Name: Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Keşfedin tütün ekstraktlarından ısıl çöktürme yöntemiyle konakçı hücre proteinlerini %90'dan fazla uzaklaştırma tekniğini. Bu yöntem rekombinant biyofarmasötik proteinlerin saflaştırma süreçlerini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Transgenik tütün tohumlarını sağladıkları için Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes ve Veronique Beiß'e ve tütün bitkilerini yetiştirdikleri için Ibrahim Al Amedi'ye teşekkür ederiz. Yazarlar, editoryal yardım için Dr. Richard M. Twyman'a ve MSP1-19 referansını sağladığı için Güven Edgü'ye teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Avrupa Araştırma Konseyi İleri Hibe ''Future-Pharma'', 269110 teklif numarası, Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) ve Fraunhofer-Gesellschaft İç Programları tarafından Hibe No'su kapsamında finanse edilmiştir. 125-600164 çekin.

1. Tütün bitkileri yetiştirmek <ol><li> 0.1 [% ağırlık / hacim] gübre çözeltisi 1 I 1 L deiyonize su 2&#39;ye ve daha sonra her bir mineral yün blok yıkayın. Bir tütün her mineral yün bloğunda tohum ve tohum 16 yıkayarak olmadan gübre çözeltisi 0.25 L nazikçe yıkayın yerleştirin. </li><li> % 70 nispi nemde bir serada, 16 saat fotoperiyot 7 hafta içinde tütün bitkileri yetiştirmek (1 - m - 180 umol sn 2; λ = 400-700 nm) ve 25/22 ° C açık / koyu sıcaklık rejimi. </li><li> Bitki kök dibinde bulunan dört kotiledon yaprakları hariç tüm yaprakları hasat. </li></ol> 2. İsteğe bağlı: Isı Yağış Ağartma tarafından NOT: beyazlaşma tütün Onör puanı çöktürmek için 2.12 adımlarla 2.1 açıklanan adımları uygulayın. CYp&#39;ler çöktürülmüş olması durumunda, tüm bölüm 2 atlaısıtılmış kaba (bölüm 4) ya da bir ısı eşanjörü (bölüm 5) kullanarak. <ol><li> bitki materyali kenara 50 g Set ve (bölüm 3) beyazlaşma olmadan çıkarma yürütmek. sonraki analiz (bölüm 7) sırasında iç kontrol olarak bu özü bir örnek almak. </li><li> Bir ısı yalıtımlı polistren köpük kova veya benzer bir 8-L çalışma hacimli su banyosu, örneğin, 50 x 40 x 40 cm, ayarlayın. sonraki sıcaklık kontrolü (adım 2.7) için su banyosu üzerinde ayarlanabilir termostat monte edin. </li><li> Manyetik bir karıştırma plakası üzerine tüm düzeneği transferi ve bir su banyosunda, bir manyetik karıştırma çubuğu ile yerleştirin. manyetik alan karıştırma çubuğu döndürmek için yeterince güçlü olduğundan emin olun. </li><li> polipropilen sepet (adım 2.6) haşlama işlemi sırasında daha sonra alınacaktır bunun üzerine en az dört destek çinileri ile karıştırma çubuğu çevreleyin. Destek karoları manyetik olmayan bir malzemeden (örneğin, paslanmaz çelik alaşımlı içeren nikel) yapılmış olduğundan emin olun ve onlarkarıştırma çubuğu (Şekil 2) daha yüksektir. </li><li> su banyosu iyondan arındırılmış su, 8 ilave edin. Not:., Düşük pH değerinde presipitasyon sorunu ise, bir tampon kullanılarak, örneğin, 50 mM sodyum fosfat (pH 7,5), hedef protein verimlerini arttırabilir. </li><li> destek karoların üzerinde bir 23 x 23 x 23 cm polipropilen sepet koyun ve sepet karıştırma çubuğu rotasyon ile karışmaz emin olun ve tam sıvıya emin olun. Gerekirse, sepet tamamen batık kadar sonra tekrar sepeti kaldırmak ilave su / tampon ekleyin. DİKKAT: 2.12 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. ısıl yalıtımlı eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. </li><li> 70 ° C (veya deneyler için gerekli olan sıcaklık) su banyosu getirmek için ayarlanabilir termostat kullanın. İstenilen sıcaklık Therma ulaşmıştır tüm montaj sağlamak için ulaşıldıktan sonra en az 15 dakika bekleyinl denge. </li><li> hasat tütün yapraklarından 150 gr alikotları hazırlayın. Yırtarak, örneğin geri dönüşümsüz sıkıştırma ve yaprakları zarar, kaçınarak sepet içinde bir kısım koyun. Bitki materyalinin veya ikinci bir yoğun ambalaj ile sepet fazla doldurmaktan kaçının. </li><li> Dikkatli ama hızlı bir şekilde sıcak sıvı içinde sepeti batığın ve destek fayans üzerine yerleştirin. flotasyon önlemek için sepetin tepesinde paslanmaz çelik blok yerleştirin. </li><li> beyazlatma sıvısı içinde 5 dakika boyunca yaprakları inkübe ya da bir zaman deney tasarımı çalışmalardaki seçin. Tüm inkübasyon dönemi sırasında sıvı sıcaklığını izlemek. </li><li> Dikkatle haşlama sıvıdan sepeti çıkarınız ve 30 saniye süreyle yapraklardan kalan sıvı drenaj sağlar. Sonra bitki sepetin dışında bırakır almak, blender aktarmak ve hemen ekstraksiyon (Bölüm 3) başlatın. NOT: Bitkiler haşlama sonra ve inci başlamadan önce uzun süre saklanabilire ekstraksiyon, örneğin, 30&#39;dan fazla buz üzerinde dakika veya birkaç hafta içinde -20 ° C&#39;de dondurulmuştur başarıyla test edilmiştir. Ancak, ürün istikrar depolama sürelerini artırarak ve böylece acil işlem tavsiye edilmektedir düşebilir. </li><li> Tüm hasat biyokütle işlenir yineleyerek taze yaprak malzemesi ile 2.11 2.8 adımları tekrarlayın. </li></ol> Tütün Yapraklar 3. Protein Ekstraksiyonu DİKKAT: Sonraki adımlar dönen bıçaklar ile bir blender içerir. o blender motora monte ederken blender kova işe yaramaz. <ol><li> Hasat (adım 1.3) ya da kabuksuz (aşama 2.11) 150 g (ıslak kütle) blender bırakır ve ekstraksiyon tamponu (50 mM sodyum fosfat, 500 mM sodyum klorid, 10 mM sodyum disülfit, pH 8.0) 450 ml ekle. Not: ekstraksiyon tamponu bileşimi ekstre edilecek protein bağlıdır ve bu nedenle bir pH, örneğin ayarlı, kullanımını gerektiren ya da TR olarak bileşeni arabellekolduğunu. </li><li> 30 sn sonları serpiştirilmiş ile 3 x 30 saniye bakliyat için yaprakları homojenize. Yaprakları homojenize edilir ve blender kova yapışmasına neden yoktur emin olun. blender durdurmak ve gerekirse tıkanma önlemek için yaprakları kaldırın ve ardından homojenizasyon devam edin. </li><li> Sonraki analiz (bölüm 7) için üretilir her ekstrenin 1 ml örneği alın. bitki materyali beyazlatılmış ise, Aksi seçilen