Name: Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Keşfedin kornea endotel-mezenkimal geçiş mekanizmalarını in vitro ve in vivo modeller kullanarak. Sığır kornea endotel hücreleri ve sıçan kriyoinjuri modeliyle rejeneratif tıp alanında tedavi stratejileri geliştirmeye yönelik içgörüler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi Tıbbi Araştırma Bölümü, İkinci Çekirdek Laboratuvarı personeline teknik destekleri için teşekkür ederiz.

Tüm işlemler Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım Vizyon ve Oftalmoloji Tablosunda Araştırma Derneği ile tanınan bu çalışmada izlenen ve Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1. İzolasyon, İlköğretim Kültür Hazırlama ve Bovine CDKÖ immün <ol><li> Yerel bir mezbahaya taze sığır gözleri kazanır. </li><li> 3 dakika boyunca% 10 w / v povidon-iyot çözeltisi gözleri dezenfekte. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi ile yıkanır. </li><li> steril koşullar altında bir neşter ve makas ile kornea düğmeye hasat. bir mikroskop altında forseps ile Peel Descemet membranı (bu çalışmada unutmayın, sığır gözler yerel bir mezbahaya tarafından iki parçaya ayrıldı, bu nedenle ilk çalışma prosedürü laboratuvarda preenucleated gözlerinin dezenfeksiyon idi). </li><li> try 1 ml Descemet membran inkübe30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de psin. 5 dakika boyunca 112 x g&#39;de santrifüj ile sığır CDKÖ toplayın. takviye hormon epitel ortam (SHEM) HEPES-tamponlu Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı ve% 5 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Ham F12 ortamında,% 0.5 dimetil sülfoksit, insan epidermal 2 ng / ml arasında eşit hacimlerde ihtiva eden 1 ml hücrelerin tekrar büyüme faktörü, 5 mg / ml arasında insülin, 5 mg / transferin ml, 5 ng / selenyum mi, kolera toksin 1 nmol / L, 50 mg / ml gentamisin ve 1.25 mg / amfoterisin B mi </li><li> 6 cm çanak içine hücreleri (gözün başına yaklaşık 1 x 10 5 hücre) Tohum. Sam&#39;ın Kültür onları. Hava içinde% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C &#39;de çanak inkübe edin. 3 günde kültür ortamı değiştirin. </li><li> Hücreler kaynaşmaya eriştikten sonra, PBS ile yıkayın ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tripsin 1 ml inkübe. 5 dakika boyunca 112 x g&#39;de santrifüj ile toplayın. Sam&#39;ın 1 ml hücre pelletini yeniden askıya. <ol&gt; <li> Bir hemasitometre hücreleri saymak. Bir 24-yuvalı plaka içinde çukur başına 1 x 10 4 yoğunluğuna ve kültür Sam hücreleri de kapaklı lam üzerinde hücreleri tohumu. marimastat arasında EnMT bastırıcı etkilerini araştırmak için, marimastat uM kültür ortamına ilave 10 Sam hücreleri inkübe ve her 3 günde bir kültür ortamı değiştirin. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile,% 4 paraformaldehit 250 ul, pH 7.4 ile belirtilen bir zaman noktasında hücreleri saptamak. 5 dakika için% 0.5 Triton X-100, 250 ul geçirgenliği. 30 dakika boyunca% 10 inek serumu albümini ile bloklayın. </li><li> gece boyunca 4 ° C &#39;de, aktif beta-katenin (ABC), salyangoz ve sevk borusu karşı birincil antikor ile inkübe hücreleri. 200: kullanılan birincil antikor seyreltme 1&#39;dir. antikorlar, 10 mM PBS,% 1 w / v sığır serum albümini ve% 0.09 w / v sodyum asid oluşan antikor seyreltici içinde seyreltilir. </li><li> 15 dakika boyunca PBS ile iki kez hücreleri yıkanır ve inkübe1 saat süre ile oda sıcaklığında (antikor seyreltici içinde 1: 100) ve Alexa Fluor-konjuge sekonder antikor ile m. </li><li> 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol 2 ug / ml hücreleri kapsayan, hücre çekirdeğine Counterstain, 15 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri ve montaj çözümü, anti-solma ile monte