Name: Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Öğrenin cam yüzey fonksiyonlandırma yöntemiyle hedefli hücre izolasyonunu. Bu teknik, tümör anjiyogenezisi ve ilaç direnci biyobelirteçlerinin incelenmesine olanak tanır. Kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amerikan Kanser Derneği'ne, Illinois Division'a (282802) ve Ulusal Bilim Vakfı CBET'e (1512598) finansman desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca mikroskopi eğitimi için Illinois Üniversitesi Beckman Enstitüsü'nden Dr. Dianwen Zhang'a teşekkür ederiz. Son olarak, anlayışlı tartışmalar için Jared Weddell, Stacie Chen ve Spencer Mamer'e teşekkür etmek istiyoruz.

1. Cam Yüzey Temizleme ve Hazırlama Reaktifler <ol><li> temizlemek için% 50 güç, 5 dakika boyunca bir oksijen plazma sistemi bir cam yüzey üzerine koyun. </li><li> APTES 50 ul ve konik bir tüp içinde etanol 2.45 ml ekleyerek, 2.5 ml% 2 yeniden (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) çözeltisi hazırlayın. </li></ol> 2. APTES ve DSB fonksiyonlandırmalar <ol><li> yüzeylere APTES solüsyonu ekleyin. 8 kuyucuğu için kuyu başına Pipet 150 ul. 24 kuyucuğu için kuyu başına Pipet 100 ul. 60 x 15 mm cam yemekleri için 1.1 ml pipetle. buharlaşma ve APTES çözümünün dengesiz dağılımını önlemek için yüzeyleri örtün. APTES tabakanın eşit dağılımını oluşturur, oda sıcaklığında 50 dakika için bir platformlu sallayıcı üzerinde yüzeyleri yerleştirin. NOT: APTES yüzeyin birinci katmanını oluşturan bir aminosilan olduğunu. Farklı yüzey kullanıyorsanız, sezgisel yüzeyini kapsayacak şekilde gerekli çözelti hacmini belirler. </li><li> yüzeyler çalkalayıcı üzerinde iken, fırın sıcaklığı seçin: Isı 55 ° C 8 kuyucuğu için 2 saat ve 24 kuyucuğu için. Isı, cam, 1 saat boyunca 90 ° C&#39;ye kadar, sadece yemekler. </li><li> etanol ile yüzeyleri durulayın. <ol><li> kullanılan yüzeyin dayalı başvurarak gerekli etanol miktarı yönetme. 8 kuyucuğu için her kuyuya 150 ul etanol ekleyin. her bir 24 yuvalı plakalar 125 ul etanol ekleyin. Cam yemekleri için 1.1 ml etanol ekleyin. </li><li> boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. iki kat daha fazlasını kullanarak etanol durulayın. NOT: cam alt kuyu plakaların herhangi onları herhangi bir plastik varsa plastik eritmek ve çözgü başlayacak gibi, 65 ° C&#39;nin üzerinde ısıtmayın yok. </li></ol></li><li> bir depodan tevzi% 100 azot gazı ile kurutun. o yüzeyleri yerleştirinven. </li><li> 2462.5 dimetil sülfoksit (DMSO) 37.5 ul, 1.5 mg / ml DSB birleştirerek D-destiobiyotin (DSB) çözeltisi 2.5 mL hazırlayın ve 5 mg / ml 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) 0.1 M, 4-morpholinoethanesulfonic asit hidratı (MES) (pH 6) tampon ul. Sonra her iki çözümü birleştirir. </li><li> DSB EDC arasındaki reaksiyonu söndürmek için çözelti içine 15 dakika sonra, 2-β merkaptoetanol 1 ul ekle. Fırından cam yüzeyler işlevselleştirilmiş sıcak APTES çıkarın. soğutmak için cam yüzeyler için 5-10 dakika bekleyin. </li><li> MES yüzeyde dayalı miktarları kullanılarak, durulama yüzeyi tampon ekleyin. 150 ul MES 8 kuyu plakaları için de her tampon ekleyin. 125 ul MES 24 kuyucuğu için her oyuğa tampon ekleyin. Cam yemekleri için 1.1 ml MES tamponu ekleyin. </li><li> boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutunyüzeye. MES tamponu ile iki kez daha durulanır. </li><li> Onları inkübe izin yüzeylere DSB çözümü uygulayın. 8 kuyucuğu için kuyu başına 150 ul DSB çözüm ekleyin. 24 yuvalı plakalar için göz başına 100 ul DSB solüsyonu eklenir. cam tabaklar DSB çözümü için 1.1 ml ekleyin. </li><li> Petri kabı içinde nemli bir kağıt havlu üzerine DSB kaplı cam yüzeyler yerleştirin. Kapak ve 18-24 saat süreyle 4 ° C buzdolabında kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 3. Streptavidin Fonksiyonlandırma <ol><li> 1.0x fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 ml her bir cam yüzeyi, üç kez yıkayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. 0.4 mg streptavidin (Sav) stok solüsyonu sulandırmak / ml (önerilir). NOT: seyreltme ve durulama için bir araç olarak kullanılabilir, böylece PBS izotonik. PBS SA için bir çözücü olarak kullanılanh, ve bu nedenle, yüzeyi bağlanma Sav yeteneğini etkilemez. </li><li> cam alt formları ince tabaka yüzey göre çözeltinin miktarını seçmek ve böylece yüzeylere eşit Sav çözeltisi 0.4 mg / ml uygulanır. 8 kuyucuğu için, oyuk başına 150 ul 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir. 24 yuvalı plakalar için, oyuk başına 100 ul 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir. Cam yemekler için, 1.1 ml 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir. </li><li> Kapak ve nemi korumak için bir 14 cm Petri kabı plakaları taşıyın. 18-24 saat buzdolabında Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır. NOT: Her yüzeyde APTES, DSB ve Sav tutarlı hacimleri kullanmak esastır. </li><li> SAv kaldırmak için her cam yüzeyi PBS 150 ul ile üç kez yıkayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. </li><li> Bir kağıt havlu w Islakith de-iyonize su ve kuyu nem tutma plakaları çevreleyen 14 cm Petri kabındaki düz kağıt havlu yerleştirin. kuyu içeren Petri kabı örtün. kadar gerekli bir 4 ° C Biyogüvenlik düzeyi 1 (BSL-1) buzdolabında Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 4. Hücre Yakalama ve Yayın <ol><li> deney amaçlı hücrelerin T175 balonuna (ler) ile başlayın. balona (ler) den medya aspire. Oda sıcaklığı 5 ml PBS kalan medyayı yıkayın. balona (ler) den PBS aspire. </li><li> hücre, T-175 balonuna, bu hücre ayrışma Çözüm olarak enzimatik olmayan kaldırma maddesi 10 ml ekleyin. şişeden hücreler kaldırabilmek için 