deneysel yaklaşımına bağlı olarak, bir kap içinde ısı yağış (bölüm 4) veya ısı değiştirici (bölüm 5) devam bölüm 6. devam ediyor. </li></ol> 4. İsteğe bağlı: Isı Yağış karıştırılan kap içinde, NOT: Bir karıştırma kabına tütün Onör puanı çökeltmek için 4.11, Bölüm 4.2 de tarif adımları yürütün. CYp&#39;ler (bölüm 2) beyazlaşma ile çöktürülmüş edilmiş veya eşanjör (bölüm 5) kullanılarak çöktürülmüş edilecektir, tüm bölüm 4 atlayın. <ol><li> İki 8-L çalışma hacmi suyu kurmakbanyolar, örneğin, ısıl yalıtımlı polistiren köpük veya benzeri 50 x 40 x 40 cm. İlk banyosunda sonraki sıcaklık kontrolü (adım 4.6) için ayarlanabilir termostat monte edin. İkinci olarak, iyonu giderilmiş suyun 5 L ve daha sonraki soğutma (basamak 4.9) buz 2 kg ekleyin. </li><li> Manyetik bir karıştırma plakası üzerine ilk su banyosu transferi ve teknenin merkez karıştırıcı plakasının merkezine hizalandığını su banyosu içine 2-litrelik bir paslanmaz çelik kap yerleştirmek. </li><li> paslanmaz çelik bir kapta manyetik bir karıştırma çubuğu ile yerleştirin. manyetik alan karıştırma çubuğu döndürmek için yeterince güçlü olduğundan emin olun. </li><li> Paslanmaz çelik kabın üst kenarının altına 5 cm kadar deiyonize su ile su banyosunda doldurun. Daha sonra ekstre tamponu ile kap doldurun. gemide bir polistiren köpük kapağı yerleştirin. DİKKAT: 4.9 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. termal ins dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanınolup, bun- eldivenler. </li><li> Polistiren köpük kapaktaki bir takım elbise delikten paslanmaz çelik bir kaba, bir termometre takın. 78 ° C su banyosu sıcaklığında ayarlamak ve termal dengeye ulaşmak için 15 dakika boyunca tüm montaj inkübe edin. teknedeki sıcaklık 70 ° C, bir su banyosu içinde ayar noktasının altında, yaklaşık olarak 8 ° C olduğundan emin olun. </li><li> paslanmaz çelik bir kapta sıcaklığı 70 ° C ila farklıysa, bir su banyosu içinde sıcaklığı buna göre ayarlamak ve sistem 15 dakika daha dengelenmesi sağlar. kap içinde sıcaklığı 70 ° C kadar ya da deney için gerekli olan bu adımı yineleyin ve paslanmaz çelik gemi boşaltın. </li><li> Bu su banyosu içinde iken bu paslanmaz çelik bir kaba ekstrakt (aşama 3.2) 300 ml dökün ve zaman ölçeri başlat. 150 rpm&#39;de özü ilave edin ve 5 dakika boyunca inkübe edin. Ekstre Bu inkübasyon süresi boyunca en az 2 dakika süreyle 70 ° C&#39;lik bir sıcaklığa ulaşır emin olun. </li><li>, Manyetik karıştırıcı sıcak su banyosu çıkarın paslanmaz çelik gemi çıkar ve buz gibi soğuk kova yerleştirin. Manyetik karıştırıcı üzerine ikinci yerleştirin ve polistren köpük kapağını kaldırın. </li><li> Bitki homojenat de 150 rpm&#39;de çalkalandı olduğundan emin olun özü termometre koyun ve 20 ° C bir sıcaklığa ya da deneysel tasarım ile belirtilen sıcaklığa ulaşana kadar inkübe edilir. </li><li> Tekrarlayın 4.7 tüm alikotları 4.9 için yineleyin. Her ısı 1 ml örneği almak daha sonra bölüm 6 ile devam, son sıcaklığa ulaştığında özü çöktürülmüş. </li></ol> 5. İsteğe bağlı: Bir Eşanjör Isı Yağış Not: bir ısı dönüştürücü kullanarak, tütün Onör puanı çökeltmek için 5,2 5.12 kısımlarda açıklanan adımları yürütün. CYp&#39;ler (bölüm 2) beyazlaşma veya ısıtılmış kapta (bölüm 4) çöktürülür olması halinde, bütün bölüm 5 atlayın. <ol><li> İki 8-L çalışma hacmi kurmaksu banyoları, örneğin, ısı yalıtımlı polistren köpük kova veya benzeri 50 x 40 x 40 cm. İlk banyosunda sonraki sıcaklık kontrolü (adım 5.3) için ayarlanabilir termostat monte edin. İkinci olarak, iyonu giderilmiş suyun 5 L ve daha sonraki soğutma (basamak 5.10) buz 2 kg ekleyin. DİKKAT: 5.9 kadar tüm sonraki adımlar sıcak sıvı taşıma içerir. ısıl yalıtımlı eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. </li><li> 8 L deiyonize su ile ilk su banyosu doldurun. termostat kullanılarak 74.5 ° C&#39;ye sıcaklığı ayarlayın. Termal dengeye ulaşmak için 15 dakika için montaj inkübe edin. </li><li> 1-L plastik geniş şişenin içine 0,5-L plastik kabı yerleştirerek yalıtımlı bir depolama kabı hazırlamak ve pamukla boşlukları doldurmak. Seçenek olarak ise, bir 0,5-L çalışma hacimli bir özel ısıl yalıtımlı kaplarından faydalanır. </li><li> bir ucunda ve diğerleri bir çıkış hortumuna peristaltik pompa, ısı eşanjörünü iletişimer L / S 24 tüp kullanarak biter. Her iki boru yalıtımlı bir depolama kabı içinde bir termometre ile sonlandığı ve 300 ml ekstraksiyon tamponu (Şekil 2) ile doldurun. </li><li> Sıcak su banyosu içine ısı eşanjöründen yerleştirin ve 300 ml dak-1 hızında peristaltik pompayı çalıştırın. kabında ortaya çıkan sıcaklık 3 dakika sonra, 70 ° C su banyosu ayar noktasının altında, yaklaşık 4.5 ° C olduğundan emin olun. </li><li> izolasyonlu-kabı içinde sıcaklığı 70 ° C farklıysa, buna bağlı olarak, su banyosunun sıcaklığı ayarlamak ve sistem 15 dakika daha dengelenmesi sağlar. en az 3 dakika içinde 70 ° C&#39;ye kadar ortam sıcaklığı ile ekstraksiyon tamponu artar sıcaklığına kadar yineleyin veya deney için gerekli olana eşittir ve paslanmaz çelik kap boşaltın. </li><li> yalıtılmış tekneden ekstraksiyon tamponu atın ve bitki ekstresinin 300 ml&#39;lik numuneler hazırlayın. bir bölümüyle izole gemi doldurun. </li><li> 5 dakika boyunca dk -1 300 ml eşanjör sayesinde bitki özü (bölüm 3.3) pompa. Ekstre sıcaklığı 3 dakika sonra 70 ° C, ya da deney tasarımında belirlenen sıcaklık eşit olduğundan emin olun. </li><li> Ekstre de pompalanır edilirken 5 dakika sonra, buz soğukluğunda su banyosu içine ısı eşanjöründen yerleştirin. Sıcaklık tam ulaşır 20 ° C, ya da deneysel tasarım tanımlanan sıcaklık kadar bu ortamda kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> yalıtımlı tekneden peristaltik pompaya bağlı giriş hortumunu sökün ve ısı değiştirici içinde kalan ısı çöktürülmüş bitki özü toplamak için pompalama devam edin. Sonra pompayı durdurun. </li><li> Tekrarlayın 5.7 tüm alikotları