Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

Bu cam yüzey fonksiyonelleştirme sürecinin genel amacı, ilgilenilen hücrelerin nazikçe yakalanmasını ve serbest bırakılmasını sağlamaktır. Bu yöntem, ilaç direncini gösteren hücre biyobelirteçlerinin taranmasına olanak tanıyarak tümör anjiyogenezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, neredeyse her türlü ilgili hücre tipi için tamamen özelleştirilebilir olmasıdır.

Hücre tipine özgü bir antikor olduğu sürece, yüzey bu hücrenin yakalanması için adapte edilebilir. Bu yöntem kanser anjiyogenezi hakkında bilgi sağlayabilse de, daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimlerinin geliştirilmesi için saflaştırılmış örnekler gerektiğinden, diğer hastalıklara da uygulanabilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, desthiobiotin ile adivin ailesi arasındaki etkileşimi kullanarak hücreleri yakalamak için tersine çevrilebilir bir salım mekanizması geliştirmeye çalıştığımızda ortaya çıktı.

Metin protokolüne uygun olarak bir cam yüzey oksijen plazma makinesinde beş dakika boyunca temizlendikten sonra, konik bir tüpte 50 µL APTES ve 2,45 mL etanolü birleştirerek 2,5 mL %2 rekonstitüe 3-Aminopropil trietoksisilan veya APTES çözeltisi hazırlayın. APTES çözeltisini cam yüzeylerin üzerine pipetleyin, ardından yüzeyleri kapatın ve APTES tabakasının eşit şekilde dağılması için oda sıcaklığında, platform sarsıcısında 50 dakika boyunca bekletin. Bu sırada fırını, sekizli ve 24'lü plakalar için 55 °C'ye veya cam kaplar için 90 °C'ye önceden ısıtın.

Plakaları çalkalayıcıdan çıkardıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak cam yüzeyleri durulamak için etanol kullanın. Yüzeyleri %100 azot gazı ile kurutun. Ardından, sekiz ve 24 kuyucuklu plakaları iki saat boyunca veya cam kapları bir saat boyunca fırında bekletin.

Ardından, 37,5 µL DMSO içinde 1,5 mg/mL DSB'yi karıştırarak ve 2.462,5 µL 0,1 M MES tamponuna (pH 6) 5 mg/mL EDC ekleyerek 2,5 mililitre d-Desthiobiotin veya DSB çözeltisi hazırlayın. Daha sonra iki çözeltiyi birleştirin. 15 dakika sonra, DSB ve EDC arasındaki reaksiyonu durdurmak için bir µL BME ekleyin.

Sıcak APTES fonksiyonelleştirilmiş cam yüzeyleri fırından çıkarın ve beş ila 10 dakika boyunca soğumaya bırakın. Pipeti, ucu doğrudan yüzeye bakmayacak şekilde 70 derecelik bir açıyla tutarak cam yüzeyleri durulamak için MES tamponu ekleyin. Ardından, tamponu kuyucuğun köşesi gibi sabit bir noktadan boşaltın ve geri çekin.

Ardından, iki kez daha durulamak için MES tamponu kullanın. Cam yüzeylere DSB çözeltisi uygulayın. Bunları bir Petri kabı içindeki nemli bir kağıt havluya aktarın, kabın kapağını kapatın ve buzdolabında 18 ila 24 saat inkübe edin.

Dört santigrat derece sıcaklıktaki inkübasyonun ardından, bu videonun başında gösterildiği gibi her bir cam yüzeyi üç kez PBS ile yıkayın. Ardından, Streptavidin veya SAV stok çözeltisini 0,4 miligram/mililitre olacak şekilde seyreltin ve ince bir tabaka oluşacak şekilde cam yüzeylere eşit olarak uygulayın. Camları 18 ila 24 saat inkübe ettikten sonra, her bir yüzeyi üç kez 150 mikrolitre PBS kullanarak yıkayın.

Ardından, deiyonize su ile bir kağıt havluyu ıslatın ve kuyucuklardaki nemi korumak için plakları çevreleyecek şekilde 14 santimetrelik bir Petri kabına düz bir biçimde yerleştirin. Petri kabını cam yüzeylerle kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar dört derece santigrat sıcaklıktaki Biyogüvenlik Seviye 1 buzdolabına yerleştirin. Hücre yakalama işlemini gerçekleştirmek için, T175 hücre flasklarındaki besiyerini aspire edin.