edilir. </li><li> 20X objektif büyütme ile bir lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak 405 ve 488 nm uyarma dalga boylarında immunofluorescent görüntüleri elde edebilir. </li></ol> 2. Sıçan Kornea Endotel Cryoinjury Modeli ve İntrakameral Enjeksiyon <ol><li> % 2 ksilazin (5.6 mg / kg) ve tiletamin artı zolazepam (/ kg 18 mg) kas içine enjeksiyonu ile 12 haftalık erkek Sprague-Davvley sıçanları anestezisi. Yavaşça cilt seğirmesi yokluğunda uygun anestezi onaylamak için hayvanların derisini çimdik. </li><li> Göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için her sıçanın sağ gözüne% 0.5 proparacaine hidroklorür bir damla aşılamak. Aşılamaksol göze tetrasiklin merhem kornea kuruluğunu önlemek için. </li><li> sıvı nitrojen içinde paslanmaz çelikten bir prob (çap = 3 mm) soğutun. 30 sn sağ gözünün kornea santralinde paslanmaz çelik prob uygulayın. Sıkça kornea kuruluğunu önlemek için işlem sırasında sağ gözüne PBS aşılamak. </li><li> hemen cryoinjury sonra% 0.1 atropin ve% 0.3 gentamisin sülfat aşılamak ve günde bir kez siliyer spazm kaynaklanan göz ağrısı rahatlatmak için ve enfeksiyonu önlemek için. <ol><li> İşlemden sonra, sıçanlar bir ısı lambası kullanarak sıcak tutmak ve onlar motor kontrolünü yeniden kadar anestezi sonrası kendi iyileşme her 15 dakika gözlemleyin. Ayrıca, iyileşme döneminde kornea kuruluğunu önlemek için sağ gözüne tetrasiklin merhem uygulayın. </li></ol></li><li> 3 gün üst üste kornea cryoinjury tekrarlayın. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi sıçan gözlerin ön odasına marimastat veya bFGF verilmesi için, fareler uyutmak. bir damla aşılamaksağ göz içine% 0.5 proparacaine hidroklorür göz ağrısı ve göz kırpma refleksi en aza indirmek için. </li><li> steril PBS ile göz yüzeyi yıkayın. iris yukarıda ve paralel bir düzlemde paralimbal açık bir korneadaki bir 1 ml şırınga bağlanmış bir 30 G iğne sokarak bir ameliyat mikroskobu altında Ön bölme parasentezi gerçekleştirmek. </li><li> İğne yukarı konik çevirin ve hafif bazı sulu mizah drenaj ve göz içi basıncını düşürmek için kornea yara bastırın. intrakameral ilacın 0.02 ml enjekte edilir. Yavaşça iğne çekilmesi sırasında pamuk uçlu iğne yolu sıkıştırmak. </li><li> ameliyat mikroskobu altında belirtilen zaman noktasında dış göz fotoğraf. </li></ol> 3. Hasat Sıçan Kornea Düğme ve immün <ol><li> Fareleri euthanize için, ötenazi odasına koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO 2 demlenmeye. Bir CO 2 infüzyon korumaksolunum yetersizliği ve soluk göz rengi sonra ek dakika. </li><li> keskin bir bıçak ile limbusta sıçan göz nüfuz eder. limbusta boyunca kornea makasla korneaları kesin. bir slayt korneaları dümdüz. korneaları kıvrılıp, ek radyal kesiler olun. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile,% 4 paraformaldehit 250 ul, pH 7.4 ile kornealar düzeltildi. 5 dakika için% 0.5 Triton X-100, 250 ul geçirgenliği, ve 30 dakika boyunca,% 10 büyükbaş hayvan serum albümini ile bloke eder. </li><li> 1 oranında sulandırılmış bir gece boyunca 4 ° C &#39;de ABC karşı birincil antikor ile kornealar inkübe: 200 antikoru seyreltici içinde. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez kornealar yıkayın ve ikincil antikor ile inkübe: 1 saat süre ile oda sıcaklığında (1 antikoru seyreltici içinde, 100). Hücre 2 ug 4 / ml &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol ile hücrelerin kaplayarak nükleus ve 15 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkama hücreleri Counterstain. </li><li> montaj çözümü, anti-solmaya korneaları monte edin. ob20X objektif büyütme bir lazer tarama konfokal mikroskop ile immunofluorescent 405 uyarma dalga boylarındaki görüntüleri ve 561 nm tain. </li></ol>