6 dakika kuluçka makinesi içinde balon koyun. </li><li> 6 dakika sonra, soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi 10 ml ekleyin (HBSS; Malzemelerin Listesi) kaldırma ajanı inaktive. Bir hemasitometre kullanılarak çözelti içinde hücrelerin sayısını saymak için hücrelerin 20 ul çıkarın. NOT: fonksiyon bağlıyakalama deneyde kullanılan yüzeyler laşma, gereken hücre sayısı değişir. fonksiyonelleştirilmiş 8 kuyucuğu için kuyu başına 300.000 hücre kullanın. işlevselleştirilmiş cam yemekleri için, 1,1 milyon hücreleri kullanır. fonksiyonelleştirilmiş 24 kuyucuğu için 125,000 hücreleri tavsiye edilir. hücre sayımı hakkında daha fazla bilgi eki bulunur. </li><li> adımları tekrarlayın 4.1- 4.3 hücrelerinin bir şişe için, daha az hücre deney için gerekli daha varsa. çözeltide hücrelerinin toplam sayısını elde etmek için hücre süspansiyonları ve yeniden sayılması hücreleri birleştirin. </li><li> Yoğunlaşan hücreler, bir tablet elde etmek için 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj hücre süspansiyonu dönerler. Daha sonra, ml başına 1 x 10 6 hücre konsantrasyonu elde döndürülür hücrelerden süpernatanı havalandırın, ve hesaplanan hacim kazandırmak için hücre süspansiyonu ekleyin HBSS uygun miktarda Bul. Bu hacim Eki&#39;nde denklemler kullanılarak hesaplanabilir. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı (çiğnemek) th tekrar süspansiyonçözelti e hücreleri ve antikor bağlanma azaltabilir çözeltide hücresel topaklanma azaltır. Ayrı kontrol ve deney çözümler hücresel çözüm bölün. bileşenleri ve hesaplamalar için ek Dosya görüntüleyin. </li><li> Yan Dosya açıklandığı gibi ilgili hücre çözümleri biotinlenmiş antikorlar ekleyin. bir uç aşırı uç karıştırıcı üzerinde 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edilir. Not: MCF7GFP hücreleri, 0.5 mg / ml hIgG veya 0.5 mg / ml, HLA-ABC antikorlar için tavsiye edilir. RAW makrofajlar için, 1 mg / ml mCD11b seyreltme farklılıkları hesaba yarım ses seviyesinde tavsiye edilir. İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde (HUVECler), 0.5 mg / ml hCD31 önerilir. </li><li> HBSS ile fonksiyonalize cam yüzeyi yıkayın. Bu deney için, 8 oyuklu plaka tavsiye edilir. <ol><li> 8 kuyucuğu için her kuyuya 150 ul HBSS ekleyin. HBSS kullanarak iki kez daha durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın.ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. 4 ° C&#39;de soğuk tutmak. </li></ol></li><li> kuyulara hücre çözümleri ekleyin ve hücreler çalkalayıcı üzerinde buz üzerinde inkübe için 45 dakika bekleyin. Ek açıklandığı gibi hesaplanan miktarlar kullanılarak steril HBSS biyotin çözüm olun. </li><li> HBSS kullanarak cam kuyulardan hücre çözüm çıkarın. <ol><li> Yavaşça her kuyuya 150 ul HBSS pipetle. Sonra HBSS dışarı pipetle. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. </li><li> iki kez daha tekrarlayın. Yıkama işleminden sonra, ıslak hücreler tutmak için oyuklara HBSS ekleyin. </li></ol></li><li> her bir ilgili serbest bırakmak için 20 mM biyotin solüsyonunun 150 ul ekleyin ve daha sonra reaksiyon için izin vermek için 20 dakika beklemek. </li><li> spesifik olmayan şekilde bağlanmış hücre hatırlamakHBSS ile yıkanarak s yukarıda belirtilen ve daha sonra floresan etiketli hücreleri kullanarak eğer, görüntüyü hücreleri floresan devam ettikçe. Ayrıca bir şişe içinde görüntü canlı hücreleri (bir kontrol olarak, bir gözdeki hücrelerin ile karşılaştırmak için). Yeşil floresan proteini (GFP) transfekte edilmiş hücrelerin kullanılması durumunda, uyarma 470 nm olacak ve emisyon 515 nm olur. </li></ol> 5. Antikor Optimizasyonu: Antikor Titrasyon <ol><li> Adım 4.1- 4.3 açıklandığı gibi T75 veya T175 şişesi hücreleri kaldırarak başlayın. NOT: Bu miktarlar 24 kuyucuğu için kalibre edilir, ancak sezgisel test yoluyla herhangi bir cam fonksiyonelleştirilmiş yüzeyleri uygun şekilde değiştirilebilir. Temsili bir antikor titrasyonu, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> Hemasitometre kullanılarak hücre sayımı ve daha sonra 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de konik bir tüp hücre çözeltisi aşağı doğru döndürün. Ek olarak anlatılan hesaplamalar kullanılarak, ml başına 1 milyon hücre hücreleri sulandırın. </li><li> 1 m bölmekantikor (Ab) çözümleri için farklı santrifüj tüplerine 500 ul altı farklı çözümler ml solüsyon başına illion hücreleri. <ol><li> 10 ug / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml antikor stok çözeltisi ile seyreltilir. Leke tampon maddesi (PBS +% 1 sodyum azid +% 1 BSA) 100 ul, ve hiçbir Ab kontrol hücrelerinin 500 ul kullanılarak kontrol oluşturun. Boş kontrol için (Resim Ab ve hücre yok), 300 ul PBS bir çözelti kullanır. NOT: DİKKAT: Sodyum azit son derece toksik, patlayıcı ve kullanırken son derece dikkatli olunmalıdır. Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) bakın ve uygun güvenlik ekipmanları kullanın. </li></ol></li><li> Bir araya getirin ve 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de, son aşırı ucunda karıştırıcı içinde, hücre çözümleri Ab çözümler inkübe edin. HBSS ile üç kez fonksiyonelleştirilmiş 24 kuyucuğu durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. pi tutunPette ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı. </li><li> Uygun APTES içine her numune çözeltisinin Kısım 125 ul, DSB ve Sav iyi fonksiyonalize. 