Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması
8 Ağustos 2016
etkili bir tütün konakçı hücre proteinleri (HCp'ler) arasında% 90'dan daha fazla kaldırma çöktürme yöntemler sunulmuştur üç ısı başka saflaştırma aşamasından önce ayıklar. Bitki HCp'ler tersinmez 60 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda bir araya getirir.
Bu deney setinin genel amacı, bitki konak hücre proteinlerini ısı kullanarak çöktürmektir. Böylece rekombinant biyofarmasötik proteinlerin sonraki kromatografik saflaştırılması kolaylaştırılır. Bu yöntem, örneğin konak proteazları aktive ederek, süreç geliştirmeyi optimize etmeye ve ürün stabilitesini artırmaya yardımcı olabilir.
Bu tekniğin temel avantajı, mevcut proteazlara kolayca uygulanabilmesi ve farklı hedef proteinlere hızla adapte edilebilmesidir. Prosedürü, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Hannah Gruchow uygulamalı olarak gösterecektir. Konak hücre proteinlerini ısı ile çöktürmek için.
Örneğin tütün yapraklarından. Tütün bitkileri metot protokolüne göre kültüre alındıktan sonra, ısı yalıtımlı polistiren köpük bir kova içerisinde sekiz litrelik çalışma hacmine sahip bir su banyosu hazırlayın. Tüm düzeneği manyetik karıştırıcı üzerine aktarın ve su banyosuna bir manyetik balık yerleştirin.
Ardından, manyetik karıştırıcıyı, karıştırıcının yaklaşık bir santimetre üzerinde kalan manyetik olmayan bir destek karosuyla çevreleyin. Prosedürün ilerleyen aşamalarında bunun üzerine bir polipropilen sepet yerleştirilecektir. Su banyosuna sekiz litre tampon çözelti ekleyin.
Ardından, destek karolarının üzerine 23 by 23 by 23 santimetre boyutlarında bir polipropilen sepet yerleştirin. Desteğin, manyetik karıştırıcının dönüşünü engellemediğinden ve sepetin sıvının içine tamamen daldırıldığından emin olun. Sonrasında sepeti çıkarın.
Su banyosunu 70 °C'ye getirmek için ayarlanabilir bir termostat kullanın. Tüm düzeneğin termal dengeye ulaştığından emin olmak için istenen sıcaklığa ulaşıldıktan sonra en az 15 dakika bekleyin. Ardından, tütün yapraklarından 150 gramlık alikotlar hazırlayın.
Yapraklarda geri dönüşü olmayan sıkışma ve hasarlara, örneğin yırtılmalara yol açmamaya dikkat ederek bir alikotu sepete yerleştirin. Sepeti dikkatlice ancak hızlı bir şekilde sıcak sıvının içine daldırın ve destek karolarının üzerine yerleştirin.
Ardından, yüzme olayını önlemek için sepetin üzerine paslanmaz çelik bir blok yerleştirin. Yaprakları haşlama sıvısı içinde beş dakika inkübe edin veya deneysel tasarıma uygun bir süre seçin.
Tüm inkübasyon süresi boyunca sıvı sıcaklığını takip edin. İnkübasyon sonrası, sepeti haşlama sıvısından dikkatlice çıkarın ve yaprakların 30 saniye boyunca süzülmesini bekleyin. Ardından bitki yapraklarını sepetten çıkarıp blendere aktarın ve metot protokollerine uygun olarak ekstraksiyona hemen başlayın.
Çalkalamalı bir kapta çökmüş HCP'leri ısıtmak için. Bir su banyosunu manyetik karıştırıcının üzerine yerleştirin ve iki litrelik paslanmaz çelik kabı, kabın merkezi karıştırıcı plakanın merkeziyle hizalanacak şekilde su banyosuna yerleştirin. Paslanmaz çelik kabın içine bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin.
Kabı ekstraksiyon tamponu ile doldurun. Ardından deiyonize su ile doldurun. Su banyosunu, paslanmaz çelik kabın üst kenarının beş santimetre altına kadar doldurun.
Üzerini kapatmak için bir polistiren köpük kapak kullanın. Ardından, kapağın üzerindeki uygun bir delikten paslanmaz çelik kaba bir termometre yerleştirin. Sonrasında su banyosu sıcaklığını 78 °C olarak ayarlayın ve termal dengeye ulaşması için tüm düzeneği 15 dakika boyunca inkübe edin.
