Name: Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Öğrenin fare embriyonik fibroblastları transkripsiyon faktörleriyle yeniden programlayarak hematopoietik öncü hücreler üretmeyi. Bu yöntem, çok soylu ve greft yeteneğine sahip HSC'ler elde etmek için plüripotent ara aşama gerektirmeden doğrudan bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, K.M. ve I.R.L.'ye (1RO1HL119404) bir NHLBI hibesi ile desteklenmiştir. Carlos-Filipe Pereira, Revson Kıdemli Biyomedikal Bursu'nun sahibi oldu. Materyaller ve protokoller konusunda yardım için Mount Sinai hESC/iPSC Ortak Kaynak Tesisine ve S. D'Souza'ya minnetle teşekkür ederiz. Ayrıca Mount Sinai Akış Sitometrisi, Genomik ve Fare tesislerine de teşekkür ederiz.

Etik bildirimi: Fare hücre hatları Sina Dağı&#39;nda Tıp Icahn Okulu hayvan bakım yönergeleri izleyerek elde edilir ve herhangi bir ev sahibi kurum ile uyumlu yapılmalıdır. C57BL / 6 fareleri 1. Fare Embriyonik fibroblast (MEF) İzolasyon <ol><li> Zamanlanmış çiftleşme 13 ayarlayın. vajinal fiş görüntülenmiştir sonra, bu Günü&#39;nü 0.5 düşünün. </li><li> Fiş tarihinde takılı kadın ayırın ve gebelik onaylamak için Gün 10-11 onları kontrol. </li><li> Gün 13,5-14,5 CO aracılığıyla servikal dislokasyon ardından 2 inhalasyon hamile dişi farelerin euthanize. </li><li> ,% 70 etanol ile hamile kadın karnı emmek orta hatta aşağı steril makas ve forseps ile karın boşluğuna incelemek ve cerrahi embriyoların 14 içeren rahim boynuzları kaldırın. Kalan karın dokusu kesilerek hafifçe embriyolar dışarı atın. NOT: her tarafta 4 ile yaklaşık 8 embriyolar kurtarın. </li><li> rahim h yerleştirinSteril soğutulmuş fosfat tamponlu tuz (PBS) 5-10 ml olan bir 10 cm tabak embriyoları içeren orns. </li><li> Steril makas ve forseps ile rahim boynuzları boyunca bir kesi embriyolar taşıyan keseleri izole yapmak. PBS soğutulmuş steril 5-10 ml yeni 10 cm çanak keseler aktarın ve buz üzerinde yerleştirin. </li><li> Steril soğutulmuş PBS 5-10 ml yeni 10 cm çanak içine keseler birkaç koyun. Steril makas ve forseps yavaşça embriyolar piercing önlemek için (çok derin kesmeden) keseleri açık kesti kullanma. </li><li> göbek bağını keserek plasentadan embriyolar ayırın. </li><li> soğutulmuş PBS 5-10 ml içeren yeni bir 10 cm&#39;lik çanak embriyo transferine ve kalan disseksiyonların tamamlarken buz üzerinde bırakın. </li><li> Steril forseps kullanarak embriyolar başını kesmek. Dikkatle karın açmak için dekapite alandan başlayarak steril makas ve forseps kullanarak embriyonun orta hatta aşağı kesti. Pozisyon t altında forsepso viseral organlar (kalp, karaciğer de dahil olmak üzere, ve akciğerler) ve 15 onları kazımak. </li><li> tripsin 10 ml içeren 50 ml&#39;lik konik tüp makas ve forseps ve transfer kullanarak küçük parçalar halinde kalan doku kesin. </li><li> Pipet yukarı ve 20-30 kez 10 ml&#39;lik pipet ile aşağı karıştırın ve doku ayırmak. </li><li> arada bir dönen, 45 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde doku ve tripsin karışımı inkübe edin. </li><li> Pipet yukarı ve aşağı doğru yaklaşık 5 dakika süre ile, 10 ml pipet ile karıştırılmaları için. </li><li> % 10 fetal bovin serumu ile standart Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) (FBS), hacmi 3x tripsinize edilmiş hücre ekleme 10 ug / ml penisilin / streptomisin (P / S), ve 1 mM L-glutamin (L-GLUT) &#39;de 10 cm&#39;lik kaplar (~ 10 mi) ve birleşik (yaklaşık 2-4 gün) kadar 37 ° C &#39;de kültür. 10 cm çanak başına 1-2 embriyolar hakkında Kültürü. NOT: plakalar kez Freeze hücreleri konfluent. Dondurulmuş hücreler çözündürüldü ve 2 kez daha geçirilmiştir edilebilir. Hücreler, diğer şekilde,çözüldükten sonra sonra bir kez daha dondurma öncesinde 2 defa bölünmüş, ve. </li></ol> 2. Viral Üretim <ol><li> % 10 FBS, transfeksiyon için% 1 P / S, ve% 1 L-GLUT 10 mi DMEM ile 10 cm plakalar içinde 293T hücreleri genişletmek. <ol><li> 2 mi tripsin ile tripsinize 293T hücreleri, 5 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe 300 xg&#39;de 15 ml tüpler, döndürme hücreleri toplamak, ve uygun bir şekilde levha (10 cm tabak başına 10 mi). </li></ol></li><li> 6 ve kaplama 10 cm jelatin tohum (PBS içinde% 0.1 jelatin) plakaları: 24 saatlik bir transfeksiyon önce, 293T hücreleri 1 arasında birleşik 10 cm plaka ayrıldı. NOT: virüs başına 4 tabak gerekli olacaktır. <ol><li> jelatin kaplama plakaları için, kat 10 cm plakalar alt% 0.1 jelatin çözeltisi, en azından 2 ml ekleyin. En az 20 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. plakalara hücrelerin eklemeden önce aspire jelatin. </li></ol></li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde, (84 ug plazmid ilave örneğin Gata2, Gfi1b, CFos veya Etv6 (pFUW-teto vect içine alt klonlandıveya 16) ya da FUW-M2rtTA 17), 84 ug psPAX2 ve 42 ug pMD2.G. Su ekleyin (H 2 O) 2 ml hacmi telafi etmek. Her faktör için bir tüp hazırlayın (örn. Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 ve FUW-M2rtTA). </li><li> Seçilen genin 84 ug oluşan 2 mi karışımı içeren her tüpe 2M CaCI2 250 ul (Gata2, Gfi1b, CFos, Etv6 ya FUW-M2rtTA) + 84 ug psPAX2 + 42 ug pMD2.G + H2O . </li><li> Pipet-yardım sokulan bir Pasteur pipeti kullanarak, serbest 2.25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl2 karışımı içine kabarcıklar. kabarcıkları imal edilmektedir gibi, cam pipet karşı P1000 bir ucu ile yavaş yavaş çıkarır 2 100 mM N, N-bis (2-hidroksietil) yeniden süspanse 1 aşağı -2-aminoetan sülfonik asit (BES), tuzlu su ml Aynı anda mi. </li><li> En az 15 dakika boyunca oda sıcaklığında kültürü kaputu tüpleri inkübe edin. NOT: 4.25 ml karışım (şimdi DNA + H 2 O + 2M CaCl2 </sub&gt; + BES tuz) hafifçe bulanık bakacağız. </li><li> Karışım, aspirat ortam dışı 293T plakaları kuluçkaya ve 10 ml DMEM +% 10 FBS + 1 mM L-glutamin + 25 nM chloroquine ilave olarak. NOT: Bu ortam P / S içermez. </li><li> Inkübasyondan en az 15 dakika sonra (ya da 293T hücreleri üzerinde ortamının değiştirilmesi kadar) O + 2 M CaCI2 + BES tuzlu su karışımı, tüp başına 4 hücre plakaları eşit bir şekilde dağıtılmasına, 293T hücrelerinde damla damla 4.25 ml DNA + H2 ilave (plaka başına karışımının, yani biraz daha fazla 1 mi). </li><li> 37 ° C&#39;de gece boyunca plakaları (O / N) inkübe edin. </li><li> 24 saat sonrası inkübasyon, 4 ml standart DMEM (adım 1.15 bakınız) bütün kalıplarda ortamı değiştirin. </li><li> Şu andan itibaren bir 32 ° C inkübatör hücreleri tutun. </li><li> 24 saat adımı 2.10 sonra, ayrı 50 ml tüpler içine medya toplamak. Standart DMEM 4 ml ile her plaka toplanan ortamı değiştirin. NOT: Toplanan medya 16 ml ilk tüp karışımı sonuçlarına göre 4 tabak. <ol><li> birFrangoulis inkübasyon 12 saat, aynı 50 ml tüpler içine tekrar medyayı toplamak ve standart DMEM başka 4 ml ile değiştirin. </li><li> inkübasyon 12 saat sonra, ortam toplama ve aynı 50 ml tüpler ekle. NOT: Her tüp şimdi virüs içeren medya yaklaşık 48 ml içermelidir. </li></ol></li><li> 0.45 uM düşük-protein bağlayıcı filtre ile toplanan virüs birinci filtre toplanan medya zenginleştirilmesi için kullanılması. </li><li> Viral konsantrasyon santrifüj tüplerine (bir seferde yaklaşık 16 ml) içine virüs içeren süzülmüş medyayı dökün. </li><li> 25 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 4000 x g&#39;de santrifüj ve akış-through çıkarın. NOT: Konsantre medya ve virüsün küçük hacimli filtre görünür olacaktır. </li><li> Filtrede kalan konsantre edilir medya + virüs hacmine süzüldü virüs içeren ortam bir 16 ml ilave edilir ve tüp tersine çevirerek karıştırın. </li><li> Sıkma tüpü yeniden 25 dakika karıştırıldı ve ıskarta akış yoluyla 4 ° C&#39;de 4,000 x g&#39;de. </li><li> süzülmüş kalan EkleKonsantre medya + virüs hacmine toplama filtresinin içinde kalan ve tersini tüp karıştırın. </li><li> (Filtre hacmine bağlı olarak) 10-20 dakika süreyle 4 ° C&#39;de bir kez daha 4000 x g ve spin filtrede kalan konsantre edilir medya + virüs kalan hacim yaklaşık 1 mi olduğundan emin olun. Konsantre medya + virüsün daha fazla 1 mi filtrede kalırsa, 1 dakika için 4000 x g hızında tekrar santrifüj ve 1 mi filtrede kalan kadar yineleyin. </li><li> 1.5 ml tüpler içinde konsantre edilmiş virüs 200 ul kısım ve -80 ° C&#39;de dondurularak veya hemen kullanın. </li></ol> 3. MEF yeniden programlanması <ol><li> Ön kaplama jelatin de tüm alanını kaplar temin PBS göz başına% 0.1 jelatin, 0.5 ml 6 oyuklu plakaları,. 37 ° C inkübatör içine yerleştirildi ve en az 20 dakika inkübe edilir. inkübasyondan sonra, plakaları kaldırmak ve jelatin aspire. </li><li> oyuk başına 25,000 hücre olan bir yoğunlukta, standart DMEM ile levha MEF&#39;ler (150,000 hücreve adım 3.1 jelatinize 6 plaka (lar)) 6-çukurlu plaka başına 37 ° C kuluçka makinesi içinde O / N oturmasına izin verin. </li><li> Gata2, Gfi1b, cFos ve Etv6 bir karışımını (12.5 ul her biri) 50 ul M2rtTA karıştırma ve kalan 50 ul ile 100 ul virüs kokteyl hazırlayın. </li><li> MEFS aspire medya ve 8 ug / ml hexadimethrine bromür ile 2 mL standart DMEM ekleyin. </li><li> Virüs kokteyl 15 ul MEF plakaların her transdüksiyonu ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe edin. NOT: Bu yeniden programlama sürecinin Gün 0&#39;dır. </li><li> Gün 1, inkübasyon 16-20 saat sonra, / ml DOX oyuk başına 1 ug ile desteklenmiş 2 ml taze standart DMEM ile medya değiştirin. </li><li> Hidrokortizon (10 -6 M), 100 ng / kök ml hücre faktörü (SCF), 100 ng / ml fms ilgili tirosin kinaz 3 ligandı (Flt3L), 20 ng / ml Interleukin-3- (IL-ile takviye edilmiş, hematopoetik kültür ortamı hazırlamak 3), 20 ng / ml IL-6 (IL-6) ve 1 ug / ml DOX. </li><li> 4. Gün Aspirat üzerindeHer e ortam de ve oyuk başına 1 ml PBS ile yıkama hücreleri. </li><li> PBS aspire, kuyu başına% 0.05 tripsin 1 ml kullanarak hücreleri ayırmak ve hücreleri toplamak. </li><li> Adım 3.7&#39;de tarif edilen hematopoietik ortam 12 ml, 5 dakika, tekrar süspansiyon 300 x g hızında, bir hemositometre ile bir spin hücrelerin