hücrelerin 20 mikrolitresini pipetleyin ve saymak için bir hemositometre kullanın. Hücre süspansiyonunu 500 x g'da, dört santigrat derecede, beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ve hücreleri mililitre başına 10 ila altıncı hücreye bir kez yeniden süspanse etmek için HBSS'yi kullanın. Çözeltideki hücreleri yeniden süspanse etmek ve antikor bağlanmasını azaltabilecek hücresel topaklanmayı azaltmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hücresel süspansiyonu ayrı kontrol ve deneysel çözeltilere bölün.

Biyotinile edilmiş antikorları ilgili hücre çözeltilerine ekleyin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede uçtan uca bir karıştırıcı üzerinde inkübe edin. Videoda daha önce gösterildiği gibi, işlevsel camı sekiz oyuklu plakalarda üç kez yıkamak için 150 mikrolitre HBSS kullanın. Hücre çözeltisini kuyucuklara ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Bu arada, steril HBSS'de 20 milimolar bir biyotin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, inkübasyondan sonra, hücre çözeltisini camdan durulamak için yavaşça 150 mikrolitre HBSS kullanın. Durulamayı iki kez daha tekrarladıktan sonra, her bir salım kuyucuğuna 150 mikrolitre biyotin çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun ilerlemesine izin vermek için 20 dakika inkübe edin.

Hücreleri yıkamak için HBSS kullanarak spesifik olarak bağlı olmayan hücreleri geri toplayın. Ardından, metin protokolüne göre floresan görüntüleme ve analizine devam edin. Denetim olarak bir şişeye canlı hücrelerin görüntülerini ekleyin.

Bu deneyde, MCF7GFP hücreleri işlevselleştirilmiş yüzeye maruz bırakıldı. Hücrelerin %60'ı HLA-ABC antikoru kullanılarak yakalandı. 20 milimolar biotine maruz kaldıktan sonra, yakalanan hücrelerin% 80'i serbest bırakıldı.

Burada gösterildiği gibi, MCF7GFP hücreleri RAW 264.7 hücreleri ile karıştırıldığında, RAW makrofajların% 50'si yakalandı ve daha sonra 20 mikromolar biyotin ilavesi, yakalanan RAW hücrelerinin% 80'ini serbest bıraktı. Bu şekil, pozitif kontrol RAW makrofajlarının floresan aktivitesi göstermediğini göstermektedir. Bununla birlikte, negatif kontrol MCF7GFP hücreleri GFP floresansı için pozitiftir.

Fazla antikor hücre tutulmasını azaltabileceğinden, antikor konsantrasyonu, mililitre HLA antikoru başına sıfırdan 10.000 nanograma titre edilerek optimize edildi. Sonuçlar, ideal antikor konsantrasyonunun mililitre başına 100 ila 1.000 nanogram arasında olduğunu gösterdi. Ek olarak, hücre optimizasyon deneyleri, yakalanabilecek ideal hücre konsantrasyonunun, bu sayının altındaki miktarlar arka plandan daha düşük olduğundan, bir kez 10 ila beşinci ve bir kez 10 ila altıncı hücreler arasında olduğunu belirledi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, gece boyunca yapılan inkübasyonlar hariç, altı saatten daha az deneysel süre ile üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, yüzeyin etkinliği hakkında hayati bilgiler verebilecekleri için deneyler sırasında hücre yıkamalarını toplamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen hücrelerin hangi reseptör ekspresyon seviyelerine sahip olabileceği gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, yüzey işlevselleştirmesi, biyomalzemeler alanındaki araştırmacıların, çeşitli hastalıklar ve yaralanmalar için hastalarda implantlar gibi malzemelerin biyogüvenli entegrasyonunu keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen hücreleri yakalamak ve serbest bırakmak için cam yüzeylerin nasıl işlevselleştirileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız, bu da aşağı akış analizine olanak tanır. Sodyum azid içindeki canlı hücrelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun eğitim, KKD ve imha etme gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.