için 5.10 için yineleyin. daha sonra torba filtreleme (bölüm 6) için özler geçmek, son sıcaklığına ulaştığında, her bir ısı-çöktürülmüş ekstresi 1 ml örnek almak. NOT: birinci aşama boyunca 5.10 5.7 adımları sonra hiçbir ekstraksiyon tamponu olacakAdım 5.7 atın. </li></ol> Bitki Özü 6. Torba Filtrasyon <ol><li> filtre gövdesine monte ve esnek filtre malzemesi için mekanik destek sağlar karşılık gelen destek sepet içine bir torba filtre monte edin. Sepetin altında bir 1-L kap yerleştirin ve 150 ml dak-1 hızında torbaya (seçilen ısıl işleme bağlı olarak bölüm 3.3, 4.10 ya da 5.11) ekstre alikotları uygulanır. </li><li> Süzüldükten sonra Bulanıklık kullanarak ekstraksiyon tamponu içinde filtre 1:10 seyreltme bulanıklık ölçer. </li><li> Örneğin, derin filtrasyon ve kromatografi 7,10 1 ml örneği alın ve deney tasarımı tanımlanan torba süzüntü işlem. </li></ol> 7. Numune Analizi <ol><li> Bradford yöntemi 24,25 ile toplam çözünür protein (TSP) miktarını ölçün. <ol><li> üç kopya olarak, tek kuyu içine her numunenin 2.5 ul pipet96 oyuklu plaka. 2.000 ug ml -1 - aralığı 0 kapsayan üç nüsha olarak sekiz sığır serum albümin (BSA) standartları içerir. </li><li> kabarcıkları oluşturan önlemek için yavaşça yeterince iyi her 200 ul Bradford reaktif ekleyin ve aşağı yukarı pipetleme iyice karıştırın ama. </li><li> 22 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin ve bir spektrofotometre ile 595 nm&#39;de absorbans ölçümü. BSA referans noktaları yoluyla bir standart eğriye dayanarak örneklerde TSP konsantrasyonu hesaplanır. </li></ol></li><li> Yüzey plazmon rezonans spektroskopi 26 tarafından Vax8 niceliğini. <ol><li> Ayar 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) çalışan tamponu yüzey plasmon rezonans cihazı (10 mM HEPES, 3 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 1.500 mM sodyum klorür,% 0.05 h / h polisorbat 20, pH 7.4) ve cihaza bir karboksimetilatlı dekstran yüzeyine çip monte edilir. sistemi temizlemek için asal işlevini kullanın ve 30 bir akış oranı ile manuel çalışma başlatmakul dk -1 akış hücreleri 1 ve 25 mM sodyum hidroksit, 60 sn serpiştirilmiş enjeksiyon ile iki kez 60 saniye boyunca 2 enjekte 30 mM hidrojen klorür üzerinde. </li><li> 500 ug ml 200 ul -1 mAb 5.2, 10 mM sodyum asetat (pH 4.0) çözelti hazırlayın. Çözülme 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisukinimid (NHS) şişeler ve 1 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüj. NHS 70 ul EDC 70 ul karıştırın ve 7 mm plastik bir şişeye aktarın. </li><li> 10 ul dak-1 bir akış hızı ile 10 dakika için EDC / NHS akış hücreleri 1 üzerine karışımı ve 2 enjekte karboksimetilatlı dekstran yüzeyine yonga yüzeyi etkinleştirir. </li><li> hücre 2 sadece akmasına akış yolunu ayarlayın. 10 ul dak-1 hızında, 15 dakika boyunca enjekte ederek çift mAb 5.2. </li><li> Hücreler, 1 ve 2 akım ve min -1 yüzeyi devre dışı bırakmak için, 5 ul bir oranda, 7 dakika için etanolamin enjekte akış yolunu geçin. TTavuk 25 mM sodyum hidroksit, 60 sn serpiştirilmiş enjeksiyonu ile 60 saniye boyunca iki kez, 30 mM hidrojen klorid enjekte edilir. </li><li> 30 ul dk&#39;lık bir hızda 19 standart -1 180 saniye - örnekleri ve MSP1 enjekte edilir. 1000 ng ml -1 - Vax8 konsantrasyonu 50 olduğundan emin olun. HEPES önceden dilüe gerektiğinde EDTA ve polisorbat 20 (HBSEP) ihtiva eden tamponlu tuz. </li><li> Akış hücresinin 2 bu akış hücresinin 1 pik sinyali çıkart ve MSP 1 sinyaline dayalı örneklerinde Vax8 konsantrasyonunu hesaplamak için fark kullanmak - 500 ng ml -1 bilinen bir protein konsantrasyonu ile 19 enjeksiyon. </li><li> 30 ul dk&#39;lık bir akış oranında 60 saniye boyunca 30 mM hidrojen klorüre maruz bırakılarak 19 enjeksiyon -1 - her numune ya da MSP sonra 1 yonga yüzeyi yeniden. </li></ol></li><li> floresan spektrometresi ile DsRed ölçmek <ol><li> üç kopya olarak, siyah yarı ar, tekli oyuklar her bir numunenin pipet 50 ulEA 96 oyuklu plaka. 225 ug ml -1 - aralığı 0 kapsayan altı DsRed standartları içerir. </li><li> 530 ± 30 nm eksitasyon filtresi ve bir spektrofotometre içinde 590 ± 35 nm emisyon filtre kullanılarak iki kez floresan ölçülür. DsRed referans noktaları yoluyla bir standart eğriye dayanarak örneklerde DsRed konsantrasyonu hesaplanır. </li></ol></li><li> parçacık boyutu dağılımlarının belirlenmesi <ol><li> 1 ml izopropanol ile bir küvet yıkanır ve daha sonra deiyonize su ve 2 ml Toz parçacıkları çıkarmak için. küvet içinde örnek 850 ul pipet. </li><li> zeta potansiyeli ve parçacık büyüklüğü analizörü içine küvet yerleştirin. &quot;Yazılım&quot; açın ve malzeme olarak &quot;Protein&quot; ve dağıtıcı olarak &quot;PBS&quot; ile manuel ölçümü başlatın. 25 ° C&#39;lik bir sıcaklık ve 180 saniyelik bir dengeleme süresi seçin. </li><li> 173 ° backscatter de &quot;DTS0012&quot; hücre ve ölçü seçin. &quot;Auto&quot; fonksiyonu kontrolÖlçüm süresi boyunca iyon ve hiçbir serpiştirilmiş bir gecikme ile üç ölçüm seçin. </li><li> Ölçüm deney görünümünde numunenin üç ölçüm seçerek tamamlandıktan sonra tanecik boyut dağılımı zirve profilini incelemek. &quot;Cilt PSD&quot; sekmesini seçin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>PhRMA. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222013+Report%3A+Medicines+in+Development+-+Biologics%22">2013 Report: Medicines in Development - Biologics</a>. , Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Washington, D.C., USA. (2013).</li>
<li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+strategies+in+plant+molecular+farming%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Process development strategies in plant molecular farming.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).</li>
<li>Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+molecular+pharming+for+the+treatment+of+chronic+and+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 65, 743-768 (2014).</li>