sayısı ve% 0.1 jelatin kaplı plakalar 6 oyuklu plaka başına 60,000 hücre plakasına (2 mi göz başına 10,000 hücre, oyuk başına ). </li><li> kültür süresi (35 ila 36 gün) boyunca her 6 gün taze katkılı hematopoetik kültür ortamı ile değiştirin. </li><li> Hemogenic endotelyal HSC benzeri belirteçler ve gen ifadesinin satın teyit etmek için immüno-lekeleme 12, FACS analizi 8,12, qRT-PCR, 12 ve mRNA sıralaması 12 yoluyla ara-madde hücreleri veya gelişmekte olan hematopoietik benzeri hücreleri ya da analiz edin. </li></ol> Metilselüloz 4. Plasental Toplama ve Koloni Oluşturan Birim (CFU) Tahliller <ol><li> Hamile C5 gelen plasenta teşrih7BL / 6 fareler daha önce E12.5 18 tarif ve buz üzerinde doku tutun. </li><li> Plasenta ayrışmasını 19 Başlangıç olarak,% 20 FBS ile PBS içinde 2-5 ml% 0.2 kollajenaz tip plasental doku yıkama ve mekanik iğne ile plasenta ve PBS pasaj ile 5 ml şırıngaya takılan, bir 18G iğne ile ayırmak, en azından 3 kere. </li><li> Mekanik ayırmadan sonra, 1.5 saat boyunca 37 ° C &#39;de kolajenaz çözeltisi 2-5 ml plasenta hücreleri tutun. </li><li> 20-25 G iğne ile Passage hücreleri daha mekanik plasenta hücreleri ayırmak için 5 ml şırınga üzerine birkaç kez takıldı. </li><li> 70 mikron hücre süzgeçler sayesinde tek hücre süspansiyonları Filtre. </li><li> Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve mitotik inaktivasyonu 20 2000 cGy de ışın tedavisi. </li><li> 10 cm ila 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, ve 10 ng / ml trombopoietin (TPO) ile desteklenmiş hematopoietik kültür ortamı 10 ml tabak. Not: DOX bu aşamada gerekli değildir. </li><li> bir sıvı-gaz ​​arabirimi oluşturmak ve bir kenara çanak ayarlamak için float izin çanak hematopoetik kültür ortamında doğrudan bir 0.65 mikron filtre yerleştirin. </li><li> adımda 3,8-3,10 tarif edildiği gibi (adım 3.11 türetilmiş) gün 25 transduse MEFS ayrıştırmaları ve adım 4.6 plasental agrega 167.000 hücre ile dönüştürülmüş MEF&#39;ler 33.000&#39;i karışımı (1: 6 oranında). </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca adım 4.9 bir toplam 18,21, MEF aşağı ilk döndürme ve plasental hücre karışımı üretmek için. 200 ul nonbevelled pipet içine tek bir hücre süspansiyonu çizim, medya aspire ve P200 pipet kullanarak standart DMEM 30-50 ul pelet hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> parafin film ile pipet tıkamak. 15 ml santrifüj tüpüne bloke ucu yerleştirin ve ucu kapalı sonunda 300 xg&#39;de 5 dakika boyunca öylesine bir pelet formları aşağı doğru döndürün. </li><li> 15 ml dikkatle tüp ve yerden ucu çıkarınP200 pipet ucuna ucu. parafin filmi atın ve adım 4,8 yüzen filtre üzerine hücre pelet a&#39;ya. NOT: Filtre başına en fazla 3 agrega Levha. </li><li> Kültür,% 5 CO2 ile 37 ° C, 4-5 gün boyunca kayan 0.65 um filtreler üzerinde toplar. </li><li> hücreleri ayırmak için bütün plasenta ile yapılan protokolün aynısına (4.2-4.5 adımlar) Aşağıdaki, bir hücre kazıyıcı ile agrega (filtre başına en fazla 3) toplayın bunları birleştirmek, ve% 0.2 kollajenaz ile sindiremez. </li><li> PBS 2-5 ml% 5&#39;lik FBS ile takviye ile ayrışma sonrasında agrega yıkama ve 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> FBS, P / S, ya da L-GLUT olmadan DMEM 500 ul agrega yeniden süspanse edin. Bu, 500 | il yeniden süspansiyon alın ve 10 dikkatle kabarcık oluşumunu önlemek, TPO ng / ml ile takviye edilmiş 3 mi,% 1 metilselüloz ortama ekleyin. 3 35 x 10 mm muamele edilmemiş kültür tabaklarında Bu karışımın Levha eşit hacimleriCFU 12 deneyleri. </li><li> Bir kontrol olarak, kültür adımları 4,7-4,16 yukarıda tarif edildiği gibi de CFU tahlilleri programlandı MEF&#39;ler 4-5 gün ve yeri karıştırılmadan plasental agrega ışınlanmış. NOT: Bu agregalar yalnız koloniler oluşturur yok. </li><li> El,% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de kültür 10-14 gün sonra bir mikroskop altında hematopoietik kolonileri sayın. </li><li> Cytospin 22 tek hücrelerin morfolojik fenotip gösteren koloniler aldı. </li></ol>

<ol><li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).</li>
<li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).</li>
<li>Papapetrou, E. P., Sadelain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+blood+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells.</a> F1000 Med Rep. 2, (2010).</li>
<li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li>
<li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+OCT4-induced+plasticity+in+adult+human+fibroblasts+required+for+direct+cell+fate+conversion+to+lineage+specific+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors.</a> Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divisional+history+and+hematopoietic+stem+cell+function+during+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis.</a> Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).</li>