<ol><li>Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+the+fluid+pump+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The location of the fluid pump in the cornea.</a> J Physiol. 221 (1), 43-54 (1972).</li>
<li>Joyce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+capacity+of+the+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Proliferative capacity of the corneal endothelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (3), 359-389 (2003).</li>
<li>Morishige, N., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bullous+keratopathy+as+a+progressive+disease%3A+evidence+from+clinical+and+laboratory+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Bullous keratopathy as a progressive disease: evidence from clinical and laboratory imaging studies.</a> Cornea. 32, Suppl 1 77-83 (2013).</li>
<li>Bates, A. K., Cheng, H., Hiorns, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudophakic+bullous+keratopathy%3A+relationship+with+endothelial+cell+density+and+use+of+a+predictive+cell+loss+model.+A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Pseudophakic bullous keratopathy: relationship with endothelial cell density and use of a predictive cell loss model. A preliminary report.</a> Curr Eye Res. 5 (5), 363-366 (1986).</li>
<li>Wilson, S. E., Lloyd, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+its+receptor%2C+basic+fibroblast+growth+factor%2C+transforming+growth+factor+beta-1%2C+and+interleukin-1+alpha+messenger+RNA+production+in+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and its receptor, basic fibroblast growth factor, transforming growth factor beta-1, and interleukin-1 alpha messenger RNA production in human corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 32 (10), 2747-2756 (1991).</li>
<li>Chen, K. H., Harris, D. L., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta2+in+aqueous+humor+suppresses+S-phase+entry+in+cultured+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">TGF-beta2 in aqueous humor suppresses S-phase entry in cultured corneal endothelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40 (11), 2513-2519 (1999).</li>
<li>Senoo, T., Obara, Y., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA%3A+a+promoter+of+proliferation+in+human+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">EDTA: a promoter of proliferation in human corneal endothelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (10), 2930-2935 (2000).</li>
<li>Yue, B. Y., Sugar, J., Gilboy, J. E., Elvart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+corneal+endothelial+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth of human corneal endothelial cells in culture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (2), 248-253 (1989).</li>
<li>Peh, G. S., Beuerman, R. W., Colman, A., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+endothelial+cell+expansion+for+corneal+endothelium+transplantation%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview.</a> Transplantation. 91 (8), 811-819 (2011).</li>
<li>Zhu, C., Rawe, I., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+expression+in+human+corneal+endothelial+cells+cultured+from+young+and+older+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Differential protein expression in human corneal endothelial cells cultured from young and older donors.</a> Mol Vis. 14, 1805-1814 (2008).</li>
<li>Ko, M. K., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+FGF-2+on+type+I+collagen+expression+during+endothelial+mesenchymal+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4495-4503 (2005).</li>
<li>Lee, H. T., Kay, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-2+induced+reorganization+and+disruption+of+actin+cytoskeleton+through+PI+3-kinase%2C+Rho%2C+and+Cdc42+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">FGF-2 induced reorganization and disruption of actin cytoskeleton through PI 3-kinase, Rho, and Cdc42 in corneal endothelial cells.</a> Mol Vis. 9, 624-634 (2003).</li>
<li>Pipparelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+Inhibitor+Enhances+Adhesion+and+Wound+Healing+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">ROCK Inhibitor Enhances Adhesion and Wound Healing of Human Corneal Endothelial Cells.</a> PloS one. 8 (4), e62095(2013).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Theriault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li>
<li>Jakobiec, F. A., Bhat, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrocorneal+membranes%3A+a+comparative+immunohistochemical+analysis+of+keratocytic%2C+endothelial%2C+and+epithelial+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Retrocorneal membranes: a comparative immunohistochemical analysis of keratocytic, endothelial, and epithelial origins.</a> Am J Ophthalmol. 150 (2), 230-242 (2010).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ZEB1+and+Snail1+in+excessive+production+of+extracellular+matrix+in+Fuchs+endothelial+corneal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Involvement of ZEB1 and Snail1 in excessive production of extracellular matrix in Fuchs endothelial corneal dystrophy.</a> Lab Invest. 95 (11), 1291-1304 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+on+primate+corneal+endothelial+cell+survival+in+vitro+by+a+ROCK+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3680-3687 (2009).</li>
<li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li>
<li>Ho, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Matrix+Metalloproteinase+Activity+Reverses+Corneal+Endothelial-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Matrix Metalloproteinase Activity Reverses Corneal Endothelial-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 185 (8), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Kay, E. D., Cheung, C. C., Jester, J. V., Nimni, M. E., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen+and+fibronectin+synthesis+by+retrocorneal+fibrous+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Type I collagen and fibronectin synthesis by retrocorneal fibrous membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 22 (2), 200-212 (1982).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signal+Regulates+Corneal+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Notch Signal Regulates Corneal Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Am J Pathol. 183 (3), 786-795 (2013).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ROCK+Inhibitor+Eye+Drop+Accelerates+Corneal+Endothelium+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The ROCK Inhibitor Eye Drop Accelerates Corneal Endothelium Wound Healing.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 2493-2502 (2013).</li>
<li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier%3A+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir rakip mali çıkarları yoktur.