Düzenek dengeye ulaştığında kabı boşaltın, kap hala su banyosundayken içerisine 300 mililitre ekstrakt dökün ve zamanlayıcıyı başlatın. Beş dakika boyunca inkübe ederken ekstraktı 150 rpm hızında karıştırın. İnkübasyon süresi boyunca ekstraktın en az iki dakika boyunca 70 degrees Celsius sıcaklığa ulaştığından emin olun.
İnkübasyon sonrası, sıcak su banyosunu manyetik karıştırıcıdan çıkarın. Paslanmaz çelik kabı çıkarıp buzlu soğuk su içeren bir kovaya yerleştirin. Ardından kovayı karıştırıcı plaka üzerine yerleştirin.
Bitki homojenatının 150 rpm hızında iyice karıştırıldığından emin olun. Termometreyi ekstrakta yerleştirin ve sıcaklık 20 °C veya belirtilen sıcaklığa ulaşana kadar inkübe edin. Metin protokolüne uygun olarak sekiz litrelik çalışma hacmine sahip iki su banyosu kurduktan sonra, ilk banyoyu doldurmak için deiyonize su kullanın.
Termostatı 74.5 °C'ye ayarlayın ve termal dengeye ulaşması için düzeneği 15 dakika inkübe edin. 0,5 litrelik plastik bir beheri, bir litrelik plastik bir beherin içine yerleştirerek yalıtımlı bir saklama kabı hazırlayın. Boşlukları doldurmak için pamuk gibi bir yalıtım malzemesi kullanın.
LS24 hortum kullanarak, ısı değiştiriciyi bir uçtan peristaltik pompaya, diğer uçtan ise bir çıkış hortumuna bağlayın. Her iki hortum ucunu termometre ile birlikte yalıtımlı saklama kabına yerleştirin. Kabı 300 mililitre ekstraksiyon tamponu ile doldurun.
Ardından, ısı değiştiriciyi sıcak su banyosuna yerleştirin ve peristaltik pompayı dakikada 300 mililitre hızla çalıştırın. Üç dakika sonra, kaptaki nihai sıcaklığın 70 °C olduğunu doğrulayın. Bu değer, su banyosunun ayar noktasının yaklaşık 4,5 °C altındadır.
İzoleli kaptaki ekstraksiyon tamponunu boşaltın ve bitki ekstraktından 300 mililitrelik alikotlar hazırlayın. Ardından, izoleli kabı bir alikotla doldurun. Şimdi, bitki ekstraktını ısı değiştiriciden dakikada 300 mililitre hızla beş dakika boyunca pompalayın.
Ardından, üç dakika sonra özüt sıcaklığının 70 °C olduğundan veya deney tasarımında belirtilen sıcaklığa ulaştığından emin olun. Beş dakika sonra, ısı değiştiriciyi buzlu su banyosuna aktarın. İşleme devam etmeden önce özüt sıcaklığının 30 °C'nin altında olduğundan emin olun.
Peristaltik pompaya bağlı giriş hortumunu yalıtımlı kaptan çıkarın. Ardından, ısı değiştiricinin içindeki kalıntı ısı çöktürülmüş bitki özütünü toplamak için pompalama işlemine devam edin. Sonra pompayı durdurun.
Bitki özütünün torba filtrasyonunu gerçekleştirmek için, filtre gövdesine yerleştirilmiş ilgili destek sepetine bir torba filtre monte edin. Sepetin altına bir litrelik bir kap yerleştirin ve özüt alikotlarını dakikada 150 mililitre hızında torbaya uygulayın. Filtrasyon sonrası, ekstraksiyon tamponu içindeki filtratın 1 ila 10'luk seyreltisinin bulanıklığını ölçmek için bir turbidimetre kullanın.
Bir mililitrelik bir örnek aliquot edin ve torba filtratını işleyin. Örneğin, derinlemesine filtrasyon ve kromatografi yoluyla gerçekleştirin. Örneği, metin protokolüne uygun olarak analiz etmeye devam edin.
Konak hücre proteinlerinin haşlama yoluyla ısı ile çöktürülmesi, toplam çözünür proteini veya TSP'yi %96 ± 1 oranında azaltır. Haşlama işlemi, DsRed'in %83 ± 1'ini ve Vax8 hedef proteininin %51'ini geri kazandırmıştır. Bu durum, kromatografik ayırma öncesinde saflığı %0,1'den %1,2'ye çıkarmıştır.