<li>Riddell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+committed+murine+blood+cells+to+induced+hematopoietic+stem+cells+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors.</a> Cell. 157 (3), 549-564 (2014).</li>
<li>Sandler, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+endothelial+cells+to+haematopoietic+cells+requires+vascular+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction.</a> Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).</li>
<li>Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+a+Hematopoietic+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Making a Hematopoietic Stem Cell.</a> Trends Cell Biol. , (2015).</li>
<li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li>
<li>Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+timed+pregnancies+in+two+strains+of+genetically+engineered+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%22%5BJournal%5D)">Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice.</a> Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).</li>
<li>Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+handling+of+mouse+embryonic+fibroblasts%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts).</a> Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).</li>
<li>Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation of mouse embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+murine+and+human+somatic+cells+using+a+single+polycistronic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug-inducible+system+for+direct+reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).</li>
<li>Taoudi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+hematopoietic+stem+cell+generation+in+the+AGM+region+via+maturation+of+VE-cadherin%2BCD45%2B+pre-definitive+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs.</a> Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).</li>
<li>Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+hematopoietic+stem+cells+from+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Lewis, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+blood+cells+capable+of+engrafting+in+primary%2C+secondary%2C+and+tertiary+xenogeneic+hosts+are+preserved+after+ex+vivo+culture+in+a+noncontact+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system.</a> Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).</li>
<li>Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+generation+of+reaggregated+organotypic+cultures+that+permits+juxtaposition+of+defined+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations.</a> Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).</li>
<li>Koh, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+for+microscopy+using+cytospin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells for microscopy using cytospin.</a> Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132 (4), 631-644 (2008).</li>
<li>Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hematopoietic+stem+cell+and+its+niche%3A+a+comparative+view%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view.</a> Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).</li>
<li>Butler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+vascular+niche+platform+for+expansion+of+repopulating+human+cord+blood+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells.</a> Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).</li>
<li>Gori, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+niche+promotes+hematopoietic+multipotent+progenitor+formation+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).</li>
<li>Bar-Nur, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Maza, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+acquisition+of+pluripotency+during+somatic+cell+transdifferentiation+with+iPSC+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li>
<li>Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Epigenetic+memory%3A+phenomenon+in+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">"Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells.</a> Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).</li>
<li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372(2014).</li>
<li>Vereide, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expandable%2C+inducible+hemangioblast+state+regulated+by+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor.</a> Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).</li>
<li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Kolayca elde edilebilen somatik hücrelerden HSPC'lerin de novo olarak üretilmesi, hematopoezi in vitro incelemek için benzersiz bir yöntem ve bu teknolojiyi potansiyel olarak insan sistemine uygulama fırsatı sunar. Bu çeviri, bir tabakta insan hematolojik hastalığını incelemek için yeni bir araç oluşturacak ve aynı zamanda çok sayıda bozukluğu yeni terapötikler veya HSC nakilleri ile tedavi etmek için ilaç test platformları ve gen hedefleme fırsatları sağlayacaktır. Bu alanda, son çalışmalar HSPC'leri d...