<li>Melnik, S., Stoger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+factories+for+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Green factories for biopharmaceuticals.</a> Curr. Med. Chem. 20, 1038-1046 (2013).</li>
<li>Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+downstream+processing+of+plant-derived+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).</li>
<li>Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+of+plant-made+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification of plant-made recombinant proteins.</a> Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale-down+models+to+optimize+a+filter+train+for+the+downstream+purification+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves.</a> Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flocculation+increases+the+efficacy+of+depth+filtration+during+the+downstream+processing+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+produced+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco.</a> Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose-based+filter+aids+increase+the+capacity+of+depth+filters+during+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins.</a> Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+chromatography-based+purification+strategies+accelerate+the+development+of+downstream+processes+for+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants.</a> Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Woo, J. A., Cramer, S. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+quantitative+structure-activity+relationship+models+to+develop+optimized+processes+for+the+removal+of+tobacco+host+cell+proteins+during+biopharmaceutical+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">The use of quantitative structure-activity relationship models to develop optimized processes for the removal of tobacco host cell proteins during biopharmaceutical production.</a> J. Chromatogr. A. 1322, 18-28 (2013).</li>
<li>Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+precipitation+versus+anion+exchange+chromatography+in+fractionating+recombinant+beta-glucuronidase+from+transgenic+tobacco+extract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract.</a> J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+biopharmaceutical+proteins+produced+in+plants%3A+the+pros+and+cons+of+flocculants%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants.</a> Bioengineered. 5, 138-142 (2014).</li>
<li>Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+extraction+of+monoclonal+antibodies+targeted+to+different+subcellular+compartments+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).</li>
<li>Arfi, Z. A., Drossard, J., Hellwig, S., Fischer, R., Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyclonal+antibodies+can+effectively+detect+tobacco+host+cell+proteins+after+RuBisCO+depletion+and+endotoxin+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Polyclonal antibodies can effectively detect tobacco host cell proteins after RuBisCO depletion and endotoxin removal.</a> Biotechnol. J. , (2015).</li>
<li>Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+host+cell+protein+heat+precipitation+step+simplifies+the+subsequent+purification+of+recombinant+proteins+from+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Eng.+J%22%5BJournal%5D)">Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco.</a> Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+juice+extractor+can+simplify+the+downstream+processing+of+plant-derived+biopharmaceutical+proteins+compared+to+blade-based+homogenizers%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers.</a> Process Biochem. 50, 859-866 (2014).</li>
<li>Beiss, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-precipitation+allows+the+efficient+purification+of+a+functional+plant-derived+malaria+transmission-blocking+vaccine+candidate+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Heat-precipitation allows the efficient purification of a functional plant-derived malaria transmission-blocking vaccine candidate fusion protein.</a> Biotechnol. Bioeng. 112, 1297-1305 (2015).</li>
<li>Ma, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+approval+and+a+first-in-human+phase+I+clinical+trial+of+a+monoclonal+antibody+produced+in+transgenic+tobacco+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants.</a> Plant Biotechnol. J. 13, 1106-1120 (2015).</li>
<li>Mahajan, P. V., Caleb, O. J., Singh, Z., Watkins, C. B., Geyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+treatments+of+fresh+produce%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+T+R+Soc+A%22%5BJournal%5D)">Postharvest treatments of fresh produce.</a> Philos T R Soc A. 372, (2014).</li>
<li>Menzel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+blanching+reduces+the+host+cell+protein+content+and+substantially+enhances+the+recovery+and+stability+of+two+plant+derived+malaria+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimized blanching reduces the host cell protein content and substantially enhances the recovery and stability of two plant derived malaria vaccine candidates.</a> Front. Plant Sci. , (2015).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+complex+systems+using+the+design+of+experiments+approach%3A+transient+protein+expression+in+tobacco+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study.</a> J. Vis. Exp. , e51216(2014).</li>
<li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+to+evaluate+the+efficiency+of+flocculants+for+the+removal+of+dispersed+particles+from+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure to evaluate the efficiency of flocculants for the removal of dispersed particles from plant extracts.</a> J. Vis. Exp. , e53940(2016).</li>
