Name: Otoimmün demiyelinizasyonun Farmakolojik Müdahaleler için CNS Koruma karşı Belirlenmesi Bağışıklık Sistemi Bastırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Öğrenin, farmakolojik müdahalelerin EAE modelinde immün hücre infiltrasyonunu baskılayarak mı yoksa nöroprotektif etkilerle mi CNS koruma sağladığını belirlemeyi. Bu yöntem, multipl skleroz tedavileri için kritik mekanizmaları açıklar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Genel Endowment Fonu, Ulusal - Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz SocietyRG 4587-A-1, Civitan Uluslararası Araştırma Vakfı, Mike L. Jezdimir Enine Myelit Vakfı, Alabama Sağlık Hizmetleri Vakfı Üniversitesi NINDS P30-NS069324 tarafından finanse edildi Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri Bilim Vakfı 1355183, ve T32 AI007051.

<ol><li>Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+a+synthetic+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide.</a> Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).</li>
<li>Yednock, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+antibodies+against+alpha+4+beta+1+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin.</a> Nature. 356, 63-66 (1992).</li>
<li>Ridge, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+mitoxantrone%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+immunology+and+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone.</a> Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).</li>
<li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).</li>
<li>Kuerten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MP4-+and+MOG%3A35-55-induced+EAE+in+C57BL%2F6+mice+differentially+targets+brain%2C+spinal+cord+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum.</a> J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).</li>
<li>Brownell, B., Hughes, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+plaques+in+the+cerebrum+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).</li>
<li>Kidd, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions in multiple sclerosis.</a> Brain. 122 (Pt 1), 17-26 (1999).</li>
<li>Kutzelnigg, A., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+and+brain+atrophy+in+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+neurological+sciences%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions and brain atrophy in MS.</a> Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).</li>
<li>Geurts, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+lesions+in+multiple+sclerosis%3A+combined+postmortem+MR+imaging+and+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR+Am+J+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology.</a> AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).</li>
<li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing--remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130, 2816-2829 (2007).</li>
<li>Evonuk, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+System+Xc%28-%29+Transporter+Attenuates+Autoimmune+Inflammatory+Demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination.</a> J Immunol. 195, 450-463 (2015).</li>
<li>Rowse, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lithium+controls+central+nervous+system+autoimmunity+through+modulation+of+IFN-gamma+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling.</a> PloS one. 7, e52658(2012).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Naive+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT4+controls+GM-CSF+production+by+both+Th1+and+Th17+cells+during+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE.</a> J Neuroinflammation. 12, 128(2015).</li>
<li>Legoux, F. P., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide%3AMHC+tetramer-based+enrichment+of+epitope-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Law, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Foxp3+antibody+and+fixation%2Fpermeabilization+buffer+combinations+in+identifying+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).</li>
<li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth.</a> Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A(2001).</li>
<li>Korn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin-specific+regulatory+T+cells+accumulate+in+the+CNS+but+fail+to+control+autoimmune+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation.</a> Nature medicine. 13, 423-431 (2007).</li>
<li>Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+promote+induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+facilitating+reactivation+of+T+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system.</a> Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).</li>
<li>Bar-Or, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%3A+a+72-week%2C+open-label%2C+phase+I+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial.</a> Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).</li>
<li>Kappos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocrelizumab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%3A+a+phase+2%2C+randomised%2C+placebo-controlled%2C+multicentre+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial.</a> Lancet. 378, 1779-1787 (2011).</li>
<li>Berer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+microbiota+and+myelin+autoantigen+cooperate+to+trigger+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination.</a> Nature. 479, 538-541 (2011).</li>
<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system%3A+host-virus+stand-off%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li>
<li>Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+role+for+virus-specific+CD4+T+cells+in+mice+with+coronavirus-induced+acute+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis.</a> The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