Ardından hücreleri durulamak için PBS kullanın ve tamponu aspire edin. Flask içerisine, Cell Dissociation Solution gibi 10 ml enzim içermeyen hücre ayırma ajanı ekleyin. Daha sonra 37 °C'de altı dakika boyunca inkübe edin.

Altı dakika sonra, kaldırma ajanını seyreltmek için 10 milliliters soğuk HBSS ekleyin. Ardından, hücrelerden 20 microliters pipetleyin ve onları saymak için bir hemositometre kullanın. Hücre süspansiyonunu 4 °C'de, 500 x g'de, beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Hücreleri ml başına 1x10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspande etmek için HBSS kullanın. Hücreleri çözelti içinde yeniden süspande etmek ve antikor bağlanmasını azaltabilecek hücresel kümelenmeyi önlemek için pipetle yukarı-aşağı karıştırın. Ardından, hücre süspansiyonunu ayrı kontrol ve deney çözeltilerine bölün.

Biyotinize antikorları ilgili hücre çözeltilerine ekleyin ve 4 °C'de, bir end-over-end karıştırıcıda 30 dakika boyunca inkübe edin. Videonun önceki bölümlerinde gösterildiği gibi, sekiz kuyucuklu plakalardaki fonksiyonelleştirilmiş camları yıkamak için üç kez 150 µL HBSS kullanın. Hücre çözeltisini kuyucuklara ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde, buz üzerinde 45 dakika boyunca inkübe edin.

Bu sırada, steril HBSS içerisinde 20 millimolar biotin çözeltisi hazırlayın. Ardından, inkübasyon sonrası, hücre çözeltisini camdan durulamak için nazikçe 150 microliters HBSS kullanın. Durulama işlemini iki kez daha tekrarladıktan sonra, her bir ilgili salım kuyucuğuna 150 microliters biotin çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun gerçekleşmesi için 20 dakika boyunca inkübe edin.

Hücreleri yıkamak için HBSS kullanarak spesifik olmayan şekilde bağlanmış hücreleri toplayın. Ardından, metin protokolüne uygun olarak floresan görüntüleme ve analiz işlemlerine geçin. Kontrol olarak bir flask içindeki canlı hücrelerin görüntülerini ekleyin.

Bu deneyde, MCF7GFP hücreleri fonksiyonelleştirilmiş yüzeye maruz bırakılmıştır. Hücrelerin %60'ı HLA-ABC antikoru kullanılarak yakalanmıştır. 20 millimolar biyotine maruz kalındığında, yakalanan hücrelerin %80'i serbest kalmıştır.

Burada gösterildiği üzere, MCF7GFP hücreleri RAW 264.7 hücreleri ile karıştırıldığında, RAW makrofajlarının %50'si yakalanmış ve ardından 20 µM biyotin eklenmesi, yakalanan RAW hücrelerinin %80'ini serbest bırakmıştır. Bu şekil, pozitif kontrol RAW makrofajlarının floresan aktivite göstermediğini kanıtlamaktadır. Buna karşın, negatif kontrol MCF7GFP hücreleri GFP floresansı açısından pozitiftir.

Fazla antikor hücre yakalamayı azaltabileceği için, antikor konsantrasyonu sıfırdan 10.000 ng/mL HLA antikoruyla titrasyon yapılarak optimize edildi. Sonuçlar, ideal antikor konsantrasyonunun 100 ve 1.000 ng/mL arasında olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre optimizasyon deneyleri, bu rakamın altındaki miktarlar arka plan seviyesinden düşük olduğu için yakalanabilecek ideal hücre konsantrasyonunun 1 × 10⁵ ve 1 × 10⁶ hücre arasında olduğunu belirledi.

Bu teknik bir kez kavrandığında, gece boyu süren inkübasyonlar hariç olmak üzere, altı saatten daha kısa bir deneysel süreyle üç günde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, yüzeyin etkinliği hakkında hayati bilgiler verebileceği için deneyler sırasında hücre yıkama sıvılarını toplamanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen hücrelerin hangi reseptör ekspresyon seviyelerine sahip olabileceği gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Yüzey fonksiyonelleştirme, geliştirilmesinin ardından, biyomalzemeler alanındaki araştırmacıların, çeşitli hastalıklar ve yaralanmalar için hastalara uygulanan implantlar gibi materyallerin biyogüvenli entegrasyonunu keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, alt analizlere imkan tanımak amacıyla, ilgilenilen hücreleri yakalamak ve salmak için cam yüzeylerin nasıl yüzey fonksiyonelleştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Sodyum azide içeren canlı hücrelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun eğitim, KKD ve bertaraf gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.