<li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 76, (2006).</li>
<li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter%2F5%27UTR+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).</li>
<li>Piliarik, M., Vaisocherova, H., Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance biosensing.</a> Methods Mol. Biol. 503, 65-88 (2009).</li>
<li>Kim, T. D., Ryu, H. J., Cho, H. I., Yang, C. H., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+behavior+of+proteins%3A+Heat-resistant+proteins+and+their+heat-induced+secondary+structural+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-Us%22%5BJournal%5D)">Thermal behavior of proteins: Heat-resistant proteins and their heat-induced secondary structural changes.</a> Biochemistry-Us. 39, 14839-14846 (2000).</li>
<li>Kwon, S., Jung, Y., Lim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+heat-stable+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bmb+Rep%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of heat-stable proteins in Escherichia coli.</a> Bmb Rep. 41, 108-111 (2008).</li>
<li>Komarnytsky, S., Borisjuk, N. V., Borisjuk, L. G., Alam, M. Z., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+tobacco+guttation+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in tobacco guttation fluid.</a> Plant Physiol. 124, 927-933 (2000).</li>
<li>Drake, P. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rhizosecretion+as+a+production+system+for+recombinant+proteins+from+hydroponic+cultivated+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Development of rhizosecretion as a production system for recombinant proteins from hydroponic cultivated tobacco.</a> FASEB J. 23, 3581-3589 (2009).</li>
<li>Turpen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+and+the+virescence+of+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.%2C+Ser.+B%3A+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus and the virescence of biotechnology.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond., Ser. B: Biol. Sci. 354, 665-673 (1999).</li>
<li>Kingsbury, N. J., McDonald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+E1+Endoglucanase+Recovery+from+Tobacco+Leaves+Using+the+Vacuum+Infiltration-Centrifugation+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of E1 Endoglucanase Recovery from Tobacco Leaves Using the Vacuum Infiltration-Centrifugation Method.</a> Biomed. Res. Int. , (2014).</li>
<li>Buyel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numeric+simulation+can+be+used+to+predict+heat+transfer+during+the+blanching+of+leaves+and+intact%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Eng.+J%22%5BJournal%5D)">Numeric simulation can be used to predict heat transfer during the blanching of leaves and intact.</a> Biochem. Eng. J. , (2015).</li>
<li>Mandal, M. K., Fischer, R., Schillberg, S., Schiermeyer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protease+activity+by+antisense+RNA+improves+recombinant+protein+production+in+Nicotiana+tabacum+cv.+Bright+Yellow+2+%28BY-2%29+suspension+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protease activity by antisense RNA improves recombinant protein production in Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow 2 (BY-2) suspension cells.</a> Biotechnol. J. 9, 1065-1073 (2014).</li>
<li>Welty, J. R., Wicks, C. E., Wilson, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWelty%2C+JR+%22Fundamentals+of+momentum%2C+heat%2C+and+mass+transfer%22">Fundamentals of momentum, heat, and mass transfer</a>. , Wiley. (1976).</li>
<li>Lowe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation%2C+stability%2C+and+formulation+of+human+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+protein+chemistry+and+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Aggregation, stability, and formulation of human antibody therapeutics.</a> Advances in protein chemistry and structural biology. 84, 41-61 (2011).</li>
<li>Gong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+antibody+constant+domains+with+increased+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered human antibody constant domains with increased stability.</a> J. Biol. Chem. 284, 14203-14210 (2009).</li>
<li>Rouet, R., Lowe, D., Christ, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+engineering+of+the+human+antibody+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stability engineering of the human antibody repertoire.</a> FEBS Lett. 588, 269-277 (2014).</li>
<li>Stabel, J. R., Lambertz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+pasteurization+conditions+for+the+inactivation+of+Mycobacterium+avium+subsp+paratuberculosis+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Efficacy of pasteurization conditions for the inactivation of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in milk.</a> J. Food Prot. 67, 2719-2726 (2004).</li>
<li>Wichers, H. Ch. 12. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWichers%2C+H+%22Managing+Allergens+in+Food%22">Managing Allergens in Food</a>. Mills, C., Wichers, H., Hoffmann-Sommergruber, K. , Elsevier Science. 336(2006).</li>
<li>Davis, P. J., Williams, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+by+thermal+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Protein modification by thermal processing.</a> Allergy. 53, 102-105 (1998).</li>
<li>Dubois, M. F., Hovanessian, A. G., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-shock-induced+denaturation+of+proteins.+Characterization+of+the+insolubilization+of+the+interferon-induced+p68+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat-shock-induced denaturation of proteins. Characterization of the insolubilization of the interferon-induced p68 kinase.</a> J. Biol. Chem. 266, 9707-9711 (1991).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çıkar çatışmaları var.