MS&#39;li hastalar, CNS içine T hücre aktivasyonu ve / veya infiltrasyonu zayıflatan ilaçlar doğrudan MSS korumak tedavi seçeneklerinin gelişmesini warranting ise hastalık dönemleri devam. EAE klasik MS belirtileri modellemek için kullanılır olmuştur ve in vivo immün sistem ve MSS arasındaki etkileşimlerin doğasını okuyan zaman güçlü bir araç olabilir. Çevre immün hücre CNS&#39;de infiltrasyonu ve çoğalmasını ve aktivasyonunu inceleyerek ile bağlantılı olarak daha önce veya hastalığın başlangıcından sonra işleme EAE de hususlar, örneğin, zamanlamasını kullanarak, bağışıklık sistemi ve hem de tedavi etkilerini belirlemek mümkün olduğu CNS. C57BL / 6 fare EAE daha yaygın olarak kullanılan iken bu fareler parankiminde bir nüks-remisyon fenotip ve bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu olduğu gibi, SJL fare EAE, MS vakaların çoğunda daha iyi temsil olabilirBeynin 10. SJL fareler hastalığı sunmuştur sonra mümkün tedaviye başlamak için yapım ancak azaltılmış inflamasyon dönemlerinde, hem de remisyon sırasında açık bir iyileşme var. SJL fareler her zaman nüks ve sonuçları toplanmış zaman potansiyel olarak büyük değişkenlik sonuçlanan senkronize havale olmadığını dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, bazı araştırmacılar hastalığın ilerlemesinde bireyselleştirilmiş noktalarda FACS analizi ve histoloji için fareler çekerken bir hayvandan klinik puanlar için temsili sonuçları göstermek için tercih edebilir. manipülasyonlar bir tedavisi bağışıklık sistemini ya da merkezi sinir sistemini nasıl etkilediği belirlenmesinde yardımcı olabilir EAE fareler yapıldığında göz önüne alındığında. Tedavi başladığında için birçok seçenek kendi bağışıklık hücreleri CNS girmiş olup olmadığını için çağrışım ve nasıl her MSS ile etkileşim olabilir, vardır. Semptomların başlangıcından önce tedavisi bağışıklık hücreleri henüz girilen veya MSS hasara neden değil anlamına gelir.Semptomların başlangıcından sonra tedavisi bağışıklık hücreleri MSS girdiniz ve bazı hasara neden olduğunu ima eder. SJL fareler kullanılarak, tedavi de bağışıklık hücreleri aktif olarak sızmakta ve inflamasyona yol açar, ya da bağışıklık hücreleri daha az inflamasyon ile MSS az yaygın olabilir remisyon sırasında olan bir tekrarlama sırasında başlayabilir. bağışıklık hücreleri tedavi sırasında patolojik sürecin neresinde göz önüne alındığında, tedavi CNS ve bağışıklık sistemini nasıl etkilediğini ilgili ilk hipotezler yapılabilir. tedaviler bağışıklık hücreleri ve MSS, EAE belirtilerin şiddetini azaltma sonuçta her etkileyebilir yolları bir dizi vardır. Nedenle, bağışıklık hücreleri MSS girmiş olup olmadığını, çevre ve MSS nasıl etkilendiğini bağışıklık hücreleri bakmak için akış sitometrik analizi ve immunohistokimyasal kullanmak gereklidir ve MSS tedavisi nasıl tepki vereceğini. omurilik akım sitometri analizi kaç hücre ha belirlemek mümkün olmakla birliktebelirli bir zamanda MSS girdikten bir bağışıklık hücrelerinin çoğalması dalak etkilenmez sürece bu etkisi azalır bağışıklık hücre kaçakçılığı nedeniyle olduğunu belirleyemiyor. Hem çevresel ve merkezi sinir sistemi dokusu analiz ve her iki dokular karşılaştırıldığında mekanistik anlama sonuçlarına belirlemek için gereklidir. bağışıklık hücre aktivitesi profilleri düzenleyici T hücresi yoğun profilinin patojenik yardımcı T hücre ağır profilinde bir anahtara sahip, örneğin, muamele ile değiştirilebilir için de mümkündür. Farklı hücre tipleri için belirteçler bakarak ve işlenmiş ve işlenmemiş hayvanlardan arasındaki yüzde ifadesini karşılaştırmak, bu nedenle, aynı zamanda önemli bir husustur. MS araştırmalarında ortaya çıkan bir kavram B hücreleri otoimmün demiyelinizasyon önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. Bu B hücreleri, T hücreleri 20 yeniden aktivasyonu için gerekli olduğunu gösteren çalışmalara dayanmaktadır. Bu kavram gibi rituksimab, CD20 eski karşı bir antikor olarak tedavi başarısı tarafından desteklenmektedirB hücrelerinin 21,22 yüzeyinde bastırdı. Klinik çalışmalarda monoklonal antikor ocrelizumab başarısı gösterildiği gibi, CD20 farklı epitopları hedefleyen ilaçlar, B hücresi hedefli terapötik 23 etkinliğini iyileştirebilir. Burada sunulan tekniklerden biri sınırlama bağışıklık hücreleri MSS girmek ama parankiminde yolculuk mümkün olabilmesi için bunun mümkün olmasıdır. İmmünohistokimya muamele edilmiş ve muamele edilmemiş hayvanlar arasında parankimi mesafeyi bağışıklık hücrelerinin perivasküler cuffing tespit etmek ve değerlendirmek için de kullanılabilir. Bir diğer potansiyel sınırlama EAE patogenezinde mikrobiyomları etkilerini içermektedir. Ortakçı bağırsak Mikrobiyota ağır hastalık patogenezi 24 etkileyebilir; Bu nedenle, fareler, farklı koloniler içinde yer alır ve hatta farklı kafeslere hastalık şiddetinde büyük farklılıklar olabilir. aynı kafeste kaldırdı yavru denetimlerini kullanmak için mümkün olduğunca Buna göre, her zaman tercih edilirEAE ilgili deneyler. Son bir not da çevre immün hücre proliferatif değişikliklerin etkilerini ortadan kaldırmak için deneysel arzu edilir ise, pasif transferi indüksiyon yerine bu protokolü açıklanan aktif indüksiyon kullanarak bunu yapmak mümkün olabilir olmasıdır. Nöro için daha fazla onay hücre ölümünün ya da seçici bir hücre tipi proteinlerin silinmesi sağlar koşullu nakavt fareler kullanılarak özel mekanizmalar test etmek için bir ko-kültür sistemi 11 kullanılarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, nöro-koruyucu farmakolojik ajanların araştırılmasını uzatmak için, aksonal transection ve nöron ölümüne belirteçleri dahil edilmelidir. önemi bir başka alan remiyelinizasyon olduğunu. Yaralı aksonlar nöroprotektif tedaviler remiyelinizasyon tedavilerin önemli bir parçası olmalıdır ileri destek veriyor remyelinate edemiyoruz. Ayrıca, miyelinsiz aksonlar myelina daha yaralanmaya daha savunmasızted aksonlar. Bu bir akson aksonal hasarı önlemek olacaktır zamanında yeniden miyelin oluşumunu teşvik demiyelinize terapötik girişimlerin olduğunda ortaya koymaktadır. Bu yollar araştırmak için, demiyelinasyon ve remiyelinasyon diğer in vivo modelleri (örn cuprizone ve lisolesitin) kullanılabilir. yöntem Burada miyelin kaybı miktarının tarafından nöro değerlendirilmesi üzerinde duruldu tarif. remiyelinizasyon değerlendirilmesi progenitör hücrelerin sayısı yanı sıra çoğalmaya ve de araştırmak önemli olacağını olgun yetenekleri için. Bu alternatif modellerin söz ile, bir de viral aracılık ensefalit farklı modeller göz önüne almalıyız. Miyelin kaybı üreten iki iyi karakterize edilmiş RNA viral modeli vardır: Bir Theiler ensefalomiyelit sıçan, zarfsız Picornaviridae virüsüdür ve diğer fare hepatit virüsü, Coronaviridae virüs ailesinden 25,26 bir üyesidir. EAE st için değerli bir araçtırmanipülasyonlar veya tedaviler bağışıklık sistemi ve in vivo merkezi sinir sistemini nasıl etkilediğini udies. tedavi, hastalık sürecini etkileyen burada bu, kan-beyin bariyeri de ya da merkezi sinir sisteminde, periferde olsun, tespit yardımcı olabilir Burada açıklanan protokol. MS için hiçbir mevcut tedaviler hastalığı ve hastaları zamanla sık sık tecrübe düşüş tedavi. Benzer şekilde, akut dissemine ensefalomyelit, transvers miyelit ve nöromiyelitis optika, bağışıklık hücreleri infiltre tarafından saldırı altında doğrudan olarak CNS korumak eksikliği tedavisi dahil bağışıklık hücresi CNS içine sızmasını ve miyelin bozulması ile ilgili diğer hastalıklardan. dikkate tedavinin zamanlaması alınması ve tedavileri konusunda yapılacak mekanik belirlemeleri için izin verecektir inflamasyon ve hasarı değerlendirmek için CNS immünhistokimya ile birlikte akım sitometri dalak analizi ve omurilik kullanarak.