CESler hücre proliferasyonu sırasında EnMT geçmesi için kendi eğilimi bilinmektedir. Tedavi amaçlı EnMT sürecini bastırmak için stratejiler geliştirmek, EnMT mekanizmasının tam bir anlayış gereklidir. Biz EnMT, in vitro kültür modeli ve sıçan kornea endotel cryoinjury modelinde yani sığır CEC araştırmak için 2 modeller nitelendirdi. Bizim sonuçları Her iki modelde de EnMT süreci göstermiştir. Ayrıca, marimastat ve EnMT baskılayıcı etkisi bu 2 model aynı mekanizmayı paylaşan düşündüren, her iki modelde ...

Kornea endotel hücreleri (CEC'ler), aktif pompalama yoluyla kornea stromasının hidrasyon durumunu düzenleyerek kornea berraklığının ve dolayısıyla görme keskinliğinin korunmasında hayati bir rol oynar1. İnsan CEC'lerinin sınırlı proliferatif potansiyeli nedeniyle, hücre sayısı yaşla birlikte azalır ve yaralanma sonrası kornea endotel yaralarının onarımı genellikle hücre mitozu yerine hücre büyümesi ve göçü yoluyla sağlanır2. CEC sayısı yaklaşık 500 hücre /mm2'lik bir eşiğin altına düştüğünde, kornea stromasının dehidrasyon durumu korunamaz, bu da büllöz keratopatiye ve görme bozukluğunayol açar 3,4.
İnsan CEC'lerinin sınırlı proliferatif potansiyeli, yaşlanan hücrelerde5 epidermal büyüme faktörünün ve reseptörünün ekspresyonunun azalması, sulu mizahta antiproliferatif TGFβ2 ve temas inhibisyonu2,7 dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlanmıştır. Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) gibi bazı büyüme faktörleri, kültürlenmiş bir insan kornea endotelinde proliferasyonu artırabilse de, kültür etkinliği sınırlı kalmaktadır8,9. Ayrıca, CEC'ler ex vivo genişleme sırasında epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) benzeyen fenotipik bir değişikliğe uğrayabilir10-13. Endotelyal-mezenkimal geçiş (EnMT), hücre bileşke destabilizasyonu, apikal-bazal polarite kaybı, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi, alfa düz kas aktin ekspresyonu ve tip I kollajen sekresyonu ile karakterizedir14. Bu özelliklerin tümü, CEC'lerin normal işlevini iptal edebilir ve ex vivo kültürlenmiş CEC'lerin doku mühendisliğinde kullanımını engelleyebilir. Ayrıca, EnMT, Fuchs endotelyal kornea distrofisi ve retrokornea membran oluşumu dahil olmak üzere çeşitli kornea endotel hastalıklarının patogenezi ile ilişkilendirilmiştir15,16. Bu nedenle, EnMT mekanizmasının anlaşılması, EnMT sürecinin manipüle edilmesine yardımcı olabilir ve yetkin işlevi sağlamak için CEC'lerin yenilenmesini kolaylaştırabilir. 
Bu çalışmada, sığır CEC'lerini kornea deliğinden izole etmek için bir yöntem tanımladık. Birincil kültürde in vitro fenotipik bir değişiklik, β-kateninin nükleer translokasyonu ve EMT düzenleyicileri salyangoz ve sümüklü böcek dahil olmak üzere EnMT süreci gözlendi. Ayrıca, bir sıçan kornea endotel kriyoyaralanma modeli kullanarak EnMT'yi in vivo göstermek için bir yöntem tanımladık. Bu 2 modeli kullanarak, geniş spektrumlu bir matris metalloproteinaz (MMP) inhibitörü olan marimastatın EnMT sürecini baskılayabildiğini gösterdik. Açıklanan protokoller, EnMT mekanizmasının ayrıntılı analizini ve daha ileri klinik uygulama için EnMT sürecini manipüle etmek için stratejilerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