Yukarıda açıklanan ısı yağış için üç yöntem etkili bir şekilde kromatografik saflaştırma adımı 16,17 önce tütün Onör puanı kaldırabilirsiniz. Bunlar, örneğin, ilk ürün saflığı, damlama 29 salgılanmış proteinler ile sınırlıdır hepsi rhizosecretion 30 ya da santrifüjlü ekstraksiyon 31,32 artırılmasını amaçlayan diğer metodlar tamamlar. hedef protein fazla 1 dakika boyunca ~ 60 ° C&#39;de en az çökelme sıcaklığı dayanabilir arıtılacak Bununla birlikte, ısı dayal...

Modern sağlık sistemleri giderek biofarmasötik proteinler 1 bağlıdır. Bitkilerde bu proteinlerin üretilmesi bilinen ekspresyon sistemleri 2-4 ile karşılaştırıldığında, düşük patojen yükü ve ölçeklenebilirlik avantajlıdır. yıkıcı çıkarma prosedürleri bulanıklıkları 5000 nefelometrik bulanıklık üniteleri (NTU) aşan ve konak hücre proteini (HCP) konsantrasyonları genellikle 95 aşan, yüksek parçacık yükü neden Ancak, bitkisel kökenli ilaçların aşağı işleme (DSP) zor olabilir % [m / m] 5,6. Ayrıntılı açıklama prosedürleri dağınık parçacıklar 7-9 kaldırmak için gerekli, ancak kromatografi cihazı CYp&#39;lerine 10,11 verimli çıkarılması için önceki bir adım varsa, ilk ürün kurtarma sırasında bağlama-ve-uzaklaştırma modunda çalışmaya daha pahalıdır vardır. Bu floccul kullanılarak hedef protein çökeltme yoluyla elde edilebilirkarıncalar 12 ya da düşük pH 13,14 yanı sıra HCp&#39;ler araya neden olarak. Ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilaz / oksijenaz (RUBISCO), tütün (Nicotiana tabacum), yeşil bitkilerde en bol HCP, seçici çekiş polietilen glikol 15 eklenmesi ile geliştirilebilir, ancak bu, pahalı ve geniş ile uyumsuz olabilir ölçeğindeki üretim. Isıl işlem örneğin Vax8 protein sıtma aşısı adayları çözelti 16-18 kararlı kalırken, denatüre ve tütün CYp&#39;lerine fazla% 95 çökeltilmesi için gösterilmiştir. Sıcaklık kontrollü bir kap karıştırılır (ii) (i) beyazlatma, örneğin, sıcak sıvı içinde sağlam yaprak daldırma, ve (iii) bir ısı eşanjörü (: Üç farklı yaklaşımlar, tütün CYp&#39;lerine ısı kaynaklı çökelmesini elde etmek için kullanıldı Şekil 1) 16. sağlam yaprakları, CYp&#39;lerine hızlı ve verimli yağış elde etti ve aynı zamanda kolay gerçekleştirilen ağartmabüyütmek ve bitki biyokütlesi 19 yıkamak için bir başlangıç ​​aşamasını içerir mevcut büyük ölçekli üretim süreçleri ile uyumlu için. Bunun aksine, sıcaklık kontrollü DAMARLARIN bazı proseslerde kullanılabilir ve tank yüzey-hacim oranı, giderek azalır, çünkü bitkinin ısıl işlem 20 özler, ancak ölçeklenebilirlik ve enerji transferi hızı sınırlıdır için kullanılabilir ve süreç ölçeğinde uygun hale gelir. Bir ısı değiştirici de karıştırma kazanları ısıtıldı için teknik olarak iyi tanımlanmış bir alternatiftir ancak ısıtma ve soğutma ortamı, örn, buhar ve soğuk su bol miktarda bir kaynağı gibi ısı değiştirici geometrisine adapte edilmiş bir sıkı bir şekilde kontrol hacimsel akış hızı gerektirir medya özellikleri, örneğin., özgül ısı kapasitesi. Bu makalede, tüm üç yöntem, genel olarak, tütün CYp&#39;lerine ve bitki CYp&#39;lerine ısı kaynaklı çökeltme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. kurulması ve EAC operasyonbir laboratuvar ortamında H yöntemi büyük ölçekli işlemler için uygunluklarını değerlendirmek için de kullanılabilir. büyük bir sorun süreci ölçekli üretim sırasında kullanılan cihazlar ve şartları andırır her işlem için yeterli ölçek aşağı modelleri ve çalışan koşullarını tespit etmektir. Burada sunulan veriler DsRed 16 sıtma aşısı adayı Vax8 floresan proteini ifade eden transgenik tütün bitkileri ile yapılan deneyler bakınız, ancak yöntem de başarılı N&#39;ye uygulanmış benthamiana bitkiler geçici diğer biofarmasötik proteinleri 21 dile getirdi. Bir tasarım-of-deneyler (DoE) işlem gelişimini kolaylaştırabilir 22 yaklaşım ve daha önce 8 açıklandığı gibi 23 de bu bağlamda yararlı olabilir flokülantlar. , Haşlama ısıtmalı kap ve eşanjör arasındaki temel fark bu beyazlaşma ot ise sürecin başlarında sağlam yapraklara uygulanan bironun bitki ekstreleri (Şekil 1) uygulanır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54343/54343fig1.jpg" /> Şekil 1:. Tütün HCP Isı Yağış Üç Farklı Yöntemlerle uygulanmasını gösteren Süreç Akış Şeması bitki materyali yıkanmış ve açıklama ve arıtma önce homojenize edilir. ağartma adımı (kırmızı) için donatım kolayca mevcut makinelerin eklenebilir. Buna karşılık, bir karıştırılan gemi (turuncu) ve özellikle eşanjör (mavi) kullanarak bir veya birden fazla ek aygıtlar ve boru gerektirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54343/54343fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>2100P Taşınabilir Türbidimetre</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>Türbidimetre</td></tr><tr><td>Amin Kaplin Kiti</td><td>GE Sağlık</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>SPR çip birleştirme kiti</td></tr><tr><td>Otoklav sepeti</td><td>Nalgene</td><td>6917-0230</td><td>Yaprak haşlama sepeti</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>SPR cihazı</td></tr><tr><td>Biyo Hücre Analizörü BCA 003 R& 3D ORM</td><td>Sequip</td><td>n.a.Partikül</td> <td>boyutu analiz cihazı</td>ile D</tr><tr><td>Blender</td><td>Waring</td><td>800EG</td><td>Blender</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>Torba filtre</td></tr><tr><td>Santrifüj 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü 15 ml</td><td>Labomedik</td><td>2017106</td><td>Reaksiyon tüpü</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü 50 ml kendi kendine ayakta</td><td>Labomedik</td><td>1110504</td><td>Reaksiyon tüpü</td></tr><tr><td>CM5 çip</td><td>GE Sağlık</td><td>BR100012&nbsp;</td><td>SPR ölçümleri için çip</td></tr><tr><td>Küvet 10 x 10 x 45</td><td>Sarsted</td><td>67.754</td><td>Zetasizer Nano ZS</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc. için Küvet</td><td>n.a.DoE</td> <td>yazılımı</td></tr><tr><td>Disodyum fosfat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&nbsp; 4984.3&nbsp;</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Gübre</td></tr><tr><td>Forma -86C ULT dondurucu</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Dondurucu</td></tr><tr><td>Sera</td> n.a.n.a.Bitki <td></td><td></td><td>yetiştiriciliği için</td></tr><tr><td>Grodan Taşyünü Küpleri 10 x 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>Taşyünü blok</td></tr><tr><td>Yirmi-döngülü ısı eşanjörü (4,8 m uzunluk)</td><td>n.a. (özel tasarım)</td><td>n.a.Heat</td><td> eşanjör</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>K200P 60D</td><td>Pall</td><td>5302303</td><td>Derinlik filtre tabakası</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>Derinlik filtre tabakası</td></tr><tr><td>Lauda E300</td><td>Lauda Dr Wobser GmbH</td><td>Z90010</td><td>Su banyosu termostatı</td></tr><tr><td>L/S 24</td><td>Masterflex</td><td>SN-06508-24</td><td>Boru</td></tr><tr><td>mAb 5.2</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>HB-9148</td><td>Vax8 spesifik antikor</td></tr><tr><td>Masterflex L/S</td><td>Masterflex</td><td>HV-77921-75</td><td>Peristaltik pompa</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R Filtre</td><td>bezi</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pH metre / iletkenlik ölçer</td></tr><tr><td>Osram soğuk beyaz 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Işık kaynağı</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Bitki</td> <td>yetiştiriciliği için</td></tr><tr><td>Sodyum disülfit</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8554.1</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik kap; 0,7 kg 2,0 L; yükseklik 180 mm; çap 120 mm</td><td>n.a. (özel tasarım)</td><td>n.a.Isı</td> <td>çökeltme kabı</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Floresan ve spektrometrik plaka okuyucu</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>Filtre muhafazası</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>DLS partikül boyutu dağılım ölçümü</td></tr><tr><td>Zetasizer Yazılımı v7.11</td><td>Malvern</td><td>n.a.Zetasizer</td> <td>Nano ZS cihazını çalıştırmak için yazılım</td></tr></tbody></table>