4 ° C&#39;de ya da cam yüzeyi üzerinde, 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. spesifik olmayan bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır HBSS ile üç defa yüzey durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. Bu kontroller gibi, alt satır durulama yapmayın. </li><li> , Iyi yıkanmış her HBSS 150 ul ekleyin buz üzerinde 24 kuyu tabak koymak ve sonra GFP hücrelerinin (Uyarım 485 nm / Emisyon 528 nm) floresan ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. </li></ol> 6. Hücre Optimizasyonu: Hücre Titrasyon <ol><li> adımlarda 4.1 -4.3 belirtildiği gibi hücreleri kaldırın. </li><li> hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. böylece hücre aşağı spin4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de konik tüp dökülmesinden. ml başına 1 milyon hücre hücreleri sulandırın. NOT: hemasitometre kullanımına ilişkin daha fazla bilgi Ek bulunabilir. </li><li> Pipet konik bir tüp içinde 1,6 milyon hücre stok ve yer için hücre çözeltisinden 1.6 ml. konik bir tüp içinde 800.000 hücre stok ve yer için hücre çözeltisinden hücreler 800 ul pipetle. Pipet konik bir tüp içinde 80,000 hücre stok ve yer için hücre stokunun 80 ul. Pipet konik bir tüp içinde 8.000 hücre stok ve yer için hücre stoktan 8 ul. NOT: Konsantrasyonları gerektiği gibi çoğaltmak, 8 kuyu plaka ölçülerine göre verilir. Plakası çıkışı bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. </li><li> Dört stok çözelti alın ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj içinde dönerler. HBSS 400 ul tüm stok çözümleri yeniden askıya. </li><li> , 1.600.000 hücre stoku 100 ng / ml antikor 1.6 ul 0.8 μ800.000 hücre stokuna l ve diğer tüm stokları 0.5 ul. 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca uçtan aşırı ucunda bir karıştırıcıda 30 dakika boyunca antikorun inkübe edin. HBSS ile üç kez fonksiyonlaşmış cam yüzeyi yıkayın. Not: işlevselleştirilmiş 24 plaka plaka okuyucu ölçümü için tavsiye edilirken işlevselleştirilmiş 8 oyuklu plaka, mikroskopi ölçümü için tavsiye edilir. 8000 hücre stoku için antikor konsantrasyonu çözelti içinde antikorların eksikliği vermeye yakalama yüzeyinin sınırlayıcı bir faktör izin vermek için, indirgenmiş değildi, ama daha çok yüzey yakalama özellikleri. </li><li> Her bir oyuğa ve örnek solüsyonların 150 ul uygulanır. Soldaki kuyuların ilk sütuna 1,6 milyon hücre stoku uygulayın. soldan ikinci sütuna 800.000 hücre stok uygulayın. soldan üçüncü sütunda 80.000 hücre stok uygulayın. Nihayet son sütuna 8.000 hücre stok geçerlidir. çalkalayıcıda 4 ° C&#39;de 45 dakika süreyle inkübe edin. NOT: 1,6 milyonHücre stok test edilecek en yüksek konsantrasyon olarak hizmet verir ve (600.000 hücre kuyu başına) hücre ayırma deneylerinde genellikle kullanılan tipik hücresel konsantrasyonu olarak 800.000 hücre stok deney için kontrol olarak hizmet vermektedir hücrelerin çift miktarı ki (oyuk başına 3.000.000 hücre) hücre ayırma deneyleri kullanılır. 80.000 hücre stoku hücre yakalama için daha düşük konsantrasyonlarda (oyuk başına 30,000 hücre) test etmek için bir on kat sulandırıldıktan olarak hizmet eder. yüz kat seyreltme hücresel ayırma alt sınırı (oyuk başına 3.000 hücre) kontrol etmek için bir test olarak kullanmak kadar 8.000 hücre stok vermektedir. </li><li> HBSS ile üç kez durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. Tüm yıkar toplayın. </li><li> Görüntü bir floresan mikroskop hücreleri, 8 kuyu plakaları kullanıyorsanız, sur her fotoğraf çekmekYüz ve çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de bir saat süre ile, her yüzeyine 150 ul biyotin uygulanır. Bir saat sonra, daha önce olduğu gibi HBSS ile 3 kez biyotin salma kuyu durulayın. hemasitometre ve görüntü bırakma kuyuları ile sayılması için kuyulardan tüm yıkar toplayın. </li><li> 24 yuvalı plakalar kullanılarak ise, 1 saat süre ile biyotin salma uygun oyuklara ve HBSS ile gözlere 3 kez yıkayın 20 mM fazla biyotin solüsyonunun 150 ul uygulanır. Bir plaka okuyucusu kullanılarak 24 oyuklu plakalar nicelleştirmektedir. tüm toplanan kuyu yıkar hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın. </li></ol> 7. Görüntü Analizi Not: FİJİ yazılım paketi (http://fiji.sc/Fiji) görüntü analizi için tavsiye edilir. Başlangıçta, görüntüler gri tonlama görüntüye dönüştürüldü ve parlaklık / kontrast hücrelerini ortaya çıkarmak için değişmiş oldu. <ol><li> Görüntüyü yükleyin ve &quot;Tip&quot; aşağı kaydırma sonra resim sekmesini tıklatarak ve ardından tıklayarak gri tonlamaya dönüştürmek4, 8 bit &quot;. </li><li> Görüntü sekmesini tıklatarak ve ardından &quot;ayarlama&quot; kaydırarak görüntü kontrastını arttırmak. &quot;Parlaklık ve Kontrast&quot; üzerine tıklayın ve sonra hücrelerin öne çıkması için kaydırma çubuklarını kullanın. floresan görüntüleri kullanarak, daha fazla tanımlanmış hücreleri yapmak için görüntüleri ters. </li><li> ImageJ görüntüleri analiz etmek (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) ITCN denilen üzerine bir eklenti yükleyin. </li><li> Açık ITCN. Bir iletişim kutusu hücrenin boyutunu tahmin etmek birkaç parametre ile kullanıcıya sorar göründüğünde, öncelikle ilgi hücrenin minimum genişliğini ayarlayın. görüntü floresan ve hücrelerin karanlık ise &quot;Algılama Karanlık Peaks&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> &quot;Kont&quot; düğmesine basın, sonra başlangıçta 2&#39;de eşik değerini ayarlayın ve. Resmin Bir yeni sayılır versiyonu hücreleri sayılmış nerede belirleyen kırmızı noktalar ile görünecektir. </li><li> tanımdan daha doğru hücresel veri almak için eşik ve genişliği parametre ayarlayınBir &quot;hücre&quot; boyutunu ng. Not: Sağdaki bir iletişim kutusu olacak sayılan hücrelerin sayısı. Değişen Parametreler sayılan hücrelerin farklı numarası verecektir. </li><li> iyi bir tahmin hücrelerin sayısı için ulaşılıncaya kadar eşik ve genişlik parametreleri arasında yineleme devam ediyor. </li></ol>