Multipl skleroz (MS), ağırlıklı olarak, hastalığın erken döneminde beyin ak madde bölgelerinde enflamatuar lezyonlar ile karakterize edilir. Uzun vadeli ilerlemesi sonra, gri cevher atrofi MR görüntüleme ile saptanan ve hastalığın nörodejeneratif fazını işaretleri. Reaktif gliozis, demiyelinizasyon ve beyaz cevherde aksonal hasar MSS-infiltre Bağışıklık hücreleri atfedilir. Şu anda CNS&#39;de nörodejenerasyonu önlemek, direkt olarak ters veya MS kullanılan tedavilerin hiç biri - bunun yerine, merkezi sinir sistemi, T hücresi aktivasyonunu ve / veya sızmasını hafifletecek iltihabı azaltır. Orada MS tedavisi yok ve güncel tedaviler kullanan hastalar hastalığın ilerlemesini yaşamaya devam çünkü, demiyelinizasyon ve nöronal kaybını önlemek ilaçların keşifler önem taşımaktadır. Yani, CNS azaltılmış hasar - - s görünüyor Ancak, bağışıklık hücreleri üzerindeki etkileri ve MSS üzerinde olanlar arasında ayrım sonuç olarak, deneysel zor olabilirne olursa olsun meydana geldiği mekanizmaları ame. Bu nedenle, merkezi sinir sistemi koruma değerlendirilmesi hastalık mekanizmalarını nasıl etkilediğini farmakolojik ajanlar belirlemek için çevre bağışıklık hücreleri ve immün hücrelerin proliferasyonunu MSS-süzücü değerlendirmeleri ile ortak olmalıdır. , Deneysel otoimmün ensafalomiyelitis (EAE), şu anda MS 1-4 tedavisinde kullanılan ilaçların keşfi için doğrudan sorumlu olan oto-bağışıklık iltihap hastalıklarının köklü bir hayvan modelidir. Fareler genellikle C57BL / 6 fareleri genetik varyantları müsaitlik durumuna göre bir popüler suşu olmak, EAE için kullanılır. EAE ile uyarılan C57BL / 6 fareler gün 10 sonrası indüksiyon etrafında başlayan kronik hastalık progresyonunu sergilerler. Omurilik parankimi ve beyincik infiltrasyonu kortikal parankiminde 5 infiltrasyon yokluğu ile, bu hayvanların histopatolojik karakteristiktir. b Buna ek olarak, kortikal lezyonları ve demiyelinasyonYağmur C57BL / 6 farelerinde, nispeten mevcut olmayan hastalık 6-9 diğerlerinden ayıran vardır. Tekrarlayan-düzelen hastalık ve MS 10 yılında benzer görünen beyin ve omurilikte hem de bulundu lezyonu SJL fareler, kullanmak mümkün olduğunda nedenle, tercih edilebilir. bağışıklık hücreleri MSS ulaşmak asla eğer tedavi nöroprotektif olarak sınıflandırılmış olamaz. Bu nedenle, bu protokol daha önce 11 gösterildiği gibi beyin, omurilik ve EAE farelerden dalak akış sitometrik analizi kullanımı immün hücre merkezi sinir sistemi içine sızma ve çevre immün hücrelerin proliferasyonu üzerinde tedavinin etkisini belirlemek için yapar. kapsamını ve Nöro-doğasını belirlemek için CNS dokusunun immünohistokimyasal analizleri de tarif edilir. Bu yöntemlerin birleştirilmesi MSS olup olmadığını PR bağışıklık hücreleri aktive immun hücre MSS girdi olup, periferde çoğaldı tespiti, izin verir veenflamasyon veya hasar otected. nöroprotektif etkileri bağışıklık sistemi üzerine etkilerine rağmen şüphesi varsa, deneyci MSS oluştu içine tedavisi bağışıklık hücre infiltrasyonu sonra kez start değiştirebilir. Burada, aktif EAE, MS T hücre-aracılı hayvan modelinde iki farklı modellerini kullanarak bir protokol mevcut ve farklı yönleri üzerinde deneysel tedavilerin etkinliğini belirlemek için hastalık sırasında çeşitli zaman noktalarında immünohistokimya ile birlikte akış sitometri analizine MS patogenezi. Bu yöntem, immün hücre çoğalması ve MSS koruması karşı sızması üzerindeki etkileri arasında ayrım ilaçlar hastalığın patogenezi ile ilgili nasıl hareket daha kolay daraltmak için yapım araştırmacılar yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>22 x 22 x 20 mm gömme kalıbı</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9719245</td><td></td></tr><tr><td>22 x 30 x 20 mm gömme kalıbı</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9531194</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>2-Metilbütan</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>30 x 22 x 20 mm gömme kalıbı</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-30</td><td></td></tr><tr><td>ACK Parçalama Tamponu</td><td>Kalite Biyolojik</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552775</td><td>0.2 mg / ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-Foxp3-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5773-82</td><td>0.5 mg / ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-GFAP (Kokteyl)</td> <td>Biolegend</td><td>835301</td><td>1 - 3 mg / ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-Iba-1 Poliklonal Antikor (50 & # 181; g)</td> <td>Wako</td><td>019-19741</td><td>0.5 mg / ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-IFN -& gama; APC</td><td>eBioscience</td><td>17-7311-82</td><td>0.2 mg/ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-IL-17A PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-7177-82</td><td>0.2 mg/ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-Ki-67 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5698-82</td><td>0.2 mg/ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-MBP (D-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-13912</td><td>0.2 mg/ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-TCR&beta; FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5961-85</td><td>0.5 mg / ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>anti-TCR ve beta; PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-83</td><td>0.2 mg/ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Biyotinile Keçi Anti-Tavşan IgG</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>BA-1000</td><td>1.5 mg/ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Biyotinile At Anti-Fare IgG</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>BA-2000&nbsp;</td><td>1.5 mg/ml stok konsantrasyonu</td></tr><tr><td>Sitrik Asit, Susuz, %99,5</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AC42356-5000</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), tetrasodyum tuzu dihidrat, %99</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AC446085000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları, 10 Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Golgi Fiş</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>protein taşıma inhibitörü</td></tr><tr><td>Immedge Hidrofobik Bariyer Kalem</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>İyonomisin</td><td>EMD Millipore</td><td>407952-5mg</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin, 100x</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>IR Yakınında Canlı / Ölü Boyama Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L10119</td><td>canlılık boyası</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal at serumu</td><td>Vector Labs</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %96</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AC416785000</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Sağlık</td><td>Hizmetleri 17-0891-01</td><td>yoğunluk gradyanı</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td>reçineli montaj ortamı</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA)</td> <td>Sigma</td><td>P1585-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-Miyelin Temel Protein Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>808401</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Doku-Tek CRYO-OCT Bileşiği</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>noniyonik deterjan</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kiti (Standart)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9206402</td><td>avidin-biotin-peroksidaz&nbsp; immünoperoksidazda kompleks (ABC&nbsp;</td></tr><tr><td>Vektör Laboratuvarları Peroksidaz Substrat Kiti (DAB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9276270</td><td>DAB çözeltisi</td></tr></tbody></table>

otoimmün demiyelinizasyonun farmakolojik müdahaleler için cns koruma karşı belirlenmesi bağışıklık sistemi bastırma

Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination

Otoimmün demiyelinizan hastalık multipl sklerozun (MS) önemli bir özelliği, beyin ve omuriliğe bağışıklık hücresi infiltrasyonudur ve miyelin yıkımı ile sonuçlanır, bu sadece sinir uyarılarının iletimini yavaşlatmakla kalmaz, aynı zamanda motor ve bilişsel gerileme ile sonuçlanan aksonal yaralanmaya neden olur. MS için mevcut tedaviler, merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonunu azaltmaya odaklanmaktadır. Bu tedaviler nüks sayısını azaltır, yaşam kalitesini iyileştirir, ancak nüksleri tamamen ortadan kaldırmaz, bu nedenle uzun vadeli sakatlık iyileşmez. Bu nedenle, CNS'yi koruyan terapötik ajanlar garanti edilir. Hem hayvan modellerinde hem de MS'li insan hastalarda, CNS'ye T hücresi girişi genellikle başlatıcı enflamatuar olay olarak kabul edilir. Bir ilacın CNS'yi koruyup korumadığını değerlendirmek için, periferde bağışıklık hücresi infiltrasyonu veya proliferasyonu üzerindeki herhangi bir potansiyel etki göz ardı edilmelidir. Bu protokol, ilaç müdahalesinden sonra gözlenen CNS korumasının, CNS'ye sızan bağışıklık hücrelerinin zayıflatılmasının veya enflamatuar hakaretler sırasında CNS hücrelerinin ölümünün engellenmesinin bir sonucu olup olmadığının nasıl belirleneceğini açıklar. Enflamatuar hakaretler sırasında CNS'ye koruyucu olan MS tedavilerini inceleme yeteneği, terapötik stratejilerin ilerlemesi için son derece kritiktir, çünkü mevcut tedaviler nüksleri azaltır, ancak tamamen ortadan kaldırmaz (ör., bağışıklık hücresi infiltrasyonu), CNS'yi dejenerasyona karşı savunmasız bırakır.