bozulmamış bitkiler ağartma veya ekstraktlarının isıl İşlem tarafından tütün ana hücre proteini temizleme yöntemlerinin karşılaştırılması

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Bitkiler insanlar için yiyecek, yem ve hammadde sağlamak değil, aynı zamanda bu antikorların, aşı adayları ve enzimler gibi biyofarmasötik proteinler, ekonomik bir üretim sistemi olarak geliştirilmiştir değil sadece. Bu bitki biyokütlesinin saflaştırılması gerekir, ancak kromatografi aşamaları, bitki ekstrelerinde konakçı hücre proteinleri (HCp&#39;ler) yüksek konsantrasyonlarda girmesi engellenir. Bununla birlikte, çoğu HCp&#39;ler geri dönüşü olmayan hedef proteinin daha sonraki saflaştırmayı kolaylaştıran 60 ° C&#39;nin üzerindeki sıcaklıklarda bir araya getirir. Burada, üç yöntem sağlam yapraklar ya da özleri ya tütün CYp&#39;lerine ısı yağış elde etmek için sunulmuştur. bozulmamış yaprakların blanching kolayca mevcut süreçlere dahil edilebilir ancak sonraki filtrasyon adımlar üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. tersi gibi proses ekipman tasarımı büyük değişiklikler ile de olsa alt işlemleri performansını artırmak, karıştırılan kap içinde, yaprak ekstreleri ısı çökeltilmesi için de geçerlidirhomojenleştirici geometrisi. Son olarak, bir ısı değiştirici kurulumu iyi ısı transfer koşulları açısından karakterize ve ölçek kolay, ama temizlik zor olabilir ve filtre kapasitesi üzerinde olumsuz bir etki olabilir edilir. Tasarım-of-deneyler yaklaşımı HCP kaldırma ve ürün kurtarma etkileyen en uygun proses parametrelerini belirlemek için kullanılabilir. Bu, diğer sentezleme platformlarda her yöntemi ve belirli bir saflaştırma stratejisi için en uygun yöntem tanımlanması uygulamayı kolaylaştırır.