Hematopoiezis hematopoetik kök hücreler (HSC) bu tür Aort-Gonad-mesonephros olarak embriyonik hematopoetik siteleri ve plasenta 1,2 çeşitli mevcut hemogenic endotel kapalı tomurcuk karmaşık bir gelişimsel süreçtir. In vitro olarak kültürü HSCler yetersizlik bu işlemin derinlemesine analizi gibi, bu çalışmaların klinik uygulama önler. Bu sınırlamayı aşmak için, daha önceki çalışmalar elde girişiminde HSCler de novo da yeniden programlama ortamı 4,5 kullanarak pluripotent kök hücreler (PSC) 3 veya somatik hücrelerinde olduğu plastikliği ve yönlendirilmiş farklılaşma farklılaşması ile. Ancak bu çalışmalar, klinik güvenli engraftable hücreleri oluşturmak veya kesin gelişimsel hemopoeziste çalışma izin vermez &quot;bir tabak.&quot; somatik fibroblastlar p gelen Yamanaka ve arkadaşları tarafından kurulan yeni iş kaynaklı üretmek için pluripotent kök hücreler (iPSCs)Transkripsiyon faktörü (TF) yeniden programlama hücre kaderine 6,7 göre aşırı stratejileri için bir çerçeve rovides. Bu eser kolayca elde somatik hücre TF reprogramming yoluyla seçim hücre tipleri oluşturmak için çeşitli alanlarda araştırmacılara yol açtı. Burada anlatılan yeniden programlama stratejisinin amacı fare somatik in vitro insan hematopoez incelemek için hastaya özgü fibroblastlar yeniden programlamak için insan sisteme bu bulguları tercüme amacı ile TF tabanlı yeniden programlama yaklaşımını kullanarak hücreleri ve bir hemogenic süreci teşvik etmek hastalık modelleme, ilaç testi için hastaya özgü kan ürünlerini üretmek ve kök hücre nakli. Bu fare sistemdeki uygun yeniden programlama sağlamak için ilk adım CD34 ifadesi, endotelyal progenitör hücrelerin ve HKH&#39;lerin bilinen bir işaretleyici için bir okuma-out olarak görev yapan bir muhabir hattı geliştirmekti. Bunu yapmak için, huCD34-TTA teto-H2BGFP transgenik fare hattı g kullanılmıştırenerate çift transgenik fare embriyonik fibroblastlar (MEFS), şimdi CD34 promotör 8 aktivasyonu üzerine yeşil floresan 34 / H2BGFP, ifade etti. Bu hematopoietik tarifnamede ve gelişme sırasında farklı noktalarda gerekli olduğu bilinmektedir TFs çeşitli tarama sağladı. PMX retrovial vektörleri 18 TFs ile başlayarak 34 / H2BGFP MEFS AFT024 stromal hücreler HSC destekleyen tüm faktörler ve kültürlü transduced, (34 / H2BGFP fareler açıklanan literatür madencilik ve daha önce gelen HKH&#39;lerin istinat GFP etiketin profil aracılığıyla belirlenir). muhabir aktivasyonu için TFs optimal set tespit edilene kadar 34 / H2BGFP aktivasyon algıladıktan sonra, TF sonradan yeniden programlama kokteyli çıkarıldı. Bu ilk taramayla sonra faktörler TFS kontrol ekspresyonunu sağlamak için DOX uyarılabilir pFUW vektör sistemine aktarılmıştır. Bu iki DOX kontrol sistemi (34 / H2BGFP hücreleri ve pFUW uyarılabilir vektörleri), gelen MEF&#39;ler uyumlu olduğuvahşi tip C57BL / 6 fareleri gerekmiştir. Hemogenesis devam ve mültilineaj clonogenic atalarıdır oluşturmak için izin veren uygun bir mikro sağlamak için de gerekliydi. Hematopoetik kök ve progenitör hücreler içine (HSPCs) somatik hücre yeniden programlamak için çalışırken Güncel çalışmalar başarı 9-11 değişik düzeylerde bir araya geldi. Bugüne kadar, fare ve uzun vadeli ve kendini sürekli yenileyen repopulating yeteneği ile insan transplante HSPCs hem nesil TFs aynı seti kullanılarak elde edilmemiştir. Bu protokol, biz tekrarlanabilir MEFS içinde hemogenesis ikna etmek için daha önce kurulmuş stratejinin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Bu TFs (Gata2, Gfi1b cFos ve Etv6) en az bir setinin giriş göstermektedir gelişim hematopoez ve hematopoietik yeniden