Burada, bir farmakolojik ajan tarafından MSS koruma sağlar anlamak için EAE iki model kullanılan ya MSS-süzücü T hücrelerini zayıflatan veya enflamatuar, bağışıklık hücre infiltrasyonu saldırı sırasında miyelin ve akson hasarı önler. Immün hücre infiltrasyonu ve patolojisi çoğunlukla, omurilik (Şekil 1A) &#39;de bulunduğu bir terapötik madde omuriliğe bağışık hücre içi filtratı önler olmadığını belirlemek için, kronik EAE, C57BL / 6 fare modeli kullanılır. Terapötik ilaç MSS, beyin ve omurilik (Şekil 1B) hem de hastalık patolojisi gösteriyor kullanılan tekrarlayan-düzelen EAE SJL hayvan modeli, içine bağışıklık hücrelerinin saldırı sırasında MSS koruma sağlar olmadığını belirlemek için. klinik Değerlendirmeleri İlgili Klinik değerlendirmeler, tipik aşağıdaki başlığı (Şekil 1 &#39;e göre yapılırC) ya da atipik (Şekil 1D) EAE. Tipik klinik hastalık için 0 puan anormal bir davranıştır. kuyruk tabanı tarafından yakalandı zaman kuyruk (çok bir helikopter, rotor gibi) hızla dönebilir ve arka bacaklar ayrı yayılacaktır. 1 olan bir klinik skor kuyruk tabanından ile fare kaldırarak belirlenebilir kısmen gevşek kuyruk vardır. Normal helikopter gibi dönen zayıflamış ya da yok, ve kuyruk kısmı tamamen gevşek olabilir olabilir. kuyruk paralizi kapsamını belirlemek için bir yardımcı yolu kısmen felçli kuyruk bunu yapamaz olacak ise bir unparalyzed kuyruk genellikle parmak etrafında kıvırmak gibi, kuyruk uzunluğu kişinin parmağını yukarı çalıştırmaktır. 2 olan bir klinik skor tamamen felç kuyruk temsil eder. kuyruk dibinde fare yukarı seçerken kuyruk hiçbir hareket tüm oluşur. 3 klinik skor kısmi arka bacak felç eder. Bu skorun belirlenmesi fare fla üzerinde hareket etmek üzere serbest olmasını gerektirirt yüzeyi. bir arka bacak sürükleyerek ise fare ilerledikçe, bir veya her iki arka bacaklarda kısmen felçli olarak görünüyorsa, 3 skoru verilebilir. 4 klinik skor tam arka bacak paralizi temsil eder. Bu skor ile, bir fare, arka bacaklarda hareket edemiyoruz olacak ve ön uzuvların kullanarak kendini öne sürükler. 5 Klinik skor can çekişen fare temsil veya güçlükle fare kafes veya solunum genelinde kendisini hareketli. Bir fare kafesinin alt kısmındaki veya nefes zahmetli ise kendisini sürükleyerek yapamıyorsanız, fare insanca ötenazi edilmelidir. 6 klinik skor kafesine ölü bulundu fare temsil eder. 6 puan sıradışı ve EAE dışındaki ölüm nedenleri araştırılmalıdır. Atipik klinik hastalık olabilir veya felç eşlik olmayabilir. Bir fare atipik hastalık artı tipik belirtileri ile sunuyor eğer iki ayrı skorlama sistemleri dahil gerekli olabilir. 0 puan, anormal davranışları, a,Tipik puanlama sistemi ile s. Fare yürürken 1 olan bir klinik skor hafif bir baş dönüş ya da tilt temsil eder. Bu fare öne yürümeye izin vermek ve hareketi için sürekli bir sağ veya sol yönünü gözlenmesiyle belirlenebilir. 2 olan bir klinik skor daha belirgin baş dönüş ve kötü düzeltilmesi yeteneği temsil eder. 1 atipik puan ile olduğu gibi, fare kendi hareketi yönü vardır ve denge ile hafif zorluk çekebilir. 3 klinik skor düz bir çizgide yürümek için bir yetersizlik temsil eder. Fare zorluk dengeleme olacak ve yürür gibi doğru kendini yardım etmek kafesin yan kullanabilirsiniz. 4 klinik skor nedeniyle dengeleme sorunları yürümekte zorluk yan döşeme fare, temsil eder. Fare kafesinin alt kısmındaki kendini sürüklemek mümkün olabilir ancak hareketin yönünü olabilir. Desteklenen sürece 5 olan bir klinik skor sürekli haddeleme temsil eder. Bu skor ulaşan bir fare insanca ötenazi edilmelidir. bir klinik6 al puanı kendi kafesine ölü bulundu fare temsil eder. 6 puan sıradışı ve EAE dışındaki ölüm nedenleri araştırılmalıdır. Bir farenin durum değişiklikleri hafifçe veya eğer iki puanları arasındaki seçimi zor ise bir puana 0.5 ekleyerek, örneğin skorları, &quot;aradaki-&quot; için izin vermek için gerekli olabilir. Örneğin, başlayan bir fare normal muadillerine göre daha yavaş hareket ama hiçbir felç veya 0,5 puan verilebilir kuyruk tarafından yakalandı zaman onun bacaklarını dışarı eğimlendirme yerine kendi ön, arka ayakları tokalar fare görüntüler için . Sadece kafesinin alt kısmındaki kendini sürüklemek ve sadece 3.5 bir puan verilebilir periyodik veya dokundu onun arka bacaklarda seğirme mümkün olabilir bir fare. Bağışıklık Hücre İnfiltrasyonunun bir Azaltma değerlendirilmesi C57BL / 6 fare modelinde EAE (Şekil 1A, gün 0) antijen presentati indüksiyonundan sonradalakta T hücrelerinin ve çoğalması üzerinde günlerde meydana 1 - yaklaşık 3 ile 5 gün, klinik skorları ile mevcut başlangıç ​​bağışık hücre içi filtratı fareler gün sonra 7. yaklaşık CNS bağışık hücre infiltrasyonu ve ardından 5. terapötik ajan omuriliğe bağışıklık hücre infiltrasyonu engelleme olup olmadığını değerlendirmek için, ilaç veya araç dalak antijen sunumu ve çoğalması gün sonra 7 tanıtıldı ama bağışıklık hücreleri omuriliğe içine sızmak başlamadan önce edilir. Bağışıklık hücre infiltrasyonu zayıflatılmış olması durumunda, klinik seyri gün hastalığın yükselen faz 10 ila 15 (Şekil 2) esnasında geliştirilmiş klinik skorları yansıtmalıdır. bağışık hücre içi filtrasyonundan bir azalma azalması nöro neden olur. Reaktif astrositleri ve mikrogliyozu nöro başlıca işaretlerinden olarak kabul edilir. Iba-1 ile GFAP ve mikroglia ile astrositler için boyama sonra chang değerlendirmek için kullanılabilirOrtalama alan kesir boyama es Nöroenflamasyon (Şekil 3) ölçmek için. Bağışık hücre içi filtratı azaltılmış olup olmadığını belirlemek için, omurilik uzaklaştırılmış ve hastalık tepe (Şekil 1A, yaklaşık günde 18) de akış sitometri analizi için işlemden geçirilir. Bu bağışıklık hücrelerinin en fazla sayıda omurilik girmiştir sağlar. CNS&#39;ye T hücrelerinin giriş başlatılması enflamatuar etkinliği olarak kabul edilir ve her iki Th1 ve Th17 hücreleri EAE hayvan modellerinde hem de MS hastalarında bulunur. Birlikte ele alındığında, akış sitometrik analizi, patojenik T hücrelerinin her iki tip değerlendirme içermelidir. Ayrıca, Treg&#39;ler hastalığı nemlendirin iyi karakterize baskılayıcı T hücreleridir. Bu nedenle, toplam CD4 + popülasyonundan Tregs yüzdesi efektör T hücre popülasyonlarının yüzdesi ile karşılaştırıldığında değerlendirilmelidir. Bu ise ther T hücre infiltrasyonu genel bir azalma meydana gelmişse ortaya ya da olacake MSS T hücre fenotipleri bir eğriltmeyi olduğunu. Örnek nokta diyagramları (Şekil 4A), araç ile tedavi edilmiş farelerde (sağ üst kadranda numaraları), omurilik ile karşılaştırıldığında ilaçla işleme tabi tutulan farelerden alınan omurilik T hücrelerinin infiltre CD4 + genel sayısında bir azalma göstermektedir. Sırasıyla IFN-y + IL-17 + ve Foxp3 + ve (Şekil 4A) azaltılmalıdır: Th1, Th17 ve Treg hücreleri aşağıdaki imza proteinleri değerlendirilir değerlendirmek. İstatistiksel analiz önemli bir düşüş (Şekil 4B) göstermek için CD4 +, IFN-y + IL-17 + ve Foxp3 + hücre sayıları üzerinde yapılmalıdır. (Ve Foxp3 + hücreler yapılır - IL-17 + IFN-γ - T hücre alt bir eğrilme, IFN-y + IL-17 + IFN-y + IL-17 oranının istatistiksel değerlendirme ekarte etmek için Fişekil 4C). T hücrelerinin MSS nüfuz eden bir azalma periferinde çoğalmasını, aktivasyonunu ve farklılaşmasını inhibe etmek için bir sonucudur olasılığını ortadan kaldırmak için, aktif T hücre alt tipi oranına ek olarak T hücrelerinin proliferasyon sayısı değerlendirilmesi gerekir. Aktivasyonu ve farklılaşması etkilenmemiş (Şekil 5A) ise hiçbir CD4 +, IFN-y + yüzdesi değişiklik, IL-17 + veya Foxp3 + bulunmalıdır. Proliferasyon (Şekil 5B) etkilenmez Dahası, Ki67 + CD4 + hücrelerinin bir değişiklik bulunmalıdır. İlaç tedavisi 7. günde