Beyazlaşma tütün konak hücre proteinlerinin ısı yağış Bölüm 2&#39;de açıklanan beyazlatma işlemi başarılı bir şekilde, tütün 96 ±% 1 TSP azaltarak 70 ° C ile yapraklardan Onör puanı çökeltmek için kullanılabilir (n = 3) bu şekilde, Vax8 hedef proteinin% 51 kadar geri kazanılması artan ise kromatografik ayırma 16 önce% 0.1% 1.2 ila saflık. 64.1% 3.3 den% saflığı artan floresan proteini DsRed 83 ± 1% (n = 3) kurtarmak da mümkün oldu. Beyazlatma işlemi kolay biyok...

etkili bir tütün konakçı hücre proteinleri (HCp&#39;ler) arasında% 90&#39;dan daha fazla kaldırma çöktürme yöntemler sunulmuştur üç ısı başka saflaştırma aşamasından önce ayıklar. Bitki HCp&#39;ler tersinmez 60 ° C&#39;nin üzerindeki sıcaklıklarda bir araya getirir.

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Bu deney setinin genel amacı, bitki konak hücre proteinlerini ısı kullanarak çöktürmektir. Böylece rekombinant biyofarmasötik proteinlerin sonraki kromatografik saflaştırılması kolaylaştırılır. Bu yöntem, örneğin konak proteazları aktive ederek, süreç geliştirmeyi optimize etmeye ve ürün stabilitesini artırmaya yardımcı olabilir.Bu tekniğin temel avantajı, mevcut proteazlara kolayca uygulanabilmesi ve farklı hedef proteinlere hızla adapte edilebilmesidir. Prosedürü, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi Hannah Gruchow uygulamalı olarak gösterecektir. Konak hücre proteinlerini ısı ile çöktürmek için.Örneğin tütün yapraklarından. Tütün bitkileri metot protokolüne göre kültüre alındıktan sonra, ısı yalıtımlı polistiren köpük bir kova içerisinde sekiz litrelik çalışma hacmine sahip bir su banyosu hazırlayın. Tüm düzeneği manyetik karıştırıcı üzerine aktarın ve su banyosuna bir manyetik balık yerleştirin.Ardından, manyetik karıştırıcıyı, karıştırıcının yaklaşık bir santimetre üzerinde kalan manyetik olmayan bir destek karosuyla çevreleyin. Prosedürün ilerleyen aşamalarında bunun üzerine bir polipropilen sepet yerleştirilecektir. Su banyosuna sekiz litre tampon çözelti ekleyin.Ardında

comparison-tobacco-host-cell-protein-removal-methods-blanching-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Bu bitkilerde monoklonal antikorlar ve raportör proteinlerin geçici transgen ifadesi üzerindeki düzenleyici elemanlar, bitki büyüme ve gelişme parametreleri ve inkübasyon koşullarının etkisini belirlemek ve modellemek için kullanılabilecek deneyler yaklaşımın bir tasarımını tarif eder.

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Hedeflenen protein yıkımı, hücre fonksiyonu için önemli bir düzenleyici mekanizmasını temsil eder. Daha sonra, 26S proteazomu için moleküler "etiketleri" hizmet hedef proteine ​​bağlanan bir Poliübikütin zincirleri korunmuş ubikitin-proteazom süreci yoluyla gerçekleşir. Burada, proteinlerin proteozomal indirgenmesi için basit ve güvenilir bir hücre içermeyen tahlili tarif eder.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Optimize edilmiş insan periferik kan mononükleer hücresi (PBMC) ex vivo tahlilleri kullanarak, yanıcı bir tütün ürünü preparatının, efektör PBMC'lerin reseptör aracılı hücre içi salgılanan sitokinleri ve sitolitik yeteneğini belirgin şekilde baskıladığını gösterdik. Bu hızlı tahliller, ürün değerlendirmesinde ve tütün maruziyetinin potansiyel uzun vadeli etkilerinin anlaşılmasında faydalı olabilir.

Yöntem Yanıcı Tütün Ürün Müstahzarların Sitotoksisite ve immünosupresyonun değerlendirin

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Bu prosedürde, Bir DsRed tabanlı epitop ligand protein A alternatif olarak, ham bitki özleri veya hücre kültürü supernatants monoklonal antikorların yakalanması için son derece seçici afinite reçine üretmek için immobilize edilir.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

Burada, fidelerde Phytophthora nicotianae direnci için tütün genotiplerinin etkili ve doğru bir şekilde taranması için bir protokol sunulmaktadır. Bu, hassas ıslahın yanı sıra moleküler mekanizma araştırması için pratik bir yaklaşımdır.

Phytophthora nicotianae Direnci için Tütün Genotiplerinin Taranması

Keşfedin tütün ekstraktlarından ısıl çöktürme yöntemiyle konakçı hücre proteinlerini %90'dan fazla uzaklaştırma tekniğini. Bu yöntem rekombinant biyofarmasötik proteinlerin saflaştırma süreçlerini kolaylaştırır.

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması (Video) | JoVE Journal

Bozulmamış Bitkiler Ağartma veya Ekstraktlarının Isıl İşlem tarafından Tütün Ana Hücre Proteini Temizleme Yöntemlerinin Karşılaştırılması

Daha fazla video keşfet