programlama klinik uygulamasının 12 incelenebilir hangi bir platform sağlar in vitro bir karmaşık gelişim programı tahrik edebilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; M filtreleri</td><td>Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra santrifüj filtreler</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>İnvitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini'nin Kıyaslaması</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>18 G iğneler</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>20 G iğneler</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 G iğneler</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip I</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Miyelokült medya</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>AR-GE D Sistemleri</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polibren (heksadimetrin bromür)</td> <td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0.65 & mu; M membran filtreler</td><td>Millipore DVPP14250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilselüloz ortamı</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>Metokült M3434</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6 fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm kültür yemekler</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

transkripsiyon faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir hemogenic programı tetikleyebilecek

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler) aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında (MEF'ler) bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. İlk olarak, insan CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) çift transgenik farelerden elde edilen MEF'leri kullanarak bir raportör ekranı tasarladık. Bu farelerden elde edilen CD34 + hücreleri, H2B histonlarını GFP ile etiketler ve doksisiklin (DOX) eklendikten sonra etiketlemeyi durdurur. MEFS, aday TF'lerle transdüksiyona tabi tutuldu ve daha sonra hematopoietik veya endotel hücre kaderinin edinilmesini gösterecek GFP + hücrelerinin ortaya çıkışı için gözlendi. 18 aday TF ile başlayarak ve bir kombinatoryal eleme süreci boyunca, en yüksek GFP + hücre yüzdesini indükleyecek minimal bir faktör seti elde ettik. Gata2, Gfi1b ve cFos'un gerekli olduğunu ve Etv6'nın eklenmesinin optimal indüksiyonu sağladığını bulduk. Yeniden programlama işlemi sırasında farklı zaman noktalarında yapılan bir dizi gen ekspresyonu analizi, bu hücrelerin endotelyalden hematopoietik geçişe (EHT) uğrayan bir öncü hücreden geçiyor gibi göründüğünü ortaya koydu. Bu nedenle, bu yeniden programlama süreci, gelişimsel hematopoezi "bir tabakta" taklit eder, bu da hematopoezin in vitro olarak incelenmesine ve bu spesifikasyonun altında yatan mekanizmaları tanımlamak için bir platforma izin verir. Bu metodoloji aynı zamanda, hematolojik hastalıkların tedavisi ve incelenmesinde bir dizi uygulama için hastaya özgü hematopoietik kök hücrelerin (HSC'ler) alternatif bir kaynağı oluşturma umuduyla bu çalışmanın insan sistemine çevrilmesi için bir çerçeve sağlar.

Hematopoiezis çeşitli embriyonik sitelerde başlayan karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Hemogenic endotel hücreleri bu sitelerde ikamet ve hücre 23 tomurcuklanan yoluyla HKH&#39;lerin doğuran. Bu süreç şu anda HSPC genişleme ex vivo olarak ya da kuşak de novo yoluyla, her nasılsa in vitro bu hücreleri elde etmek için bir metodoloji gerektiren, kültürde HKH&#39;lerin veya hematopoetik öncülerini koyarak yeniden edilemez. Bu protokol MEFS TF aşırı ekspre...