tanıtılmaktadır veya daha çevre ilk antijen sunumu ve T hücre aktivasyonunu değiştirilmesini engellemek. Ancak genetik modeller proteinler genellikle embriyogenez sırasında yapısal silinir veya splenosit asse yapma EAE indüksiyon öncesi uyarılanbüyük önem ssment. CNS Koruma Değerlendirilmesi Belirli bir terapötik madde, bağışıklık hücresi infiltrasyonu sonra merkezi sinir sistemi hastalık patolojisi modüle etmesi halinde göstermek için, iki ilaç klinik hastalık puanlama ilk zirve sırasında tatbik edilmelidir. Bu fareler, bir nüks-remisyon fenotip sergileyen yana EAE SJL modeli Bu deneyler için avantajlıdır. Bir uyuşturucu tedavi miyelin-akson dejenerasyonu engeller varsa, klinik skorlarında düzelme (Şekil 6) görülecektir. miyelin Patolojik değerlendirme geliştirilmiş klinik skorları ile tutarlı miyelin hasarının bir azalma teyit edilmelidir. Kantitatif miyelin bütünlüğü, miyelin bazik protein DAB boyama değerlendirmek (MBP), bu lekeleme için optik yoğunluk istatistiksel analizi (Şekil 7), ardından gerçekleştirilir. bundan başka nöro-inflamasyonu kanıtlamak için sürekli veya therape azaltılırUTIC girişimler, reaktif gliyoz (Şekil 3), yukarıda tarif edildiği gibi reaktif gliyoz ortalama fraksiyon alanı ölçülerek değerlendirilebilir. bir tedavi yöntemidir doğrudan immünomodülatör etkileri olmadan MSS koruyucu olduğunu doğrulamak için, dalak immün hücre CNS içine sızması ve çoğalma zayıflama indirimli edilmelidir. Bu sorunu çözmek için, beyin ve immün hücre infiltrasyonu ve periferik T hücresi çoğalması ve aktivasyonunun değerlendirilmesi omurilik değerlendirilmesi için yöntemler yukarıda tarif edildiği gibi gerçekleştirilmelidir (Şekiller 4 ve 5). Birlikte ele alındığında, T hücreleri ya da çevre T hücrelerinin proliferasyonunu MSS nüfuz eden bir azalma ile hiçbir kanıt CNS&#39;de hücre hasarı bloke terapötik maddeler merkezi sinir koruyucu tedavilerdir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig1.jpg" /> Şekil 1. Temsilcisi ResuC57BL / 6 ve SJL Farelerde EAE Klinik Puanlarının lt. (A) Klinik skorlar kronik hastalığı olan EAE üretmek için MOG 35-55 ile uyarılan (n = 10) / 6 fareleri C57BL (ortalama ± SEM). (B) Klinik puanlar, tekrarlayan-düzelen hastalığa sahip EAE üretmek PLP 139-151 indüklenen SJL farelerinin (n = 3) ve (ortalama ± SEM). (C) EAE farelerde tipik hastalık ilerlemesini izlemek için kullanılan klinik skorlama tablosu. (D) EAE farelerde atipik hastalığın ilerlemesini izlemek için kullanılan klinik skorlama tablosu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig2.jpg" /> EAE ile C57BL / 6 farelerde Şekil 2. Farmakolojik Tedavi öncesinde Bağışıklık Hücre Sızma. </strOng&gt; C57BL / 6 fareleri MOG 35-55 güne 7 İmmünizasyondan PBS ile muamele edilmiş (n = 20) ya da SAS (n = 19) kliniksel skorlar (ortalama ± SEM). Veriler, üç bağımsız deneyin Havuzlanmış vardır. İstatistiksel fark * p &lt;0.05, parametrik olmayan bir, iki kuyruklu, Mann-Whitney U-testi kullanılarak tespit edilmiştir. (11) izni ile yeniden yazdırın. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig3.jpg" /> Şekil 3. Immunofluorescent Boyama ve Kontrol, EAE Spinal Kabloları reaktif gliozis miktarının belirlenmesi ve Tedavi C57BL / 6 fareler. (A) kontrol omurilik GFAP (astrositler) ve İba-1 (mikroglia) için Floresan etiketleme (aşılanmamış PBS (orta paneller) veya SAS (sağ paneller) ile tedavi) fareler (sol panel) ve EAE fareler. Ölçek çubuğu = 100 mikron. boyama miktarının yüzde immunop ölçmek için Konum fraksiyon tekniği kullanılarak saptanmıştırGFAP (B) ve IBA-1 (C) kablo bağlantısının artı yeri alanı. , Ortalama ± SEM, n = 3, kontrol, n = 3 SAS ile muamele edilmiş ya da N = 4, PBS ile tedavi edilmiş fareler, fare başına 6 bölümleri. İstatistiksel farklılıklar, bir tek-yönlü ANOVA kullanılarak belirlendi * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** P &lt;0.001. Yeniden baskı (11) izni ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig4.jpg" /> EAE, C57BL / 6 fare omurilik Şekil 4. FACS analizi. Muameleye tabi tutulmuş fare T hücresi infiltrasyonu Azaltılmış gösteren C57BL / 6 fareleri EAE 7 gün postinduction başlayarak SAS veya PBS ile muamele edilmiştir. Omurilik Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) göstermektedir 15. gün (A), Örnek nokta diyagramları elde edilmiş ve Th17 (IFN-γ- / IL-17 +) CD4 + kapısı (üst panel) ve T düzenleyici hücreler (FoxP3 +) (alt paneller) hücreler. Nokta araziler sağ üst kadranda yüzdeleri gösterir. (B) mutlak CD4 + hücrelerinin sayısı olarak, IFN-γ + IL-17A + ve Foxp3 + hücreleri istatistiksel olarak analiz edilmiştir. (C) Sas- ve PBS ile tedavi edilmiş EAE fareleri arasındaki T hücre popülasyonlarının yüzde değişim de incelenmiştir. iki bağımsız deneyden elde işlenmiş SAS ve n = 9, ortalama ± SEM, n = PBS tedavi için 10. Iki kuyruklu t-testi, tüm çubuk grafikler kullanılmıştır. ** P &lt;0.01. Yeniden baskı (11) izni ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig5.jpg" /> Şekil 5. FACEAE, C57BL / 6 fare dalak S Analizi Arıtılmış ve tedavi görmemiş farelere denk T hücre ekspresyon profilleri ve çoğalmasını gösterilmesi. PBS ve SAS ile tedavi edilen farelerden alınan dalak EAE 15 D postinduction analiz edilmiştir. (A) CD4 + T hücrelerinin yüzdesi, Th1 (IFN-γ + / IL-17 -), Th17 (IFN-γ - / IL-17 +) PBS gelen dalaklarda ve regülatör T hücreleri (FoxP3 +) ile muamele edilmiş (n = 10) ve iki bağımsız deneyden (n = 9) fareler SAS-işlemden geçirildi. (B, sol panel) naif dalaklarından CD4 + popülasyonunda Ki-67 + hücrelerinin oranı (n = 4) diğer yandan da PBS- (n = 5) ve SAS-ile tedavi edilmiş farelerde (n = 5) ile teşvik EAE. Bir tek yönlü ANOVA testi PBS veya SAS-tedavi EAE dalak ya kıyasla naif dalak Ki-67 + hücrelerinin oranı arasında istatistiksel önemini gösterdi. Hiçbir önemi PBS ve SAS-tedavi EAE dalak arasında gözlenmiştir. (B, sağ panel) Temsilcisi nokta araziler; numaraları çoğalma oranını gösterir. Nokta araziler yüzdeleri gösterir. Çubuk grafikler iki kuyruklu t testi temsil *** p &lt;0.001. Yeniden baskı (11) izni ile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54348/54348fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig6.jpg" /> Şekil 6. Farmakolojik muameleden sonra EAE ile SJL farelerinde bağışık hücre içi filtratı. Klinik puanlar (ortalama ± SEM) PBS ile muamele SJL farelerinin (n = 8) ya da SAS (n = 8) PLP ile immünizasyon sonrası 24. günde (kesikli çizgi) ile ilgili 139-151. Veriler klinik skorları ± SEM. İstatistiksel fark *** p &lt;0.001, parametrik olmayan bir, iki kuyruklu, Mann-Whitney U-testi kullanılarak tespit edilmiştir. Üst satır istatistiksel için kullanılan değerleri temsilAnaliz. (11) izni ile yeniden yazdırın. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54348/54348fig7.jpg" /> Optik Yoğunluk kullanarak MBP Boyama Şekil 7. belirlenmesi. (A) EAE ile uyarılan yavru kontrol C57BL / 6 fare ile karşılaştırıldığında belirtilmeyen bir genetik nakavt fare torakal omurilikteki MBP Temsilcisi boyama. Parantez azaltılmış MBP boyama belirten demiyelinizasyon temsilcisi alanını belirtir. Belirsiz bir genetik nakavt C57BL / 6 fare gelen torakal omurilik (B) MBP boyama. (C) EAE ile indüklenen Tanımlanmamış genetik knockout farelerde (KO n = 6 fare, 2-4 bel ve hayvan başına göğüs bölümleri) vahşi tipli (ağırlık itibarı ile omurilik MBP boyama daha yüksek bir optik yoğunluk (OD) sergiler; n = 3 fareler, 2-4 lomber ve EAE ile uyarılan göğüs hayvan başına bölümler) fareler. Istatistiksel olarak analiz USI* P &lt;0.05, bir iki kuyruklu t testi ng. Hata çubukları SEM&#39;i temsil etmektedir. Ölçek çubuğu 100 mikron.