<table><tbody><tr><td>tripsin</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı ve Ham'ın F12 ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>dimetil sülfoksit</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>insan epidermal büyüme faktörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>insülin, transferrin, selenyum ve nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>kolera toksini</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>gentamisin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>amfoterisin B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehit</td><td>elektron mikroskobu bilimleri</td><td>111219</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>marimastat</td><td>Sigma</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-aktif beta-katenin antikoru</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>anti-salyangoz antikoru</td><td>Santa cruz</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>anti-sümüklü böcek antikoru</td><td>Santa cruz</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-fare IgG (H + L) ikincil antikor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td>, <td>sığır CEC'lerinin ABC'sinin boyanması için,</td></tr><tr><td>keçi anti-fare IgG (H + L) ikincil antikoru</td>, <td>sıçan kornea endotelinin ABC'sinin boyanması için</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td></tr>, keçi <tr><td>anti-tavşan IgG (H + L) ikincil antikoru</td>, <td>salyangoz ve sümüklü böcek CEC'lerinin boyanması için</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td>, antikor</tr><tr><td>seyreltici</td><td>Genemed Biyoteknoloji</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-diamidino-2-fenilindol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>montaj ortamı</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>ksilazin ve nbsp;</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>tiletamin artı zolazepam</td><td>Virbac</td><td>N/A</td><td>veteriner ilacı</td></tr><tr><td>proparakain hidroklorür oftalmik çözelti</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>veteriner ilacı</td></tr><tr><td>%0.1 atropin</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>klinik ilaç&nbsp;</td></tr><tr><td>% 0.3 gentamisin sülfat</td><td>Sinphar Grubu</td><td>N / A</td><td>klinik ilaç&nbsp;</td></tr><tr><td>temel fibroblast büyüme faktörü</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>klinik ilaç&nbsp;</td></tr></tbody></table>

vitro ve in vivo modelleri kornea endotel-mezenkimal geçiş Çalışması için

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Kornea endotel hücreleri (CEC'ler), aktif pompalama yoluyla kornea berraklığının korunmasında çok önemli bir rol oynar. Azalmış bir CEC sayısı kornea ödemine ve azalmış görme keskinliğine neden olabilir. Bununla birlikte, insan CEC'leri, tehlikeye atılmış proliferatif potansiyele eğilimlidir. Ayrıca, hücre büyümesinin uyarılması genellikle kademeli endotelyal-mezenkimal geçiş (EnMT) ile karmaşıklaşır. Bu nedenle, yetkin işleve sahip CEC'lerin yenilenmesini kolaylaştırmak için EnMT mekanizmasını anlamak gereklidir. Bu çalışmada, kornea deliğinden Descemet membranı ile CEC'leri soyarak sığır CEC'lerinin birincil kültürünü hazırladık ve sığır CEC'lerinin fenotipik değişim, β-kateninin nükleer translokasyonu ve EMT düzenleyicileri salyangoz ve sümüklü böcek dahil olmak üzere EnMT sürecini sergilediğini gösterdik in vitro kültürde. Ayrıca, EnMT sürecini in vivo olarak göstermek için bir sıçan kornea endotel kriyoyaralanma modeli kullandık. Toplu olarak, sığır CEC'lerinin in vitro primer kültürü ve in vivo sıçan kornea endotel kriyoyaralanma modelleri, EnMT mekanizmasını araştırmak için yararlı platformlar sunar.