<ol><li>Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+cells%3A+a+novel+marker+of+endothelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage.</a> Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).</li>
<li>De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+expression+analysis+in+kidney+glomeruli+using+microdissection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques.</a> Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).</li>
<li>Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+VEGFRs%2C+NRP1%2C+and+PDGFRs+on+Endothelial+Cells+and+Fibroblasts+Reveals+Serum%2C+Intra-Family+Ligand%2C+and+Cross-Family+Ligand+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).</li>
<li>Cheung, L. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+captured+cancer+cells+under+flow+acceleration+in+a+bio-functionalized+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel.</a> Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).</li>
<li>Privorotskaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+thermal+lysis+of+cells+using+silicon-diamond+microcantilever+heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters.</a> Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).</li>
<li>Park, K., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capture+and+lysis+of+vaccinia+virus+particles+using+silicon+nano-scale+probe+array%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array.</a> Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).</li>
<li>Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+breast+cancer+and+gastric+cancer+circulating+tumor+cells+by+use+of+an+anti+HER2-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device.</a> Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).</li>
<li>Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+combinatorial+mixing+and+screening+of+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays.</a> Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).</li>
<li>Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+detection+of+cancer+cells+by+utilizing+integrated+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems.</a> Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a.</a> PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+pancreatic+circulating+tumour+cells+implicates+WNT+signalling+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis.</a> Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).</li>
<li>Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%3ECapture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">>Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).</li>
<li>Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-performance+microsystem+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells.</a> Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+cell-to-cell+variation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors.</a> Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+VEGF+receptors+on+endothelial+cells+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (9), e44791(2012).</li>
<li>Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+%26%2334%3Bcritical+shear+stress+level%26%2334%3B+applied+to+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb.+Technol%22%5BJournal%5D)">Determination of a &#34;critical shear stress level&#34; applied to adherent mammalian cells.</a> Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).</li>
<li>Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+anchor+targeted+cell+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Secondary anchor targeted cell release.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).</li>
<li>Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-by-cell+profiling+reveals+temporal+dynamics+of+VEGFR1+and+VEGFR2+membrane-localization+following+murine+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Hear.+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia.</a> Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+profiling+of+VEGFRs+reveals+tumor+cell+and+endothelial+cell+heterogeneity+in+breast+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts.</a> Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).</li>
<li>BD Biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CD+Marker+Handbook%3A+Human+and+Mouse%22">CD Marker Handbook: Human and Mouse</a>. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf">https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf</a> (2010).</li>
<li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).</li>
<li>Processing Blood. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.google.com/patents/US20140030238">https://www.google.com/patents/US20140030238</a> (2014).</li>
<li>Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+attenuates+the+fluid+shear+response+of+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).</li>
<li>dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+shear-stress-induced+VEGF+expression+in+endothelial+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival.</a> J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).</li>
<li>Allard, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+Diseases+Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+diseases.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.&#34.</a> Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QFlow+Cytometer-Based+Receptoromic+Screening%3A+A+High-throughput+Quantification+Approach+Informing+Biomarker+Selection+and+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Submiss%22%5BJournal%5D)">QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor.</a> Submiss. , (2016).</li>
<li>Vasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+migratory+activity+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+inversely+correlate+with+risk+factors+for+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease.</a> Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).</li>
<li>Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Avidin-Biotin+Technology%3A+Literature+Survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey.</a> Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+labeling+of+cancer+marker+Her2+and+other+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots.</a> Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).</li>
<li>Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+quantum+dot+calibration+standards+for+quantitative+fluorescent+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).</li>
<li>Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.google.com/patents/US5512439">http://www.google.com/patents/US5512439</a> (1996).</li>
<li>Naranbhai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+blood+processing+variations+on+natural+killer+cell+frequency%2C+activation%2C+chemokine+receptor+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function.</a> J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).</li>
<li>Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+solution-phase+and+vapor-phase+deposition+of+aminosilanes+on+silicon+dioxide+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces.</a> Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Hücre izolasyonu tekniklerindeki ilerlemeler vasküler biyoloji 19 hücre yenileyici biyoloji programlama ve anjiyojenik sinyalizasyon kök, nörobilim 18 yapı-işlev ilişkilerinin bilimsel çalışmaları teşvik edilir. Gerçekten de, birincil hücre kültürü 20 (ör HUVECler) vasküler biyoloji esas olarak hücre izolasyon teknikleri kullanılarak yapılır. Hücre izolasyonu da en son plazma zarı reseptörlerinin 3,14,15,19,21 kantitatif akışı (qFlow) sitometrisi analizi için kullanıl...