Bu protokol, deneysel otoimmün ensefalomiyelit için farmakolojik tedavilerin, immün hücre infiltrasyonunun baskılanmasının bir sonucu olarak CNS koruması gösterip göstermediğinin veya immün hücre infiltrasyonunun saldırısı sırasında nöroprotektif olup olmadığının nasıl belirleneceğini açıklar.

Otoimmün demiyelinizasyonun Farmakolojik Müdahaleler için CNS Koruma karşı Belirlenmesi Bağışıklık Sistemi Bastırma

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in ...

Bu kavramsal yöntemin genel amacı, deneysel otoimmün ensefalomiyelit için uygulanan farmakolojik tedavilerin, merkezi sinir sistemi korumasını immün hücre infiltrasyonu saldırısı sırasında mı yoksa immün hücre infiltrasyonunun baskılanmasının bir sonucu olarak mı sergilediğini belirlemektir. Bu yöntem, nöral immünolojik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, EAE tedavi sürelerinin manipüle edilmesinin, immün hücre infiltrasyonu ile koruma üzerindeki etkileri nasıl farklılaştırdığı gibi.Bu tekniğin etkileri, günümüzde bu hastalık için nöroprotektif tedavilerin bulunmaması nedeniyle multipl skleroz tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, EAE farelerinin sistem Xc-transporter inhibitörü ile tedavisinin hem nöroprotektif hem de immünomodülatör olduğunu keşfettiğimizde edindik. Bu yöntem ilaç tedavilerini incelemek için kullanılabileceği gibi, EAE veya diğer manipülasyonlara tabi tutulmuş genetik nakavt farelerin kullanıldığı çalışmalara da uygulanabilir.Steril makaslar kullanarak her bir hayvandan alınan beyin ve omurilik dokularını küçük parçalar halinde kıyarak başlayın. Ardından, her bir doku örneğini bireysel 50 mililitre konik tüpler içindeki ayrı 70 mikron hücre süzgeçlerinden geçirmek için doku başına bir adet üç mililitre şırınga pistonu kullanın ve bu sırada süzgeçleri besiyeri ile durulayın. Tüm parçalar masere edildiğinde, tüplerdeki son hacmi taze besiyeri ile 50 mililitreye tamamlayın ve ardından hücre süspansiyonlarını santrifüjleyin.Her bir peleti dört mililitre %40'lık yoğunluk gradyanı çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik konik tüplerin çeperlerinden yavaşça süzerek, tüp başına iki mililitre %70'lik yoğunluk gradyanı çözeltisinin üzerine dikkatlice ekleyin. Hücreleri santrifüjle ayırın ve üstteki miyelin tabakalarını dikkatlice uzaklaştırmak için bir mililitrelik transfer pipetleri kullanın.Ardından, canlı hücreleri örnek arayüzlerinden yeni 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri tüp başına 15 mililitrelik taze besiyeri içeren nihai bir hacimde yıkayın. Peletleri 200 mikrolitre taze besiyerinde yeniden süspande edin ve hücre süspansiyonlarını 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Plakayı santrifüjleyin ve süpernatanları dışarı atın.Ardından, peletleri 200 µL restimülasyon ortamında yeniden süspande edin ve hücreleri 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, plakayı tekrar santrifüjleyin ve süpernatanları uzaklaştırın. Sonra hücreleri %2 FCS ile desteklenmiş 200 µL PBS ile yıkayın ve hücreleri %2 FCS ve FC-block ile desteklenmiş 200 µL PBS içinde buz üzerinde 10 ila 15 dakika boyunca yeniden süspande edin.İnkübasyonun sonunda, hücreleri az önce gösterildiği gibi yıkayın ve peletleri 15 µL hücre yüzeyi boyama kokteyli içinde buz üzerinde 15 dakika boyunca yeniden süspande edin. Ardından hücreleri santrifüjle çöktürün ve örnekleri 200 µL PBS ile iki kez yıkayın. Sonrasında hücreleri, üretici talimatlarına uygun olarak FOXP3 transkripsiyon faktörü boyama reaktiflerinde 4 °C'de 30 dakikadan bir geceye kadar yeniden süspande edin.İnkübasyonun sonunda, hücreleri 150 µL permeabilizasyon tamponu ile yıkayın. Ardından hücreleri santrifüjleyin ve pelletleri, buz üzerinde 15 µL permeabilizasyon tamponu içindeki ilgili hücre içi antikorlarda yeniden süspande edin. 30 dakika sonra, hücreleri çöktürün ve ardından 200 µL permeabilizasyon tamponu ile üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra, peletleri 200 µL PBS içinde yeniden süspande edin ve canlı CD4-pozitif, TCR beta-pozitif hücrelere kapı ayarı (gating) yaparak örnekleri akış sitometrisi ile analiz edin. Periferik T hücresi proliferasyonunu değerlendirmek de önemlidir çünkü periferideki değişiklikler, MSS'ye immün hücre infiltrasyonunu etkileyebilir. EAE indüksiyonu sonrası spinal kord doku örneklerinde bulunan astrosit ve glial hücre sayısını belirlemek için, her kesitin 4x büyütmede görüntülerini alın ve görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydedin.Ardından ImageJ'de, ilgili görüntüyü seçin ve tüm spinal doku kesitini çizmek için poligon seçim aracını kullanın. Görüntü (image) menüsü altından, görüntüyü 16-bit'e dönüştürmek için tür (type) ve ardından 16-bit seçeneğini belirleyin. Sonra, işlem (process) menüsünü açın ve yuvarlanan top yarıçapını (rolling ball radius), arka planın parçası olmayan en büyük nesnenin boyutundan daha büyük olacak şekilde ayarlamak için arka planı çıkar (subtract background) seçeneğini seçin.Kayan paraboloidi kontrol edin ve Tamam'a tıklayın. Ardından, görüntü (image) sekmesi altında, ayarla (adjust) ve eşik değerini (threshold) seçin ve alt eşik seviyesini ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın. Seçili bölge içindeki eşiklenmiş alanın yüzdesini elde etmek için, analiz et (analyze) ve ölçümleri ayarla (set measurements) sekmesi altında, alan fraksiyonunu (area fraction) seçin. Eşiğe sınırla (limit to threshold) seçeneğinin işaretli olmadığından ve etiket görüntüsünün (display label) işaretli olduğundan emin olun ve Tamam'a tıklayın. Ölçümleri elde etmek için, analiz et (analyze) sekmesi altında, ölç (measure) seçeneğini seçin.Bir sonuç açılır penceresi görünecektir. Bu verileri kaydedin ve tedavi grupları arasındaki alan fraksiyonu değerlerini karşılaştırın. Miyelin temel boyamasını optik yoğunlukla nicelleştirmek için, ilgili görüntüyü açın ve örnek içerisinde bir ilgi alanı çizmek için poligon kesitler aracını kullanın.Analyze and set measurements altında, mean gray value seçeneğini belirleyin; limit to threshold kutucuğunun işaretlenmediğinden ve display label kutucuğunun işaretlendiğinden emin olun. OK düğmesine tıklayın. Ardından, analyze menüsü altından measure seçeneğini belirleyin. Miyelin temel protein mean gray value verilerini içeren yeni bir sonuç açılır penceresi görünecektir.Omurilik çıkarımı ve akış sitometrik analiz, immün hücre infiltrasyonunun hastalığın zirvesinde maksimum olduğu merkezi sinir sistemi immün hücre infiltrasyonunun değerlendirilmesine olanak tanır. CD4-pozitif, interferon gama-pozitif, IL-17-pozitif ve FOXP3-pozitif hücre sayılarının istatistiksel analizi, ilaçla tedavi edilen hayvanlarda kontrol hayvanlarına kıyasla CD4-pozitif infiltre olan T hücresi sayılarında gözlemlenen değişikliklerin anlamlılığını ortaya çıkarabilir; burada, CD4-pozitif infiltre olan T hücresi sayısındaki genel azalmada yanılma payının (skewing) bir karıştırıcı faktör olarak elenmesi için derinlemesine koekspresyon analizi esastır. Merkezi sinir sistemine infiltre olan T hücrelerindeki azalmanın periferdeki proliferasyon, aktivasyon ve diferansiyasyonun inhibe edilmesinin bir sonucu olma olasılığını ortadan kaldırmak için, aktif olarak prolifere olan T hücrelerinin sayısı ve T hücresi alt tiplerinin oranı değerlendirilebilir.Miyelin bütünlüğünün kantitatif değerlendirmesi için, örneğin, miyelin temel protein boyamasının optik yoğunluğunun istatistiksel analizi yapılabilir; bu analiz, belirtilmemiş genetik nakavt hayvanlarda, yabani tip kardeşlerine kıyasla omurilik dokusunda anlamlı bir demiyelinizasyon olduğunu ortaya koyabilir. Nöroenflamasyonun terapötik müdahalelerle sürdürüldüğünü veya azaldığını daha fazla kanıtlamak için, reaktif gliozun ortalama fraksiyon alanı az önce gösterildiği gibi ölçülerek reaktif glioz da değerlendirilebilir. Uzmanlaşıldığında, düzgün bir şekilde yürütüldüğü takdirde akış sitometrisi tekniği iki günde tamamlanabilirken, doku boyamasının kantifikasyonu boyama başına yaklaşık iki saatte gerçekleştirilebilir.İmmünomodülasyon, T hücrelerindeki migratuar ve proliferatif değişiklikleri nicelleştirmek için tedavilerin immün hücre infiltrasyonundan önce uygulanmasıyla değerlendirilebilir. MSS koruması ise, immün hücrelerin MSS'ye zaten infiltre olduğu hastalığın pik evresi sırasında tedavilerin uygulanmasıyla değerlendirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, sadece hücresel boyamanın spesifik olarak vurgulanması için ImageJ'de optimum eşik ayarlarının değerlendirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Bu videoyu izledikten sonra, immün hücre infiltrasyonu öncesindeki ve sonrasındaki tedavi sürelerini değiştirerek, belirli tedavilerin merkezi sinir sistemi, T hücresi proliferasyonu ve migrasyon yanıtları üzerindeki etkilerinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

