ve Otomatik Analizi C. elegans Deniz Davranışı
7 Aralık 2016
sıvı içinde nematod yüzme davranış bilgisayar tabanlı analiz için etkin ve basit bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem C. elegans laboratuarlar için hiçbir yatırım çok az gerektirir. kullanılan donanım standart ve davranışsal analizi (Celest) için bilgisayar yazılımı açık kaynak kodlu bir tanesidir.
Bu metodolojinin genel amacı, C.Elegans Yüzme Testi için CeleST adlı Bilgisayarla Görme yazılımını kullanarak C.Elegans yüzme davranışını nicel olarak değerlendirmektir"Bu analiz yöntemi, genetik mutasyonların veya farmakolojik müdahalelerin C.elegans yüzme davranışı üzerindeki etkisini ele almaya yardımcı olabilir. Ayrıca lokomotif kapasitelerindeki yaşa bağlı düşüşü de kolayca puanlayabilir. Bu tekniğin temel avantajları, birden fazla hayvanın aynı anda izlenebilmesi, yüzme duruşunun farklı yönlerinin sekiz yüzme davranışı parametresini puanlamak için analiz edilmesi ve otomatik veri değerlendirmesidir.
C.Elegans yüzme davranışı analizi için bir stereo mikroskop ve dijital CCD kameranın yanı sıra dijital video kayıt yazılımı ve bilgisayarla görme yazılımı olan bir bilgisayar edinerek başlayın. Dijital video kayıt yazılımında aşağıdaki ayarları yapın: Mikroskop slaytındaki yüzme bırakma alanında parlamayı önlemek ve görüntü kalitesini iyileştirmek için mikroskobu koyu renkli bir bezle örtün. Mikroskobun çalışma mesafesini ve büyütmesini yüzme alanının tam görünümüne ayarlayın ve hayvanların arka plana karşı keskin bir kontrast elde etmek için taban aynasını ayarlayın.
Ardından, yetişkinlerin bedenlerini siyah bir arka plana karşı beyaz olarak görselleştirmek için aydınlatmayı karanlık alana ayarlayın. Ardından, 60 mikrolitre 1 x M9 tamponu, bir mikroskop lamı üzerine önceden basılmış 10 milimetrelik bir halkaya pipetleyin ve damlanın halkanın iç alanını tamamen kapladığından emin olun. Dört yetişkin nematodunu 1 x M9 tampon damlasına aktarırken, sıvıyı bulanıklaştırabilecek bakterilerin taşınmasını en aza indirin.
Nematodların transfer edilmeden önce plakanın oturmamış bir bölgesinde kısa bir süre sürünmesine izin vererek veya kaydetmeden önce küçük bakteri izlerini dağıtmak için yüzmeyi iyice karıştırarak yüzmedeki bakterileri en aza indirin. Ardından, sıvı içindeki yüzme davranışlarını 30 saniyelik videolarda kaydetmek için yetişkin nematodlarla dolu slaytı mikroskobun tabanına yerleştirin. Kaydetmek için, Ana Sayfa başlığı altında RAM'de Yeni Dizi'yi seçin, ardından kırmızı kayıt düğmesine basın.
Son olarak, kayıt tamamlandıktan sonra, Ana Sayfa başlığını seçin ve Tam Sırayı Dışa Aktar, videoyu bir dizi görüntü karesine bölmek için. Çalıştır düğmesine tıklayarak Mat Lab'den C.elegans yüzme davranışı analizi için Bilgisayarla Görme yazılımını başlatarak başlayın. Yüzme analiz programının ana ekranında, genotip, tarih, deneme ve süre gibi ilgili etiketleri eklerken görüntü kareleri dizilerini birer birer veya gruplar halinde yüklemek için Bir video ekle veya Birden çok video ekle" düğmelerini kullanın.
Ardından, yüklenen dizilerdeki birden fazla hayvanın aynı anda izlenmesini etkinleştirmek için Videoları işle"ye tıklayın. Görünen yeni ekranda, soldaki kutudan istediğiniz videoları seçin ve tıklayın Listeye ekle"Ardından, halkanın içinde üç nokta seçerek yüzme bölgesini ayırın ve Yukarıda listelenen tüm videoları işle'ye tıklayarak işlemeye başlayın. Ekranın orta alt kısmında video işlemenin ilerlemesini görüntüleyin.
Tamamlandıktan sonra video işleme ekranını kapatın. Tek bir hayvanın izlenmesini doğrulamak veya reddetmek için işlenen videoların birer birer yüklenebileceği yeni bir ekran açmak için Hesaplama önlemlerine tıklayarak başlayın. Kırmızı bloklarda gösterilen kaçırılan izleme alanlarına odaklanmak ve yeşil bloklarda belirtilen başarılı izlemenin kontrastını oluşturmak için bu manuel adımı kullanın.