Geçerli tezgah üstü hücre ayırma yaklaşımları (örneğin, floresan aktif hücre 1 sıralama, lazer yakalama mikro-diseksiyonu 2, bağışıklık manyetik boncuk ayırma 1) hazırlanması ve sıralama birkaç saat sürebilir. Bu büyük zaman ölçekleri fizyolojik tepki 3&#39;ün temsilcisi değildir analizlerde ortaya çıkan fizyolojik tepki ve ifade düzeylerini etkileyebilir. Sistem hızla ve verimli bir şekilde, biyomedikal uygulamalar için, hücre İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi geliştirmek için hücre yüzeyi reseptörü seviyeleri bozmadan özel hücre tipleri izole ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bir yaklaşım mantığı hücre izolasyonu için hafif bir yaklaşım geliştirmek için. &quot;Bir çip üzerinde laboratuvar&quot; kavramı büyüklüğü daha hızlı (saat-to-dakika) hücre izolasyonu siparişlerin söz sunar ve en sık bir yüzey üzerine hücreleri yakalama ve hücreleri veya hücre içi conte serbest içerirFiziksel 4,5&#39;ten aracılığıyla NTS veya kimyasal yöntemler 6. Bu yaklaşımlar, in vitro kültür 12,13 hücreleri sağlayarak bile RNA ifade 9-11 belirleme, protein 7,8 ifadesini tanımlayan ya da birkaç avantajı sunuyor olsa da, bu tekniklerin pek çok tür hücre reseptör profil nedeniyle olarak teşhis tercüme edilemez onların fizyolojik olmayan ortamlara. Böyle hassas fizyolojik veri oluşturmak olmaz bu kaldırma maddeleri kullanmayın hücre reseptör ölçümü teknikleri anlam ayrıca reseptör miktarları 14,15 etkileyebilir kollajcnazların gibi enzimatik kaldırma ajanlar. Hücre lizizi doğal yüzey reseptörleri arasındaki farkı önler, ve daha önce 16 içsel edilenler. Bu protokol, hücre izolasyonu için hızlı ve hassas bir yaklaşımı tarif eder.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil) trietoksisilan (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>%2 APTES çözeltisi yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici Pico</td><td>Diener</td><td>Model 1</td><td>Yüzeyleri temizler ve PDMS'nin cama bağlanmasına izin verir</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>Hücresel yakalama yüzeyinde serbest bırakma mekanizması olarak kullanılır.&nbsp;</td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>İngiliz İlaç Evleri (BDH)</td> <td>BDH1115-1LP</td><td>DSB'yi çözelti</td></tr><tr><td>1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC)</td> içinde çözer <td>Termo-Bilimsel</td><td>5g: 22980 25g: 22981</td><td>Karboksilik asitleri aktive eder ve proteinlerin cam yüzeye bağlanmasını sağlar.</td></tr><tr><td>kaplamasız 8 oyuklu kültür lamı</td><td>BD Falcon</td><td>24 vaka: 354118 96 vaka: 354108</td><td>İlk yakalama ve serbest bırakma miktar tayini deneyleri gibi Zeiss floresan mikroskobunu içeren hücresel deneylerde kullanılır</td></tr><tr><td>Cam tabanlı 24 kuyucuklu plakalar</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>Antikor ve hücresel titrasyon deneyleri gibi plaka okuyucuyu içeren hücresel deneylerde kullanılır</td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>EDC ve DSB arasındaki reaksiyonu söndürmek için kullanılır</td></tr><tr><td>4-Morfolinoetansülfonik asit hidrat (MES Hidrat %99)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>EDC reaksiyonunda kullanım için 0,1 M MES Tamponu yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Hassas Fırın Thermo</td><td>Scientific</td><td>11-475-153</td><td>PDMS ve APTES tabakasının kürlenmesinde kullanılır.</td></tr><tr><td>Titramax 1000 Shaker</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>APTES'in yüzeylerde eşit dağılımını sağlamak için kullanılır.</td></tr><tr><td>1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]</td> <td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>Biotin bağlayıcı protein. Tahrişe neden olabilir.</td></tr><tr><td>5 cm Cam Tabak</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>HUVEC çalışmalarında ve gelecekteki profil oluşturma çalışmalarında kullanılır.</td></tr><tr><td>14 cm Kapaklı Petri Kabı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>İşlevselleştirilmekte olan numuneleri tutmak ve taşımak için kullanılır.</td></tr><tr><td>MCF7-GFP hücreleri</td><td>Hücre Biyolabs</td><td>AKR211</td><td>Sıvı nitrojen</td></tr><tr><td>RAW264.7 fare makrofajlarında</td> saklanır <td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>Illinois Üniversitesi'ndeki Smith laboratuvarından bize hediye edildi. Sıvı azot içinde saklanır.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Oda sıcaklığında 100 ml içinde</td></tr><tr><td>saklanır Dulbecco' UIUC</td><td>50003PC'deki</td><td>Kimya Bilimleri Okulu'nda</td> s modifiye edilmiş Eagle medium Hücre Ortamı <td>Tesisi Tedarikçi: Corning</td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td> UIUC <td>25-025-CI'deki</td><td>Kimya Bilimleri Okulu'ndaki Hücre Ortamı Tesisi</td><td>Tesis tarafından DMEM'e zaten eklenmiştir. Tedarikçi: Corning.</td></tr><tr><td>Hücre kazıyıcı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>Küçük 23 cm 50 paket</td></tr><tr><td>Hücre Ayrışma Çözeltisi</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>Hücre deneylerinde kullanım için hücreleri enzimatik olmayan bir şekilde kaldırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Hemasitometre</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>Hücre çözeltilerinin nicelleştirilmesi için hücreleri saymak ve etkinliği yakalamak ve serbest bırakmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>Hücreleri yüzeyden serbest bırakmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Reçeteden Oluşturuldu</td><td>N/A</td><td>Hücreleri süspansiyonda canlı tutmak ve spesifik olmayan bağlayıcı yüzeyleri yıkamak için kullanılır. Cold Spring Harbor Protokollerinden Uyarlanmıştır: 500&nbsp; ml, 4&nbsp kullanın; g NaCl, 0.2&nbsp; g KCl, 0.0402&nbsp; g Na2PO4&#8226; 7H<alt>2</alt>O, 0.03&nbsp; g KH<alt>2</alt>PO<alt>4</alt> ve 0.5&nbsp; g glikoz. Elde etmek için DI suyu ekleyin&nbsp; 500 ml, süzün ve ardından soğutun.</td></tr><tr><td>HLA-ABC Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>MCF7gfp hücrelerini yakalamak için kullanılan antikor</td>,</tr><tr><td>hIgG Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>MCF7gfp hücrelerini yakalamak için kullanılan antikor</td></tr>, <tr><td>MCF7 GFP hücreleri Cell</td><td>Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>Luminal Meme Kanseri yeşil floresan proteini ile transfekte edilmiş seri.</td></tr><tr><td>Çeşitli Konikler</td><td>Termo-Bilimsel</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>Çözeltileri ve alikotları saklamak için 50/15 ml plastik konikler.</td></tr><tr><td>Mini Tüp Döndürücüler (Uçtan Uca Karıştırıcı)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td> Axiovert 200M (Floresan Mikroskobu) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M ters floresan mikroskobunu <td>karıştırmak için antikoru inkübe etmek ve diğer hücresel çözeltileri karıştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>.</td></tr><tr><td>Zeba Tuz Giderme sütunları</td><td>Termo-Bilimsel</td><td>PI-87770</td><td>Biyotinilasyon Kitinin kullanımından sonra yeni biyotinile edilmiş antikorları saflaştırmak için kullanılır. Şu adreste verilen talimatlar: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Düşük Ağırlıklı Biyotinilasyon Kiti</td><td>Termo-Bilimsel</td><td></td><td>Antikorları yakalama yüzeyi ile bütünleşmelerini sağlamak için biyotinillemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Plaka Okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX Çok Modlu Okuyucu</td><td>Titrasyon deneylerinde floresan yoğunluğunu kantitatif olarak ölçmek için kullanılır.</td></tr></tbody></table>