determining-immune-system-suppression-versus-cns-protection-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bazı fare suşlar miyelin temel protein olan deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) indüksiyon karşı edebiliyoruz. Burada anlatılan yanıtsızlık tersine çevirir ve birkaç tipik EAE dirençli fare lekeler paralitik hastalığın neden basit bir bağışıklama protokoldür.

Kabul edilmiş Transfer ve antijenik Challenge Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis (EAE) Dayanıklı Fare Suşlarında yanıtsızlık Aşmak

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Demiyelinizan hastalıklar, lizolesitinin CNS'ye fokal olarak uygulanmasıyla hayvanlarda modellenebilir. Fare omuriliğine tek bir lizolesitin enjeksiyonu, zamanla kendiliğinden onarılan bir lezyon oluşturur. Amaç, de- ve remiyelinizasyon ile ilgili faktörleri incelemek ve onarımı geliştirmek için ajanları test etmektir.

Lisolesitin Odak Enjeksiyon Deneysel Demyelizasyon ve Kemirgen Omurilik remiyelinizasyon

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte açıklamaktadır.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Mevcut protokol, farelerde stabil ve tekrarlanabilir bir demiyelinasyon modeli oluşturmak için stereotaksik bir çerçeve yoluyla iki noktalı bir lizofosfatidilkolin enjeksiyonunu tanımlamaktadır.

Farelerde Lizofosfatidilkolin Kaynaklı Fokal Demiyelinasyon Modelinin Stably Olarak Kurulmuş İki Noktalı Enjeksiyonu

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl sklerozun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Bu makalede EAE'de spinal kord inflamasyonu, demiyelinizasyon ve aksonal yaralanmayı skorlamaya yönelik bir yaklaşım anlatılmaktadır. Ek olarak, canlı farelerde aksonal hasarın değerlendirilmesini kolaylaştıran, fare serumundaki çözünür nörofilament ışık seviyelerini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitte Merkezi Sinir Sistemi İnflamasyonu, Demiyelinizasyon ve Akson Hasarının Skorlanması

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Öğrenin, farmakolojik müdahalelerin EAE modelinde immün hücre infiltrasyonunu baskılayarak mı yoksa nöroprotektif etkilerle mi CNS koruma sağladığını belirlemeyi. Bu yöntem, multipl skleroz tedavileri için kritik mekanizmaları açıklar.

Otoimmün demiyelinizasyonun Farmakolojik Müdahaleler için CNS Koruma karşı Belirlenmesi Bağışıklık Sistemi Bastırma

Daha fazla video keşfet