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Bu hemojenik indüksiyon protokolünün genel amacı, transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare fibroblastlarında bir gelişimsel süreci başlatarak, uzun süreli kültür sonrası hematopoetik hücreler üreten in vitro hematopoetik öncül hücreler oluşturmaktır. Bu yöntem, hematopoetik programlama alanındaki, çok hatlı ve nakil kapasitesine sahip gerçek HSC'leri de novo elde etmek için bir protokol geliştirilip geliştirilemeyeceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu sayesinde, gelişimsel sürecin pluripotent bir ara aşamadan geçmeyi gerektirmeyen yeniden programlanmış hücrelerde başlatılabilmesidir.Fare embriyonik fibroblastlarını veya MEF'leri kültürele aldıktan ve metin protokolüne göre virüs ürettikten sonra, 6 kuyucuklu plakaları önceden kaplamak için PBS içinde %0,1 jelatin kullanın. Jelatinin kuyucuğun tüm alanını kapladığından emin olun. Plakaları en az 20 dakika boyunca 37 °C'lik inkübatörde bekletin.Ardından plakaları çıkarın ve jelatini aspire edin. MEF'leri kuyu başına 25, 000 hücre yoğunluğunda standart DMEM ile ekin ve hücrelerin 37 °C'de gece boyunca çökelmesini sağlayın. 50 µL M2RTTA ile GATA2, GFI1B, CFOS ve ETV6'nın her birinden 12,5 µL karıştırarak 100 µL'lik bir virüs kokteyli hazırlayın.MEFS'lerdeki ortamı aspire edin ve 8 µg/mL heksadimetrin bromür içeren iki mililitre standart DMEM ekleyin. Ardından, MEF'lerin bulunduğu her bir kuyuğu 15 µL virüs kokteyli ile transduk edin ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. 16 ila 20 saatlik inkübasyonun ardından, her kuyuktaki ortamı, 1 µg/mL DOX ile takviye edilmiş iki mililitre taze standart DMEM ile değiştirin.37 °C'de üç gün boyunca inkübe edin. Dördüncü günde; hidrokortizon, kök hücre faktörü, MFS ile ilişkili tirozin kinaz üç ligandı, interlökin üç, interlökin altı ve DOX ile desteklenmiş hematopoetik kültür ortamı hazırlayın. Ardından, MEF'lerdeki ortamı aspire edin ve hücreleri yıkamak için 1 mL PBS kullanın.Ardından, PBS'yi aspire ettikten sonra, hücreleri ayırmak ve toplamak için her kuyucuğa bir mililitre %0,05 tripsin ekleyin. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın, ardından 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin ve hücreleri yeniden süspand etmek için yeni hazırlanan 12 mililitre hematopoetik ortamı kullanın. Daha sonra, jelatin kaplı altı kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 10.000 hücre ekin.Kültür süresi boyunca her altı günde bir, besiyerini taze takviyeli hematopoetik kültür besiyeri ile değiştirin. Hücreleri metin protokolüne göre analiz edin. Gebe farelerden plasentaları metin protokolüne uygun olarak çıkardıktan sonra, dokuyu yıkamak için %20 FBS içeren PBS içinde %0,2 kollajenaz tip bir'in iki ila beş mililitresini kullanın ve beş mililitrelik bir şırıngaya takılmış 18 gauge iğne kullanarak dokuyu PBS solüsyonu içinde mekanik olarak ayrıştırın.Plasenta hücrelerini, 37 °C'de 1,5 saat boyunca iki ila beş mililitre kollajenaz çözeltisi içinde inkübe edin. Ardından, hücreleri mekanik olarak daha fazla ayrıştırmak için 5 mililitrelik şırıngalara takılı 20 ila 25 gauge iğnelerden birkaç kez geçirin. Son olarak, tek hücre süspansiyonlarını 70 mikronluk hücre süzgeçlerinden filtreleyin.Ardından, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve mitotik inaktivasyon için 2.000 centigray volt ile ışınlayın. Aşağıdakilerle desteklenmiş on mililitre hematopoetik kültür ortamını on santimetrelik bir kaba ekleyin. 0,65 mikronluk filtreyi, bir sıvı-gaz ara yüzey oluşturmak için yüzeyde yüzmesini sağlayarak doğrudan kaptaki kültür ortamının üzerine yerleştirin ve kabı kenara alın.Bu videonun önceki bölümlerinde gösterildiği gibi, 25. gündeki transduksiyon yapılmış MEF'leri ayrıştırın ve 33.000 adet transduksiyon yapılmış MEF'yi, mitotik olarak inaktive edilmiş 167.000 plasental agregat hücresi ile karıştırın. Bir agregat oluşturmak için, MEF ve plasental hücre karışımını 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Besiyerini aspire edin ve çökelmiş hücreleri yeniden süspanse etmek için 30 ila 50 µL standart DMEM kullanın; ardından tek hücre süspansiyonunu 200 µL'lik küt uçlu olmayan bir pipet ucuna çekin.Ardından, parafin film ile pipet ucunu kapatın. Daha sonra, kapatılmış ucu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve ucun kapalı ucunda bir pelet oluşması için 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ucu 15 mililitrelik tüpten dikkatlice çıkarın ve bir P200 pipetin ucuna yerleştirin.Parafin filmi atın ve hücre peletini, kültür ortamı dolu kapta yüzen filtrenin üzerine itin. Agregatları, yüzen filtreler üzerinde 37 °C ve %5 karbondioksit altında dört ila beş gün boyunca kültürleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak agregatları toplayın, ardından bunları birleştirin ve sindirmek için %0,5 kollajenaz kullanın.Disosiyasyondan sonra, agregatları yıkamak için yüzde beş FBS içeren iki ila beş mililitre PBS kullanın ve 300 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Agregatları, FBS, Pen-Strep veya L-glutamin içermeyen 500 