Otoimmün demiyelinizasyonun Farmakolojik Müdahaleler için CNS Koruma karşı Belirlenmesi Bağışıklık Sistemi Bastırma

Bu kavramsal yöntemin genel amacı, deneysel otoimmün ensefalomiyelit için farmakolojik tedavilerin, immün hücre infiltrasyonu saldırısı sırasında veya immün hücre infiltrasyonunun baskılanmasının bir sonucu olarak merkezi sinir sistemi korumasını gösterip göstermediğini belirlemektir. Bu yöntem, nöral immünolojik alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, EAE tedavi sürelerinin manipüle edilmesi, bağışıklık hücresi infiltrasyonu üzerindeki etkileri korumaya karşı nasıl farklılaştırır?

Bu tekniğin etkileri aynı zamanda multipl skleroz tedavisine de uzanmaktadır, çünkü şu anda bu hastalık için nöral koruyucu tedaviler yoktur. Bu yöntem için ilk olarak, EAE farelerini Xc-taşıyıcı sisteminin bir inhibitörü ile tedavi etmenin hem nöroprotektif hem de immünomodülatör olduğunu keşfettiğimizde aklımıza geldi. Bu yöntem ilaç tedavilerini incelemek için kullanılabilse de, EAE veya diğer manipülasyonlara maruz kalan genetik nakavt fareleri kullanan çalışmalara da uygulanabilir.

Tek tek hayvanlardan beyinleri ve omurilikleri küçük parçalara ayırmak için steril makas kullanarak başlayın. Daha sonra, süzgeçleri orta ile durularken, her bir numuneyi ayrı ayrı 70 mikron hücre süzgeçleri üzerinde ayrı ayrı 50 mililitrelik konik tüplere ezmek için doku başına üç mililitrelik bir şırınga pistonu kullanın. Tüm parçalar yumuşatıldığında, tüplerdeki son hacmi taze ortamla 50 mililitreye getirin, ardından hücre süspansiyonlarını santrifüjleyin.

Her peleti dört mililitre% 40 yoğunluklu gradyan çözeltisinde yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreyi, tüp başına iki mililitre% 70 yoğunluk gradyan çözeltisinin üzerine tek tek 15 mililitrelik konik tüplerin duvarlarından yavaşça aşağı doğru dikkatlice katmanlayın. Hücreleri santrifüjleme ile ayırın ve üst miyelin katmanlarını dikkatlice atmak için bir mililitrelik transfer pipetleri kullanın.

Daha sonra, canlı hücreleri numune arayüzlerinden yeni 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri, tüp başına 15 mililitre taze ortamın son hacminde yıkayın. Peletleri 200 mikrolitre taze ortamda yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonlarını 96 kuyulu yuvarlak bir alt plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Plakayı santrifüjleyin ve süpernatantları hafifçe vurun.

Daha sonra, peletleri 200 mikrolitre yeniden uyarılma ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri dört saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka işleminin sonunda, plakayı tekrar santrifüjleyin ve süpernatanları çıkarın. Daha sonra hücreleri% 2 FCS ile desteklenmiş 200 mikrolitre PBS'de yıkayın ve hücreleri% 2 FCS ve FC bloğu ile desteklenmiş 200 mikrolitre PBS'de buz üzerinde 10 ila 15 dakika boyunca yeniden süspanse edin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri gösterildiği gibi yıkayın ve peletleri 15 mikrolitre hücre yüzeyi leke kokteylinde buz üzerinde 15 dakika boyunca tekrar süspanse edin. Daha sonra hücreleri döndürün ve numuneleri 200 mikrolitre PBS'de iki kez yıkayın. Daha sonra, FOXP3 transkripsiyon faktörü boyama reaktiflerindeki hücreleri, üreticinin talimatlarına göre 30 dakika ila gece boyunca 4 santigrat derecede yeniden askıya alın.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri 150 mikrolitre geçirgenlik tamponunda yıkayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleyin ve ilgilenilen hücre içi antikorlardaki peletleri buz üzerinde 15 mikrolitre geçirgenlik tamponunda yeniden süspanse edin. 30 dakika sonra, hücreleri döndürün ve ardından 200 mikrolitre geçirgenlik tamponunda üç yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, peletleri 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve numuneleri canlı CD4 pozitif, TCR beta pozitif hücreler üzerinde geçit yaparak akış sitometrisi ile analiz edin. Periferik T hücresi proliferasyonunu değerlendirmek de önemlidir, çünkü periferdeki değişiklikler CNS'ye bağışıklık hücresi infiltrasyonunu etkileyebilir. EAE indüksiyonundan sonra omurilik dokusu örneklerinde bulunan astrositlerin ve glial hücrelerin sayısını ölçmek için, her bölümün görüntülerini 4x büyütmede elde edin ve görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydedin.