cam yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla hedefli hücre İzolasyonu bir yöntem

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Kişiselleştirilmiş tıbbın benimsenmesi ve ilerlemesinin önündeki sınırlayıcı faktörlerden biri, hastadan hastaya ifadedeki bireysel nüansları araştırmak için tanı araçları geliştirememektir. Bu boşluğu doldurmak için hücreleri ayırmaya çalışan mevcut metodolojiler, fizyolojik ifadenin bozulmasına neden olarak ayırma tekniğini bir teşhis aracı olarak işe yaramaz hale getirir. Bu protokolde, hücresel yakalama ve serbest bırakma için bir yüzeyin işlevselleştirilmesini ve optimizasyonunu açıklıyoruz. Bu işlevselleştirilmiş yüzey, biyotinile antikorları bir aminosilan (APTES), destibiotin ve streptavidin ile işlevselleştirilmiş bir cam yüzeyle bütünleştirir. Hücre salınımı, yüzey tarafından yakalanan hücrelerin geri çağrılmasına ve saflaştırılmasına izin veren biyotinin eklenmesiyle kolaylaştırılır. Bu salım, çok daha yumuşak bir salım paradigması ile sonuçlanan ikincil kısım desthiobiotin'in hedeflenmesi yoluyla yapılır. Sert reaktiflerdeki ve kesme kuvvetlerindeki bu azalma, hücresel ifadedeki değişiklikleri azaltır. İşlevselleştirilmiş yüzey, tek hücreli bir karışımda hücrelerin %80'ine kadarını yakalar ve çift hücreli bir karışımda %50'ye kadar yakalama göstermiştir. Bu teknolojinin ksenogreftlere uygulamaları ve kanser ayırma çalışmaları araştırılmaktadır. Plaka okuyucu ve ImageJ analizleri gibi yüzey doğrulama için miktar belirleme teknikleri de açıklanmaktadır.

Bu hücre yakalama (Şekil 3A) ve MCF7GFP hücrelerinin hücre serbest bırakın (Şekil 3C) ve canlı hücre kontrolleri (Şekil 4) göstermektedir, bu protokolü kullanarak. % 60 ve% 80 (Şekil 3C) serbest bırakıldı gibi hücre yakalama sayılabilir. Bu RAW 264.7 makrofajlar ve MCF7GFP hücre karışımına Bu yaklaşımını sonra ham makrofajlar% 50 yakalanmış (Şek. 3D) ve RAW makrofajlar% 80 20 mM biyotin (Şekil 3B...

Bu protokol, ilgilenilen belirli hücre tiplerini izole etmek için desthiobiotin, streptavidin ve APTES sisteminin özelleştirilebilir yüzey işlevselleştirmesini tanımlar. Ek olarak, bu makale bu sürecin uygulamalarını, optimizasyonunu ve doğrulanmasını kapsar.