Filtre kapasitesi 63 °C'den yüksek beyazlatma sıcaklıklarında düşüş göstermiştir. Bu durum, protein ekstraksiyonundan sonra flokülantlar ve torba filtrasyonundan sonra filtre yardımcıları eklenerek giderilebilir. Isı çöktürme için kullanılan karıştırmalı bir kap, HCP'lerin maksimum %84 ± 1'ini uzaklaştırmıştır.
Vax8 için 0,33 ± 0,02 yüzde ve DsRed için 20,2 ± 1,4 yüzde saflık elde edilmiştir. Şok haşlama ve ısı değiştirici düzeneğinin aksine, bir kap içerisinde HCP çöktürmesi, sonraki aşamadaki derinlik filtrasyon kapasitesini 2,5 kat artırmaktadır. Bu durum, kap içerisindeki kayma kuvvetlerinin, özütle ısı değiştiriciden pompalama veya şok haşlama sonrası homojenizasyon işlemlerine kıyasla daha düşük olmasını yansıtmaktadır.
60 ve 70 °C arasındaki bir ısı değiştirici kullanılarak, ekstraktaki HCP içeriğinin yaklaşık %88,3 ± 0,7'si tutarlı bir şekilde uzaklaştırılmıştır. Vax8 için %0,31 ± 0,01 ve DsRed için %27,6 ± 2,0 saflık değerlerine ulaşılmıştır.
Son olarak, ısı eşanjörü aynı zamanda en düşük akış yönü derinlik filtresi kapasitesine ulaşmıştır. Tıkanmadan önce metrekare başına yalnızca 13,5 ± 6,0 litre berraklaştırma gerçekleştirmiştir. Bu teknik ustalığa dönüştüğünde, uygun şekilde uygulandığı takdirde numune süresi hariç 50 dakikadan daha kısa sürede tamamlanabilir.
Bu yöntemi uygularken, hedef proteinin ısıya dayanıklı olduğundan emin olmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, ürünü istenen düzeyde daha fazla saflaştırmak için kromatografi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, bitki alanındaki araştırmacıların nicotiana türleri ve aşı adayı proteinlerin saflaştırılmasını keşfetmeleri için bir teknolojiye ön ayak olmuştur.
Bu videoyu izledikten sonra, haşlama, karıştırmalı kap veya ısı eşanjörü kullanarak bitki konakçı hücre proteinlerinin nasıl çöktürüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, tütün ekstraktlarından konak hücre proteinlerinin (HCP'lerin) %90'ından fazlasını etkili bir şekilde uzaklaştıran üç ısı çöktürme yöntemi sunmaktadır. Bu yöntemler, rekombinant biyofarmasötik proteinler için sonraki saflaştırma adımlarını kolaylaştırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyoteknoloji
- Protein saflaştırma
- Farmasötik geliştirme
Arka Plan
- Konak hücre proteinleri, rekombinant proteinlerin saflaştırılmasını engelleyebilir.
- Isıl çöktürme, istenmeyen proteinleri uzaklaştırmak için kullanılan bir tekniktir.
- HCP'lerin etkili bir şekilde uzaklaştırılması, ürün stabilitesi için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, çeşitli hedef proteinlere uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Isı kullanarak bitki konak hücre proteinlerini çöktürmek için bir yöntem geliştirmek.
- Rekombinant biyofarmasötiklerin süreç geliştirme aşamalarını optimize etmek.
- Final ürünün stabilitesini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tütün ekstraktlarının ısı ile çöktürülmesi.
- Protein agregasyonunu indüklemek için sıcaklık kontrolü.
- Ardışık kromatografik saflaştırma teknikleri.
- Laboratuvarda bir yüksek lisans öğrencisi tarafından gerçekleştirilen uygulama.
Temel Sonuçlar
- Ekstratların %90'ından fazlası HCP'lerden arındırılmıştır.
- Isıl işlem, 60 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda bitki HCP'lerini etkili bir şekilde agrege etmiştir.
- Yöntem uygulaması kolay ve uyarlanabilirdir.
- Rekombinant proteinlerin saflaştırılmasını kolaylaştırmıştır.
Sonuçlar
- Isı çöktürmesi, HCP uzaklaştırması için uygulanabilir bir yöntemdir.