Sığır CECS izole edildikten sonra, hücreler, in vitro olarak kültürlendi. 1 sığır CDKÖ faz kontrast görüntüler sunar Şekil. Izdiham hücrelerin altıgen şekil hücreleri hücre izolasyonu sırasında kornea stromal fibroblast tarafından kontamine olmadığını belirtti. 2 belirtilen bir zaman noktasında ABC, salyangoz ve sümüklü böcek karşı antikorlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir immün tasvir etmektedir. Yanı sıra, ...

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Bu prosedürün genel amacı, kornea endotel mezinkimyal geçiş mekanizmasını in vitro ve in vivo olarak incelemektir. Bu yöntem, kornea endotel rejenerasyonu alanında kornea endotel mezinkimyal geçişine ilişkin soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, hem in vitro hem de in vivo modellere uygulanabilmesidir.Ayrıca manipülasyonu kolaydır. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, Kornea Endotelyal-Mezenkimal Geçiş ile ilişkili hastalıkların tedavisine yöneliktir; örneğin, modeller Kornea Endotelyal-Mezenkimal Geçiş sürecini inhibe eden maddelerin seçilmesinde kullanılabileceği için oluşum süreçleri incelenebilir.Prosedür, bir laboratuvardan teknisyen Bayan Jung-Shen Chang tarafından gerçekleştirilecektir. Bu prosedüre başlamak için, taze sığır gözlerini %10 ağırlık/hacim Povidon-iyodür çözeltisinde üç dakika boyunca dezenfekte edin. Ardından, gözleri PBS ile yıkayın.Kornea butonu neşter ve makasla hasat edin ve PBS ile yıkayın. Diseksiyon mikroskobu altında, Descemet membranını pensle soyun. Ardından, Descemet membranını bir mililitre Trypsin içerisinde 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, sığır CEC'lerini 112 ×g'de beş dakika santrifüj ederek toplayın.Santrifüjlemeden sonra, hücreleri bir mililitre SHEM içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri altı santimetrelik bir kaba ekin ve SHEM içinde kültüre edin. Ardından, hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ortamında inkübe edin ve kültür ortamını her üç günde bir değiştirin.Hücreler konfluense ulaştığında, onları PBS ile yıkayın. Ardından, 37 °C'de beş dakika boyunca bir milimetre Trypsin içerisinde inkübe edin. 112 ×g'de beş dakika santrifüj ederek toplayın.Beş dakika sonra, hücre peletini 1 mm SHEM içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri bir Hemasitometre ile sayın. Bunu takiben, hücreleri 24 kuyucuklu bir plakadaki lamel camlara ekin ve hücreleri SHEM içerisinde kültüre edin.Maramastat'ın ENMT baskılayıcı etkisini incelemek için, hücreleri kültür ortamında 10 micromolar Maramastat içeren SHEM içerisinde inkübe edin ve kültür ortamını her üç günde bir değiştirin. Ardından, hücreleri belirtilen zaman noktasında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 microliters %4 Paraformaldehit ile fikse edin. Sonrasında, hücreleri beş dakika boyunca 250 microliters %0,5 Triton X-100 ile permeabilize edin.Ardından, 30 dakika boyunca %10 BSA ile bloklama yapın. Sonrasında, hücreleri ABC, snail ve slug'a karşı birincil antikorlarla dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri her seferinde 15 dakika olacak şekilde iki kez PBS ile yıkayın.Ardından, örnekleri oda sıcaklığında bir saat boyunca Alexa Fluor konjugatlı sekonder antikor ile inkübe edin. Sonrasında, hücreleri 2 µg/mL konsantrasyonundaki DAPI ile kaplayarak hücre çekirdeklerini karşı boyayın. Hücreleri her seferinde 15 dakika olacak şekilde iki kez PBS ile yıkayın.Ve immünofloresan görüntüleri elde etmeden önce bunları solmayı önleyici montaj solüsyonu ile monte edin. 12 