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Bu cam yüzey fonksiyonelleştirme sürecinin genel amacı, ilgilenilen hücrelerin nazikçe yakalanmasını ve serbest bırakılmasını sağlamaktır. Bu yöntem, ilaç direncini gösteren hücre biyobelirteçlerinin taranmasına olanak tanıyarak tümör anjiyogenezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, neredeyse her türlü ilgili hücre tipi için tamamen özelleştirilebilir olmasıdır.Hücre tipine özgü bir antikor olduğu sürece, yüzey bu hücrenin yakalanması için adapte edilebilir. Bu yöntem kanser anjiyogenezi hakkında bilgi sağlayabilse de, daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimlerinin geliştirilmesi için saflaştırılmış örnekler gerektiğinden, diğer hastalıklara da uygulanabilir. Bu yönteme dair ilk fikrimiz, desthiobiotin ile adivin ailesi arasındaki etkileşimi kullanarak hücreleri yakalamak için tersine çevrilebilir bir salım mekanizması geliştirmeye çalıştığımızda ortaya çıktı.Metin protokolüne uygun olarak bir cam yüzey oksijen plazma makinesinde beş dakika boyunca temizlendikten sonra, konik bir tüpte 50 µL APTES ve 2,45 mL etanolü birleştirerek 2,5 mL %2 rekonstitüe 3-Aminopropil trietoksisilan veya APTES çözeltisi hazırlayın. APTES çözeltisini cam yüzeylerin üzerine pipetleyin, ardından yüzeyleri kapatın ve APTES tabakasının eşit şekilde dağılması için oda sıcaklığında, platform sarsıcısında 50 dakika boyunca bekletin. Bu sırada fırını, sekizli ve 24'lü plakalar için 55 °C'ye veya cam kaplar için 90 °C'ye önceden ısıtın.Plakaları çalkalayıcıdan çıkardıktan sonra, metin protokolüne uygun olarak cam yüzeyleri durulamak için etanol kullanın. Yüzeyleri %100 azot gazı ile kurutun. Ardından, sekiz ve 24 kuyucuklu plakaları iki saat boyunca veya cam kapları bir saat boyunca fırında bekletin.Ardından, 37,5 µL DMSO içinde 1,5 mg/mL DSB'yi karıştırarak ve 2.462,5 µL 0,1 M MES tamponuna (pH 6) 5 mg/mL EDC ekleyerek 2,5 mililitre d-Desthiobiotin veya DSB çözeltisi hazırlayın. Daha sonra iki çözeltiyi birleştirin. 15 dakika sonra, DSB ve EDC arasındaki reaksiyonu durdurmak için bir µL BME ekleyin.Sıcak APTES fonksiyonelleştirilmiş cam yüzeyleri fırından çıkarın ve beş ila 10 dakika boyunca soğumaya bırakın. Pipeti, ucu doğrudan yüzeye bakmayacak şekilde 70 derecelik bir açıyla tutarak cam yüzeyleri durulamak için MES tamponu ekleyin. Ardından, tamponu kuyucuğun köşesi gibi sabit bir noktadan boşaltın ve geri çekin.Ardından, iki kez daha durulamak için MES tamponu kullanın. Cam yüzeylere DSB çözeltisi uygulayın. Bunları bir Petri kabı içindeki nemli bir kağıt havluya aktarın, kabın kapağını kapatın ve buzdolabında 18 ila 24 saat inkübe edin.Dört santigrat derece sıcaklıktaki inkübasyonun ardından, bu videonun başında gösterildiği gibi her bir cam yüzeyi üç kez PBS ile yıkayın. Ardından, Streptavidin veya SAV stok çözeltisini 0,4 miligram/mililitre olacak şekilde seyreltin ve ince bir tabaka oluşacak şekilde cam yüzeylere eşit olarak uygulayın. Camları 18 ila 24 saat inkübe ettikten sonra, her bir yüzeyi üç kez 150 mikrolitre PBS kullanarak yıkayın.Ardından, deiyonize su ile bir kağıt havluyu ıslatın ve kuyucuklardaki nemi korumak için plakları çevreleyecek şekilde 14 santimetrelik bir Petri kabına düz bir biçimde yerleştirin. Petri kabını cam yüzeylerle kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar dört derece santigrat sıcaklıktaki Biyogüvenlik Seviye 1 buzdolabına yerleştirin. Hücre yakalama işlemini gerçekleştirmek için, T175 hücre flasklarındaki besiyerini aspire edin.Ardından hücreleri durulamak için PBS kullanın ve tamponu aspire edin. Flask içerisine, Cell Dissociation Solution gibi 10 ml enzim içermeyen hücre ayırma ajanı ekleyin. Daha sonra 37 °C'de altı dakika boyunca inkübe edin.Altı dakika sonra, kaldırma ajanını seyreltmek için 10 milliliters soğuk HBSS ekleyin. Ardından, hücrelerden 20 microliters pipetleyin ve onları saymak için bir hemositometre kullanın. Hücre süspansiyonunu 4 °C'de, 500 x g'de, beş dakika boyunca santrifüjleyin.Hücreleri ml başına 1x10⁶ hücre olacak şekilde yeniden süspande etmek için HBSS kullanın. Hücreleri çözelti içinde yeniden süspande etmek ve antikor bağlanmasını azaltabilecek hücresel kümelenmeyi önlemek için pipetle yukarı-aşağı karıştırın. Ardından, hücre süspansiyonunu ayrı kontrol ve deney çözeltilerine bölün.Biyotinize antikorları ilgili hücre çözeltilerine ekleyin ve 4 °C'de, bir end-over-end karıştırıcıda 30 dakika boyunca inkübe edin. Videonun önceki bölümlerinde gösterildiği gibi, sekiz kuyucuklu plakalardaki fonksiyonelleştirilmiş camları yıkamak için üç kez 150 µL HBSS kullanın. Hücre çözeltisini kuyucuklara ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde, buz üzerinde 45 dakika boyunca inkübe edin.Bu sırada, steril HBSS içerisinde 20 millimolar biotin çözeltisi hazırlayın. Ardından, inkübasyon sonrası, hücre çözeltisini camdan durulamak için nazikçe 150 microliters HBSS kullanın. Durulama işlemini iki kez daha tekrarladıktan sonra, her bir ilgili salım kuyucuğuna 150 microliters biotin çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun gerçekleşmesi için 20 dakika boyunca inkübe edin.Hücreleri yıkamak için HBSS kullanarak spesifik olmayan şekilde bağlanmış hücreleri toplayın. Ardından, metin protokolüne uygun olarak floresan görüntüleme ve analiz işlemlerine geçin. Kontrol olarak bir flask içindeki canlı hücrelerin görüntülerini ekleyin.Bu deneyde, MCF7GFP hücreleri fonksiyonelleştirilmiş yüzeye maruz bırakılmıştır. Hücrelerin %60'ı HLA-ABC antikoru kullanılarak yakalanmıştır. 20 millimolar biyotine maruz kalındığında, yakalanan hücrelerin %80'i serbest kalmıştır.Burada gösterildiği üzere, MCF7GFP hücreleri RAW 264.7 hücreleri ile karıştırıldığında, RAW makrofajlarının %50'si yakalanmış ve ardından 20 µM biyotin eklenmesi, yakalanan RAW hücrelerinin %80'ini serbest bırakmıştır. Bu şekil, pozitif kontrol RAW makrofajlarının floresan aktivite göstermediğini kanıtlamaktadır. Buna karşın, negatif kontrol MCF7GFP hücreleri GFP floresansı açısından pozitiftir.Fazla antikor hücre yakalamayı azaltabileceği için, antikor konsantrasyonu sıfırdan 10.000 ng/mL HLA antikoruyla titrasyon yapılarak optimize edildi. Sonuçlar, ideal antikor konsantrasyonunun 100 ve 1.000 ng/mL arasında olduğunu gösterdi. Ayrıca, hücre optimizasyon deneyleri, bu rakamın altındaki miktarlar arka plan seviyesinden düşük olduğu için yakalanabilecek ideal hücre konsantrasyonunun 1 × 10⁵ ve 1 × 10⁶ hücre arasında olduğunu belirledi.Bu teknik bir kez kavrandığında, gece boyu süren inkübasyonlar hariç olmak üzere, altı saatten daha kısa bir deneysel süreyle üç günde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, yüzeyin etkinliği hakkında hayati bilgiler verebileceği için deneyler sırasında hücre yıkama sıvılarını toplamanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, ilgilenilen hücrelerin hangi reseptör ekspresyon seviyelerine sahip olabileceği gibi ek soruları yanıtlamak için akış sitometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Yüzey fonksiyonelleştirme, geliştirilmesinin ardından, biyomalzemeler alanındaki araştırmacıların, çeşitli hastalıklar ve yaralanmalar için hastalara uygulanan implantlar gibi materyallerin biyogüvenli entegrasyonunu keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, alt analizlere imkan tanımak amacıyla, ilgilenilen hücreleri yakalamak ve salmak için cam yüzeylerin nasıl yüzey fonksiyonelleştirileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Sodyum azide içeren canlı hücrelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun eğitim, KKD ve bertaraf gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