µL DMEM içinde yeniden süspanse edin. Köpük oluşumunu dikkatlice önleyerek, tüm süspansiyonu mililitre başına on ng Tepo ile desteklenmiş yüzde bir metilselüloz ortamının üç mililitresine ekleyin.CFU analizleri için bu karışımdan eşit hacimleri üç adet, 35 x 10 mm'lik işlem görmemiş kültür kabına ekleyin. Kontrol olarak, ışınlanmış plasental agregatları kültüre edin. Son olarak, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren ortamda 10 ila 14 günlük kültürden sonra hematopoetik kolonileri mikroskop altında manuel olarak sayın.MEF'lerin HSC'lere yeniden programlanması sürecinde, hücreler burada gösterildiği gibi transkripsiyon faktörleri ile transduse edilir. Üç günlük genişletme ve transgen aktivasyonunu başlatmak için DOX maruziyetinin ardından, hücreler disosiye edilir, bölünür ve jelatin kaplı plaklarda takviye edilmiş hematopoetik ortamda büyütülür. Kültürdeki 20. günde, yeniden programlama ortamı ile transdüksiyon sonrası, 34/H2BGFP MEF'ler, MEF'lerden farklı olan endotel morfolojisi dahil olmak üzere belirgin morfolojik değişiklikler gösterir.35. güne kadar devam eden kültürleme, endotelyal benzer ara formlardan ortaya çıkan; GFP pozitif olan ve hematopoetik belirteçler Sca1 ve CD45 için pozitif boyanan birçok yuvarlak hematopoetik benzer hücrenin oluşmasıyla sonuçlanır. Kültürlemeye devam edildiğinde, insan CD34 raporer ekspresyonunu koruyan ve aynı zamanda CD45 eksprese eden hücreler elde edilir. Plasental agregasyon üzerine, kültür hücreleri klonojenik potansiyel kazanır ve çeşitli hematopoetik morfolojiler ile blast benzeri hücreler içeren kolonileri metilselüloz içerisinde oluşturur.Bu prosedürü uygularken, karışıklık yaşamamak için her bölümü yavaşça gerçekleştirmenin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Herhangi bir hata, yeniden programlamaya başladıktan haftalar sonrasına kadar fark edilmesi güç olacaktır. Bu prosedürün ardından, türetilen hücrelerin fonksiyonel analizlerde gösterildiği gibi gerçekten hematopoetik işleve sahip olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için cobblestone-forming hücre analizleri ve uzun süreli kültür başlatan hücre analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu tekniğin geliştirilmesinin ardından, hematopoetik kök hücre programlama alanındaki araştırmacılar; kan, endotel ve diğer hücre tiplerinde farklı yeniden programlama stratejilerini ve optimizasyon protokollerini keşfetme imkanına kavuşmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, fare fibroblastlarında hemojenik bir programın nasıl indükleneceği, transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu ve türetilen hücrenin fonksiyonel olarak nasıl analiz edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

reprogramming-mouse-embryonic-fibroblasts-with-transcription-factors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Fare embriyonik fibroblastı, transkripsiyon faktörleri Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc'nin zorla ekspresyonu ile düşük verimlilikte indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanabilir. Yeniden programlama reaksiyonunun nadir ara ürünleri, hücre yüzeyi yapıcıları Thy-1.2, Ssea-1 ve Epcam'a karşı antikorlarla etiketleme yoluyla izole edilen FACS'dir.

Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Bu protokol, transkripsiyon faktörlerinin zorlanmış ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücrelerinden hemojenik endotel ve multipotansiyel hematopoietik progenitörlerin verimli indüksiyonunu açıklar.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Burada birincil embriyonik fibroblastlar içine fonksiyonel cardiomyocytes overexpression GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 ve miR-133, TGF-β sinyal inhibisyon yanında (GHMT2m) aracılığıyla yeniden programlamak için sağlam bir yöntem mevcut. Bizim iletişim kuralı dayak cardiomyocytes 7 gün sonrası iletim % 60 ile olduğu kadar erken oluşturur verimlilik.

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Bu protokol, insan dermal fibroblastlarında hemojenik bir programın hematopoetik kök ve döl hücreleri üretmek için gata2, GFI1B ve FOS transkripsiyon faktörlerinin zorunlu ekspresyonu ile indüksiyonuna neden olduğunu göstermektedir.

Transkripsiyon Faktörlerinin Zorunlu İfadesi Ile İnsan Fibroblastlarının Hemojenik Yeniden Programlanması

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC) henüz küçük bazı endotel hücreleri kan yapıcı olmaya belirtmek hangi işlemi hakkında bilinen, gelişim sırasında uzman (hemogenic) endotel hücreleri kaynaklanıyor. Bu fare embriyonik dokulardan hemogenic endotel hücreleri ve HSPC eşzamanlı izolasyonu sağlayan bir akış-sitometri göre bir yöntem ortaya koymaktadır.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

Öğrenin fare embriyonik fibroblastları transkripsiyon faktörleriyle yeniden programlayarak hematopoietik öncü hücreler üretmeyi. Bu yöntem, çok soylu ve greft yeteneğine sahip HSC'ler elde etmek için plüripotent ara aşama gerektirmeden doğrudan bir yaklaşım sunar.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Daha fazla video keşfet