haftalık erkek bir SD sıçanı anestezi ettikten sonra, deri seğirmesinin yokluğunda uygun anestezinin gerçekleştiğini onaylamak için hayvanın derisini hafifçe çimdikleyin. Ardından, ağrıyı ve göz kırpma refleksini minimize etmek için sıçanın sağ gözüne bir damla %0,5 Proparakain Hidroklorür uygulayın.Ardından, kornea kuruluğunu önlemek için sol göze Tetrasiklin pomad uygulayın. Sonrasında, paslanmaz çelik bir probu sıvı Azotta soğutun. Paslanmaz çelik probu sağ gözün merkezi korneasına 30 saniye boyunca uygulayın.Kornea kuruluğunu önlemek için işlem sırasında sağ göze sık sık PBS damlatın; siliyer spazma bağlı gelişen oküler ağrıyı dindirmek ve enfeksiyonu önlemek için kriyoyaralanmadan hemen sonra günde bir kez %0,1 Atropin ve %0,3 Gentamisin Sülfat uygulayın. İşlemden sonra, bir ısı lambası kullanarak sıçanı sıcak tutun ve motor kontrolünü yeniden kazanana kadar iyileşme sürecini gözlemleyin. İyileşme döneminde kornea kuruluğunu önlemek için sağ göze Tetrasiklin pomadı uygulayın ve kornea kriyoyaralanma işlemini üç gün üst üste tekrarlayın.Maramastat veya temel FGF'nin sıçan gözlerinin ön kamarasine iletilmesi için, ağrıyı ve kırpma refleksini minimize etmek amacıyla anestezi uygulanmış sıçanın sağ gözüne bir damla %0,5 Proparacaine Hydrochloride uygulayın. Ardından, oküler yüzeyi steril PBS ile yıkayın. Bir operasyon mikroskobu altında, bir milimetrelik şırıngaya bağlı 30 gauge bir iğneyi, irisle paralel, üzerinde ve düz bir şekilde paralimbal berrak korneadan yerleştirerek ön kamara parasentezi gerçekleştirin. Daha sonra, iğne eğimini yukarıya döndürün ve biraz aköz hümör drenajı sağlayıp intraoküler basıncı düşürmek için kornea yarasını hafifçe bastırın.İlacın 0,02 mililitresini intrakameral olarak enjekte edin ve iğneyi çekerken iğne yolunu bir pamuklu çubukla hafifçe bastırın. Bu şekil, sığır CEC'lerinin ve kültürlerinin faz kontrast görüntülerini sunmaktadır. Hücrelerin konfluens durumundaki altıgen şekli, hücre izolasyonu sırasında korneal stromal fibroblastlarla kontamine olmadığını göstermektedir.Sığır CEC'lerinin In Vitro kültürü sırasında, ABC, snail ve slug'ın nükleer translokasyonu 14. güne kadar tespit edilmiştir. Bu şekil, geniş spektrumlu bir MMP inhibitörü olan Maramastat'ın, In Vitro kültürle büyütülmüş sığır CEC'lerinin ENMT süreci üzerindeki etkisini göstermektedir. Burada, kriyohasarı ve ardından intrakameral enjeksiyon sonrası sıçanların dış göz fotoğrafları yer almaktadır.Fotoğraflar, temel FGF enjeksiyonu sonrası azalmış kornea ödemini göstermektedir. Maramastat ise temel FGF'ye kıyasla kornea ödemini daha da azaltmıştır. Ve bu şekil, kriyoyaralanma ve ardından yapılan intrakameral enjeksiyon sonrası, ABC'ye karşı antikor kullanılarak yapılan sıçan kornea düğmesi immün boyamasını göstermektedir.ABC'nin nükleer translokasyonu PBS grubunda gözlemlenmiş ve temel FGF grubunda anlamlı derecede artmıştır; bu durum Wnt Beta-katenin sinyallemesinin ve ENMT sürecinin aktivasyonunu göstermektedir. İntrakameral enjeksiyon sonrası, temel FGF'yi takiben Maramastat uygulandığında, ABC'nin nükleer boyanması azalmıştır; bu da Maramastat'ın ENMT'yi inhibe edici etkisine işaret etmektedir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, Kornea Endotelyal-mezenşimal Geçiş alanındaki araştırmacılar için in vitro ve in vivo çalışmalarda yol açıcı olmuştur.Bu videoyu izledikten sonra, sığır kornea endotel hücrelerinin nasıl izole edileceğinin yanı sıra kornea kriyoyaralanması ve intrakameral enjeksiyonun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız

in-vitro-vivo-models-to-study-corneal-endothelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Protokol farelerde geliştirilen komea mikro-tahlili tarif eder.

Kornea mikrocep Testi: Fare Eye Angiogenezis Bir Model

Fareler, kornea nakli de dahil olmak üzere birçok transplantasyon şeklini incelemek için bir model olarak kullanılmıştır.  Bu yazıda hem akut hem de geç dönem kornea nakli için bir murin modeli tanımlanmıştır.

Sıçangiller Kornea Nakli: Katı Organ Nakli En Yaygın Formu Eğitim için Bir Model

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Bu iletişim kuralı muayene ve etkileşimleri iki hücre tiplerinin anlayış yardımcı olmak için nerede kornea stromal hücreler ve farklılaştırılmış nöronal hücre birlikte kültürlü bir roman üç boyutlu vitro modeli, açıklar.

Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Eski bir protokol vivo kornea organ kültür model çalışmaları şifa yara açıklanan için yararlı. Bu modeli sistem rejeneratif iyileşmesine katkıda bulunmak üzere ajanlar veya ilaç toksisitesi organize 3D çok hücreli ortamında etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.

Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli

Burada kornea endotel hücrelerinin (MSK) neodimyum kullanarak Descemet zarından (DM) ayrılması için bir protokol sunuyoruz:YAG (Nd:YAG) lazer, büllöz keratopati (BK) için eksvivo hastalık modeli olarak.

Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Bu protokol, insan veya koyun dokusu eksbitkilerinden kornea endotel hücre kültürleri kurmak ve büyümek için gerekli kritik adımları açıklar. Membranöz biyomalzemeler üzerinde kornea endotel hücrelerinin subculturing için bir yöntem de sunulmaktadır.

Biyomalzeme Membranlar Üzerinde İnsan ve Koyun Korneal Endotel Hücre Tabakalarının Büyümesi

Endotel hücrelerinde TGF-β2 kaynaklı EndMT'yi araştırmak için hücre morfolojisi değişikliklerini gözlemleyerek ve immünofluoresans boyama kullanarak EndMT ile ilgili belirteç değişiklikleri ifadesini inceleyerek yöntemleri açıklıyoruz. CRISPR/Cas9 gen düzenlemesi, TGF-β2 kaynaklı EndMT'deki rolünü araştırmak için gen kodlama Salyangozunu tükenmek için tanımlanmış ve kullanılmıştır.

TGF-β aracılı Endotelden Mezenkimal Geçişe (EndMT) ve CRISPR/Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak EndMT Efektörlerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

Burada, kornea epitelinin mekanik ve kimyasal hasarı için fare ve tavşana dayalı hayvan modelleri, yeni terapötikleri ve altta yatan mekanizmayı taramak için geliştirilmiştir.

Kornea Epitelinin Mekanik ve Kimyasal Yaralanmaları için Ex Vivo ve In Vivo Hayvan Modelleri

Keşfedin kornea endotel-mezenkimal geçiş mekanizmalarını in vitro ve in vivo modeller kullanarak. Sığır kornea endotel hücreleri ve sıçan kriyoinjuri modeliyle rejeneratif tıp alanında tedavi stratejileri geliştirmeye yönelik içgörüler sunar.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Daha fazla video keşfet