Segmentli gövdenin Geçerliliğini", alt yarıdaki ekran boyunca uzanan ilk renk çubuğunda bulun. Geçerli karelerin yüzdesinin yeşil olduğunu ve reddedilen karelerin yüzdesinin kırmızı olduğunu unutmayın. Ardından, bir sonraki bloğu kullanarak geçerli veya reddedilen çerçeve bloklarında gezinin ve değiştirin, Geçerliliği değiştir "Bloğu böl" ve Çerçeveyi izole et" seçenekleri.
Kalabalık olmayan bir yüzme bölgesinde iki hayvanın yolunun kesiştiği nadir bir durumda, Değiştir" düğmesiyle kimlik numaralarını belirli bir çerçeve aralığı üzerinde değiştirin. Son olarak, işlenmiş başka bir videoyu yüklemeden önce geçerlilik girişini kaydetmek için Ölçüleri kaydet ve hesapla'ya tıklayın. Ardından Hesaplama Ölçüleri ekranından çıkmak için Kapat'ı seçin.
Yazılımın, arka planda tek tek hayvanların yüzme performansının eğrilik haritalarını ve daha sonra belirtilen sekiz parametreyi hesapladığını unutmayın. Computer Vision yazılım programının Giriş Ekranında, analiz çıktısını almak için Sonuçları görüntüle'ye tıklayın. Ardından, soldaki kutuda istenen analiz edilen çerçeve dizilerini seçerek ve bunları Seçili örneğe ekle veya Yeni bir örneğe ekle" düğmelerine tıklayarak mevcut daha yeni bir örnek grubuna taşıyarak istatistiksel işlem için örnek grupları oluşturun.
Ekranın üst kısmındaki seçime göre sekiz parametrenin her biri için örneklerin grafiklerini ve temel istatistiklerini görüntüleyen ikinci bir ekrana gitmek için Bu örnekler için grafikleri göster"e tıklayın. Ardından, X eksenindeki ölçüm aracılığıyla herhangi iki parametrenin kombinasyonlarını çizmek için 2D histogramları seçin ve ekranın solundaki Y ekseni açılır menülerinde ölçün. Çıkmak ve Sonuçları Görüntüle ekranına dönmek için "Kapat"a tıklayın.
Ardından, ayrıntılı sayısal verileri bir elektronik tablo programında açmak ve daha fazla değiştirmek üzere bir csv dosyası olarak kaydetmek için ekranın sol üst köşesindeki dışa aktar düğmesini seçin. Son olarak, Sonuçları Görüntüle ekranından çıkmak ve ana ekrana geri dönmek için "Kapat"ı seçin. Analiz edilen video dizilerini içeren veritabanının kaydedilmesini sağlamak için Çık'a tıklayın.
Dalga başlatma hızı, aktivite indeksi, fırça darbesi ve seyahat hızı gibi belirli yüzme parametreleri, uygun genetik geçmişlerde bile yaşla birlikte yavaş yavaş azalmıştır. Öte yandan, vücut dalga sayısı, asimetri, esneme ve kıvrılma parametreleri, vahşi tip ve yaşlanan mutant yetişkinlerde yaşla birlikte artış eğilimi göstermiştir. Tüm nematodlar sağlıklı yetişkinler olarak başlasa da, bazıları fiziksel uygunluklarını hızla kaybederken, diğerleri daha uzun süre canlılığını korur, bu da kötü yaşlıların zarif yaşlılardan çok daha kısa bir sağlık süresine sahip olduğunu gösterir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, dört yüzme solucanının analizi birkaç dakika içinde elde edilebilir. Hesaplama video başına yaklaşık altı dakika sürer ve uzaktan yapılabilir. Günde 250 hayvanı işlemek mümkün.
Bu videoyu izledikten sonra, yüzme denemelerinin videolarının nasıl elde edileceğini ve sıvıdaki hareketin değerlendirilmesini elde etmek için verilerin nasıl işleneceğini iyi anlamalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, açık kaynaklı CeleST yazılımını kullanarak C. elegans'ın yüzme davranışını analiz etmek için basit bir metodoloji sunmaktadır. Yaklaşım maliyet etkindir ve standart laboratuvar ekipmanlarını kullandığından, çeşitli araştırma ortamları için erişilebilirdir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranışsal analiz
- Genetik
Arka Plan
- C. elegans, genetik ve davranışsal çalışmalarda yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır.
- Yüzme davranışının anlaşılması, genetik mutasyonların ve farmakolojik müdahalelerin etkileri hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Lokomotor kapasitelerdeki yaşa bağlı değişiklikler nicel olarak değerlendirilebilir.
- Bilgisayarlı görü teknikleri, davranışsal analizin hassasiyetini artırır.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans yüzme davranışını nicel olarak değerlendirmek için bir yöntem geliştirmek.
- Genetik ve çevresel faktörlerin yüzme davranışı üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Lokomosyondaki yaşa bağlı azalmanın analizini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Video kaydı için stereo mikroskop ve dijital CCD kamera kullanımı.
- Yüzme davranışlarını takip etmek ve analiz etmek için CeleST yazılımının uygulanması.
- Kontrollü bir ortamda, minimum bakteriyel girişim ile yüzme davranışlarının kaydedilmesi.
- Temel davranışsal parametreleri çıkarmak ve istatistiksel analizler oluşturmak için video verilerinin işlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Kapsamlı analiz yapılmasına olanak tanıyan birden fazla C. elegans aynı anda takip edilebilir.
- Belirli yüzme parametrelerinde yaşa bağlı azalmalar gözlemlenmiştir.
- Bazı nematodların fiziksel zindeliklerini diğerlerinden daha uzun süre koruduğu görülmüş ve bu durum yaşlanmadaki değişkenliği göstermiştir.
- Yöntem, yüzme davranışının hızlı analizine imkan tanıyarak araştırma verimliliğini artırmaktadır.
Sonuçlar
- CeleST yazılımı, C. elegans yüzme davranışlarını analiz etmek için güçlü bir platform sunar.
- Bu metodoloji, genetik ve yaşlanma üzerine yapılan çalışmalara önemli katkılar sağlayabilir.
- Gelecekteki araştırmalar, diğer davranışsal ve fizyolojik soruları araştırmak için bu yaklaşımdan yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
C. elegans yüzme davranışının otomatik analizi, nöroaktif bileşik keşfi ve hedef doğrulaması için yüksek kapasiteli fenotipik taramaya olanak tanır. Sıvı ortamdaki lokomosyon parametrelerini nicelleştiren bu yöntem, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir bir model sistemde genetik ve farmakolojik müdahalelerin mekanistik risklerinin azaltılmasını destekler. Bu yaklaşım, davranışsal çıktıları nöronal devre fonksiyonlarıyla ilişkilendirerek erken keşif aşamasındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Genetik mutantlarda nöromüsküler fonksiyonun kantitatif değerlendirmesi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yüzlerce hayvanda sekiz yüzme davranışı parametresini eş zamanlı olarak takip ederek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Lokomotor kapasitedeki yaşa bağlı azalmayı değiştiren bileşikleri tanımlayarak portföy elemesine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Standartlaştırılmış yüzme bölgesi belirleme ve otomatik takip aracılığıyla, aşağı akış iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemleri hazırlar.
- Kantitatif Çıktılar: Eşik değer kesmeleri olmaksızın eğrilik haritaları ve sekiz postür tabanlı parametre oluşturarak güvenilir bileşik değerlendirmesi sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Uzaktan hesaplama ile günde 250 hayvanı işleyerek, platformun farklı tarama kampanyaları boyunca yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Yaşa bağlı parametre eğilimleri aracılığıyla yüzme davranışı fenotiplerini yaşlanma ve nörodejenerasyon modellerine bağlar.
- Translasyonel Süreklilik: İş akışları boyunca tutarlı davranışsal çıktıların sağlanmasıyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya geçişte köprü kurar.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: İyi karakterize edilmiş genetik arka planlarda yeni fenotipler ortaya çıkararak git/gitme kararlarına veri sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, mekanistik anlayışı ve bileşik önceliklendirmesini destekleyen kantitatif davranışsal okumalar sağlayarak, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Yüzme duruşunun ve hareket dinamiklerinin otomatik analizi aracılığıyla hipotez testlerini ve yolak netleştirmeyi destekler.
- Tarama: Eş zamanlı çoklu hayvan takibi ve standartlaştırılmış video işleme yoluyla analiz hazırlığı ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Analitik: Sekiz parametrenin her biri için istatistiksel çıktılar ve temel istatistikler sunarak koşullar arası karşılaştırmaya olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Lokomosyon kaybı seyirlerindeki yaşa bağlı biyobelirteç hizalaması aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje ve terapötik alan boyunca davranışsal tarama için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Nöromüsküler fonksiyonla ilgili mekanistik belirsizliğin azaltılması yoluyla hedef doğrulamada öngörücü güven.
- Operasyonel Değer: Otomatik veri değerlendirmesi ve minimum manuel müdahale ile standardizasyon, tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik.
- Stratejik Değer: Erken fenotipik risk azaltma yoluyla daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Kantitatif yüzme davranışı eşiklerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerletme kararları.
Uygulama Hususları
- Bilgisayarlı görü yazılımı kullanımı ve C. elegans tutma konusunda uzmanlık gerektirir.
- Stereo mikroskop, dijital CCD kamera ve video yakalama ile analiz için CeleST yazılımına sahip bir bilgisayar gereklidir.
- Yüzme bölgesi sınırlandırması ile genotip, tarih, deneme ve süre için video etiketlemesinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Sıvı tabanlı lokomosyon analizlerine olan bağımlılık nedeniyle model sistemler arası adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Görüntü kalitesini korumak için yüzme kuyucuklarındaki bakteriyel kontaminasyonun minimize edilmesi gerekliliği gibi pratik kısıtlamaları içerir.