Ardından, ImageJ'de ilgilendiğiniz görüntüyü seçin ve tüm omurga dokusu bölümünü izlemek için çokgen seçimleri aracını kullanın. Görüntü menüsü altında, görüntüyü 16 bit'e dönüştürmek için tür ve 16 bit'i seçin. Ardından, işlem menüsünü açın ve yuvarlanan top yarıçapını en azından arka planın parçası olmayan en büyük nesnenin boyutuna ayarlamak için konu arka planını seçin.

Kayan paraboloidi kontrol edin ve Tamam'a tıklayın. Ardından, görüntünün altında ayarla ve eşiği seçin ve alt eşik seviyesini ayarlamak için kaydırma çubuklarını kullanın. Seçilen bölge içindeki eşikli alanın yüzdesini elde etmek için, Ölçümleri çözümle ve ayarla'nın altında alan kesri'ni seçin. Eşik sınırının işaretli olmadığından ve ekran etiketinin işaretli olduğundan emin olun ve ölçümleri almak OK.To tıklayın, analiz altında Ölçüm'ü seçin.

Bir sonuç açılır kutusu görünecektir. Bu verileri kaydedin ve tedavi grupları arasındaki alan fraksiyon değerlerini karşılaştırın. Miyelin temel boyamayı optik yoğunluğa göre ölçmek için, ilgilenilen görüntüyü açın ve numune içinde bir ilgi alanı çizmek için çokgen bölümler aracını kullanın.

Ölçümleri analiz et ve ayarla altında, ortalama gri değeri seçin ve eşik sınırının işaretli olmadığını ve ekran etiketinin işaretli olduğunu onaylayın. Tamam'a tıklayın. Ardından, analiz menüsünde ölçü'yü seçin. Miyelin temel protein ortalama gri değer verilerini içeren yeni bir sonuç açılır kutusu görünecektir.

Omuriliğin çıkarılması ve akış sitometrik analizi, hastalığın zirvesinde bağışıklık hücresi infiltrasyonunun maksimum olduğu merkezi sinir sistemi bağışıklık hücresi infiltrasyonunun değerlendirilmesine izin verir. CD4 pozitif, interferon gama pozitif, IL-17 pozitif ve FOXP3 pozitif hücre sayılarının istatistiksel analizi, ilaçla tedavi edilen hayvanlarda CD4 pozitif sızan T hücre sayılarında gözlenen değişikliklerin önemini ortaya çıkarabilir, kontrol hayvanlarına karşı, CD4 pozitif sızan T hücre sayısının genel olarak azaltılmasında kafa karıştırıcı bir faktör olarak çarpıklığı dışlamak için gerekli olan derinlemesine ortak ifade analizi ile. Merkezi sinir sistemine sızan T hücrelerindeki bir azalmanın, periferdeki proliferasyon, aktivasyon ve farklılaşmanın inhibe edilmesinin bir sonucu olma olasılığını ortadan kaldırmak için, aktif olarak çoğalan T hücrelerinin sayısı ve T hücresi alt tiplerinin oranı değerlendirilebilir.

Miyelin bütünlüğünün kantitatif değerlendirmesi için, miyelin bazik protein boyamasının optik yoğunluğunun istatistiksel analizi yapılabilir, bu da örneğin, vahşi tip yavrulara kıyasla belirtilmemiş genetik nakavt hayvanlarda omurilik dokusunun önemli bir demiyelinizasyonunu ortaya çıkarır. Nöroinflamasyonun terapötik müdahalelerle sürdürüldüğünü veya azaldığını daha fazla kanıtlamak için, reaktif gliozis, az önce gösterildiği gibi reaktif gliozis için ortalama fraksiyon alanı ölçülerek de değerlendirilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, akış sitometrik tekniği düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse iki gün içinde tamamlanabilirken, doku lekelenmesinin nicelleştirilmesi leke başına yaklaşık iki saat içinde gerçekleştirilebilir.

İmmünomodülasyon, T hücrelerindeki migrasyon ve proliferatif değişiklikleri ölçmek için immün hücre infiltrasyonundan önce tedavilerin uygulanmasıyla değerlendirilebilir. CNS koruması, bağışıklık hücrelerinin CNS'ye zaten sızdığı hastalığın zirvesi sırasında tedavilerin uygulanmasıyla değerlendirilebilir. Bu prosedürü denerken, yalnızca hücresel boyamanın belirli bir şekilde vurgulanması için ImageJ'deki optimum eşik ayarlarını değerlendirmeyi unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, belirli tedavilerin merkezi sinir sistemi, T hücresi proliferasyonu ve göç tepkileri üzerindeki etkilerini nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bağışıklık hücresi infiltrasyonundan önceki ve sonraki tedavi sürelerini değiştirerek.