a-method-targeted-cell-isolation-via-glass-surface

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Kaynak: Fattahi, N., vd. Bakteri taraması, seçimi ve izolasyonu için ışıkla parçalanabilen hidrojel arayüzleri. J. Vis. Uzm. (2021).Bu video, UV ışığı kullanılarak ışıkla parçalanabilen bir hidrojelden bakteri kolonilerinin ekstraksiyonunu göstermektedir. Belirli bir koloni seçilir ve lokalize hidrojel bozunmasını başlatmak için desenli bir ışığa maruz kalma tasarlanır. Işık yoğunluğunu ve süresini ayarladıktan sonra UV ışığı uygulanarak koloni serbest bırakılır. Koloni daha sonra borulardan...

Işık desenli hidrojel bozunması kullanılarak hedeflenen bakteri kolonisi izolasyonu

Bu videoda, periferik kan örneklerinden EpCAM eksprese eden epitel kanseri hücrelerinin izolasyonunu gösteriyoruz. Teknik, hedef hücreleri yakalamak için EpCAM antikorları ile işlevselleştirilmiş tıbbi sınıf bir telin kullanılmasını içerir. Yakalanan hücreler daha sonra bir tampon çözeltiye ekstrakte edilir.

İşlevselleştirilmiş Tel Tabanlı Hedef Hücre İzolasyonu: Kanser Hücrelerini Çivili Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Ex Vivo Teknik

Temassız dielektroforez (cDEP) kendi içsel dielektrik özellikleri aracılığıyla sıralama ve parçacıkların zenginleştirme ulaşır. Fluidic elektrot kanallar steril karakterizasyonu olmayan zarar ve biyolojik parçacıkların sıralamaya cDEP takım elbise kumaşı, DEP geleneksel metalik elektrotlar değiştirin. Biz bir cDEP mikrocihazda hazırlamak ve hücre karakterizasyonu ve sıralama deneyler nasıl gösterilmektedir.

Temassız dielektroforez sayesinde etiket ücretsiz İzolasyon ve Hücreler zenginleştirilmesi

Floresan probları içeren poliakrilamid (PA) jelleri imal edilmesi için geleneksel teknikler yapışkan bir yüzeyi ve bir cam kayar arasında sandviç tarzı bir jel barındırır. Burada, poli-D-lisin (PDL) ve fluoresan problar, bu slayt kaplama jel yüzeyinden 1.6 um olan probları lokalize olduğunu göstermektedir.

Çekme Kuvveti Mikroskopi Hücre Kültürü Yüzey civarında yerelleştirme raportör flöresan Beads için Yeni Bir Yöntem

Burada, yüksek verimli tek hücre izolasyonu ve uzun süreli klonal kültüre izin vermek için yeni bir mikro kuyu tasarım konseptini kullanan mikroakışkan bir platformla tek hücreleri izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Yeniden elde etmek ve moleküler genetik karakterizasyon tek hücre düzeyinde bir karışımı nadir Hedef hücrelerden olmayan hedef arka plan hücrelerle hazırlamak protokolüdür. DNA kalitesi olmayan tedavi tek hücrelere eşittir ve (her iki tarama tabanlı ve analiz hedefli) tek hücreli uygulama için sağlar.

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Biz bir basit tekniğinde gen uzunluğunda DNA moleküllerinin immobilizasyon için boş hücre gen ifade deneyler biochips üzerinde gerçekleştirmek için kullanılan bir yüzey üzerinde açıklayınız.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Yüksek çözünürlüklü bir ışık sıvazlama aracı kullanarak bakteri hücrelerini izole etmek için fotobozunur hidrojellerin kullanıldığı bildirilmektedir. Sürecin temel deneysel prosedürleri, sonuçları ve avantajları gözden geçirilmiştir. Yöntem, heterojen topluluklardan veya popülasyonlardan nadir veya benzersiz işlevler gösteren hedeflenen bakterilerin hızlı ve ucuz izolasyon edilmesini sağlar.

Bakteri Taraması, Seçimi ve İzolasyonu için Fotobozunur Hidrojel Arayüzleri

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Öğrenin cam yüzey fonksiyonlandırma yöntemiyle hedefli hücre izolasyonunu. Bu teknik, tümör anjiyogenezisi ve ilaç direnci biyobelirteçlerinin incelenmesine olanak tanır. Kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için uygulanabilir.

Cam Yüzey fonksiyonlandırmalar aracılığıyla Hedefli Hücre İzolasyonu Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet