Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Bu hemojenik indüksiyon protokolünün genel amacı, transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare fibroblastlarında bir gelişimsel süreci başlatarak, uzun süreli kültür sonrası hematopoetik hücreler üreten in vitro hematopoetik öncül hücreler oluşturmaktır. Bu yöntem, hematopoetik programlama alanındaki, çok hatlı ve nakil kapasitesine sahip gerçek HSC'leri de novo elde etmek için bir protokol geliştirilip geliştirilemeyeceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu sayesinde, gelişimsel sürecin pluripotent bir ara aşamadan geçmeyi gerektirmeyen yeniden programlanmış hücrelerde başlatılabilmesidir.

Fare embriyonik fibroblastlarını veya MEF'leri kültürele aldıktan ve metin protokolüne göre virüs ürettikten sonra, 6 kuyucuklu plakaları önceden kaplamak için PBS içinde %0,1 jelatin kullanın. Jelatinin kuyucuğun tüm alanını kapladığından emin olun. Plakaları en az 20 dakika boyunca 37 °C'lik inkübatörde bekletin.

Ardından plakaları çıkarın ve jelatini aspire edin. MEF'leri kuyu başına 25, 000 hücre yoğunluğunda standart DMEM ile ekin ve hücrelerin 37 °C'de gece boyunca çökelmesini sağlayın. 50 µL M2RTTA ile GATA2, GFI1B, CFOS ve ETV6'nın her birinden 12,5 µL karıştırarak 100 µL'lik bir virüs kokteyli hazırlayın.

MEFS'lerdeki ortamı aspire edin ve 8 µg/mL heksadimetrin bromür içeren iki mililitre standart DMEM ekleyin. Ardından, MEF'lerin bulunduğu her bir kuyuğu 15 µL virüs kokteyli ile transduk edin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. 16 ila 20 saatlik inkübasyonun ardından, her kuyuktaki ortamı, 1 µg/mL DOX ile takviye edilmiş iki mililitre taze standart DMEM ile değiştirin.

37 °C'de üç gün boyunca inkübe edin. Dördüncü günde; hidrokortizon, kök hücre faktörü, MFS ile ilişkili tirozin kinaz üç ligandı, interlökin üç, interlökin altı ve DOX ile desteklenmiş hematopoetik kültür ortamı hazırlayın. Ardından, MEF'lerdeki ortamı aspire edin ve hücreleri yıkamak için 1 mL PBS kullanın.

Ardından, PBS'yi aspire ettikten sonra, hücreleri ayırmak ve toplamak için her kuyucuğa bir mililitre %0,05 tripsin ekleyin. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardından 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin ve hücreleri yeniden süspand etmek için yeni hazırlanan 12 mililitre hematopoetik ortamı kullanın. Daha sonra, jelatin kaplı altı kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 10.000 hücre ekin.

Kültür süresi boyunca her altı günde bir, besiyerini taze takviyeli hematopoetik kültür besiyeri ile değiştirin. Hücreleri metin protokolüne göre analiz edin. Gebe farelerden plasentaları metin protokolüne uygun olarak çıkardıktan sonra, dokuyu yıkamak için %20 FBS içeren PBS içinde %0,2 kollajenaz tip bir'in iki ila beş mililitresini kullanın ve beş mililitrelik bir şırıngaya takılmış 18 gauge iğne kullanarak dokuyu PBS solüsyonu içinde mekanik olarak ayrıştırın.

Plasenta hücrelerini, 37 °C'de 1,5 saat boyunca iki ila beş mililitre kollajenaz çözeltisi içinde inkübe edin. Ardından, hücreleri mekanik olarak daha fazla ayrıştırmak için 5 mililitrelik şırıngalara takılı 20 ila 25 gauge iğnelerden birkaç kez geçirin. Son olarak, tek hücre süspansiyonlarını 70 mikronluk hücre süzgeçlerinden filtreleyin.

Ardından, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve mitotik inaktivasyon için 2.000 centigray volt ile ışınlayın. Aşağıdakilerle desteklenmiş on mililitre hematopoetik kültür ortamını on santimetrelik bir kaba ekleyin. 0,65 mikronluk filtreyi, bir sıvı-gaz ara yüzey oluşturmak için yüzeyde yüzmesini sağlayarak doğrudan kaptaki kültür ortamının üzerine yerleştirin ve kabı kenara alın.

Bu videonun önceki bölümlerinde gösterildiği gibi, 25. gündeki transduksiyon yapılmış MEF'leri ayrıştırın ve 33.000 adet transduksiyon yapılmış MEF'yi, mitotik olarak inaktive edilmiş 167.000 plasental agregat hücresi ile karıştırın. Bir agregat oluşturmak için, MEF ve plasental hücre karışımını 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Besiyerini aspire edin ve çökelmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için 30 ila 50 µL standart DMEM kullanın; ardından tek hücre süspansiyonunu 200 µL'lik küt uçlu olmayan bir pipet ucuna çekin.

Ardından, parafin film ile pipet ucunu kapatın. Daha sonra, kapatılmış ucu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve ucun kapalı ucunda bir pelet oluşması için 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ucu 15 mililitrelik tüpten dikkatlice çıkarın ve bir P200 pipetin ucuna yerleştirin.

Parafin filmi atın ve hücre peletini, kültür ortamı dolu kapta yüzen filtrenin üzerine itin. Agregatları, yüzen filtreler üzerinde 37 °C ve %5 karbondioksit altında dört ila beş gün boyunca kültürleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak agregatları toplayın, ardından bunları birleştirin ve sindirmek için %0,5 kollajenaz kullanın.

Disosiyasyondan sonra, agregatları yıkamak için yüzde beş FBS içeren iki ila beş mililitre PBS kullanın ve 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Agregatları, FBS, Pen-Strep veya L-glutamin içermeyen 500 µL DMEM içinde yeniden süspanse edin. Köpük oluşumunu dikkatlice önleyerek, tüm süspansiyonu mililitre başına on ng Tepo ile desteklenmiş yüzde bir metilselüloz ortamının üç mililitresine ekleyin.

CFU analizleri için bu karışımdan eşit hacimleri üç adet, 35 x 10 mm'lik işlem görmemiş kültür kabına ekleyin. Kontrol olarak, ışınlanmış plasental agregatları kültüre edin. Son olarak, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren ortamda 10 ila 14 günlük kültürden sonra hematopoetik kolonileri mikroskop altında manuel olarak sayın.

MEF'lerin HSC'lere yeniden programlanması sürecinde, hücreler burada gösterildiği gibi transkripsiyon faktörleri ile transduse edilir. Üç günlük genişletme ve transgen aktivasyonunu başlatmak için DOX maruziyetinin ardından, hücreler disosiye edilir, bölünür ve jelatin kaplı plaklarda takviye edilmiş hematopoetik ortamda büyütülür. Kültürdeki 20. günde, yeniden programlama ortamı ile transdüksiyon sonrası, 34/H2BGFP MEF'ler, MEF'lerden farklı olan endotel morfolojisi dahil olmak üzere belirgin morfolojik değişiklikler gösterir.

35. güne kadar devam eden kültürleme, endotelyal benzer ara formlardan ortaya çıkan; GFP pozitif olan ve hematopoetik belirteçler Sca1 ve CD45 için pozitif boyanan birçok yuvarlak hematopoetik benzer hücrenin oluşmasıyla sonuçlanır. Kültürlemeye devam edildiğinde, insan CD34 raporer ekspresyonunu koruyan ve aynı zamanda CD45 eksprese eden hücreler elde edilir. Plasental agregasyon üzerine, kültür hücreleri klonojenik potansiyel kazanır ve çeşitli hematopoetik morfolojiler ile blast benzeri hücreler içeren kolonileri metilselüloz içerisinde oluşturur.

Bu prosedürü uygularken, karışıklık yaşamamak için her bölümü yavaşça gerçekleştirmenin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Herhangi bir hata, yeniden programlamaya başladıktan haftalar sonrasına kadar fark edilmesi güç olacaktır. Bu prosedürün ardından, türetilen hücrelerin fonksiyonel analizlerde gösterildiği gibi gerçekten hematopoetik işleve sahip olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için cobblestone-forming hücre analizleri ve uzun süreli kültür başlatan hücre analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, hematopoetik kök hücre programlama alanındaki araştırmacılar; kan, endotel ve diğer hücre tiplerinde farklı yeniden programlama stratejilerini ve optimizasyon protokollerini keşfetme imkanına kavuşmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, fare fibroblastlarında hemojenik bir programın nasıl indükleneceği, transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu ve türetilen hücrenin fonksiyonel olarak nasıl analiz edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.