- Bu teknik, protein saflaştırma süreçlerinin verimliliğini artırabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemin diğer proteinlere uygulanmasını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Konak hücre proteini (HCP) kontaminasyonu, özellikle yüksek HCP yüklerinin kromatografik verimliliği engellediği bitki tabanlı ekspresyon sistemlerinde, biyofarmasötik saflaştırmada kritik bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu çalışma, 60°C üzerindeki sıcaklıklarda HCP'leri seçici olarak agregat etmek ve uzaklaştırmak, böylece downstream saflaştırma sonuçlarını iyileştirmek amacıyla üç ölçeklenebilir ısı çöktürme yöntemini —bozulmamış tütün yapraklarının haşlanması, karıştırmalı tank işlemi ve ısı değiştirici işlemesi— değerlendirmektedir. Kromatografi öncesinde daha yüksek hedef protein saflığına olanak tanıyan bu yaklaşımlar; proses yoğunlaştırmayı desteklemekte, tampon tüketimini azaltmakta ve bitkilerde üretilen aşı adayları ile terapötik proteinler için genel üretim sağlamlığını artırmaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Erken aşama saflaştırma iş akışlarında HCP girişimini azaltarak hedef proteinlerin fonksiyonel değerlendirmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Nicotiana spp. türlerinde küçük ölçekli ekspresyon taramasıyla uyumlu, ısı tabanlı, hızlı bir berraklaştırma adımı sağlar.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Düşürülmüş HCP arka planı ile berraklaştırılmış ekstraktlar oluşturarak, sonraki immünolojik analizlerde ve aktivite ölçümlerinde sinyal-gürültü oranlarını iyileştirir.
- Operasyonel Değer: Tekrarlı çalışmalar boyunca tutarlı kromatografik performans için hammadde hazırlığını standartlaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değeri: Artırılmış saflığa sahip Vax8 gibi aşı adaylarının üretimine destek sağlayarak immünojenite ve güvenlik değerlendirmelerini kolaylaştırır.
- Operasyonel Değeri: Konakçının genetik modifikasyonuna gerek kalmadan mevcut perfüzyon veya kesikli (batch) hasat süreçlerine entegre olur.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Isıl çöktürme, erken keşif aşamasından preklinik tedarik üretimine kadar olan bitki bazlı rekombinant protein iş akışlarında uygulanabilen, hasat ile kromatografi arasında yer alan bir birim işlem olarak işlev görür.
- Keşif Biyolojisi: Hedef protein tespitindeki HCP kaynaklı gürültüyü azaltarak, terapötik adayların mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Ekstrakt berraklığını ve filtrelenebilirliğini artırarak, güvenilir yüksek kapasiteli saflaştırma taramasına olanak tanır.
- Analitik: Süreç karşılaştırmaları için ölçülebilir HCP azalma metrikleri (örneğin, %84–96 giderim) ve saflık artışları (örneğin, DsRed'in %0,1'den %27,6'ya çıkması) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: İşlem sonrası hedef protein bütünlüğünü (örneğin, Vax8, DsRed) koruyarak, formülasyon ve etkinlik testlerine geçişte süreklilik sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Minimum yeniden doğrulama ile farklı bitki ekspresyon sistemlerine ve hedef proteinlere uyarlanabilir, böylece platform düzeyinde uygulamayı destekler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tutarlı HCP uzaklaştırma ve azalmış kromatografik kirlenme yoluyla saflaştırma sonuçlarında öngörülebilir güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Alt akış derinlik filtresi kapasitesini artırır (karıştırmalı kapta 2,5 kata kadar) ve tampon değişim sıklığını azaltır.
- Stratejik Değer: Proses safsızlıklarını erkenden uzaklaştırarak üretim riskini düşürür ve geç evre parti başarısızlıkları olasılığını azaltır.
- Portföy Etkisi: Erken geliştirilebilirlik metriklerini iyileştirerek bitki kaynaklı adayların riske göre ayarlanmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Hedef denatürasyonu önlemek için termal işlem kontrolü ve protein stabilitesi değerlendirmesi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Hassas karıştırma ve izleme imkanı sunan sıcaklık kontrollü kaplara, ısı değiştiricilere veya haşlama altyapısına erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir HCP uzaklaştırması için merkezler arasında haşlama süresinin, sıcaklığın ve kap geometrisinin standartlaştırılmasını gerektirir.
- Bazı ödünler içerir: haşlama işlem filtresi kapasitesini azaltabilir, ısı değiştirici kullanımı ise ölçeklenebilirliğe rağmen temizleme zorlukları yaratır.
- Her bir hedef protein için HCP uzaklaştırması, ürün verimi ve downstream operasyonel uygunluğu dengelemek adına deney tasarımı yoluyla ampirik optimizasyon gerektirir.
