Tek ya da Eşlik Kimya / Elektrik / Kesme Stres Uyaranların altında Hücresel Yanıtları incelenmesi için mikroakışkan Cihazlar Tasarımı
13 Ağustos 2016
Akışkan bileşenlerle entegre edilmiş mikro fabrikasyon cihazlar, in vivo mikro ortamı taklit eden hücre çalışmaları için in vitro bir platform sağlar. Tek veya bir arada bulunan kimyasal/elektriksel/kesme gerilimi uyaranları altında hücresel tepkileri incelemek için polimetilmetakrilat bazlı mikroakışkan çipler geliştirdik.
Bu prosedürün genel amacı, hücrelerin çevresel uyaranlara nasıl tepki verdiğini gözlemlemek için mikroakışkan cihazlar tasarlamak ve üretmektir. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve biyomedikal mühendisliğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin hücrelerin kimyasallar, kayma gerilmeleri ve elektrik alanı dahil olmak üzere farklı çevresel uyaranlar altındaki tepkileri gibi. Bu tekniğin temel avantajı, tüplerin kolayca üretilebilmesi ve monte edilebilmesidir. Ayrıca bu mikroakışkan cihazlar, yüksek yeteneklerle in-vivo koşullar oluşturabilir. Prosedürü laboratuvarımdan lisans öğrencisi Tzu-Yuan Chou ve Dr. Julian Chung'un laboratuvarından post-doktora araştırmacısı Hsien-San Hou uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, karbondioksit lazer kazıyıcıyı açın ve bilgisayara olan bağlantısını kontrol edin. Ardından, burada gösterilenlerden biri gibi önceden çizilmiş bir Noel ağacı desenini kazıyıcıya yükleyin. Sonra, kazıyıcının tablasının üzerine bir PMMA levha veya bir parça çift taraflı bant yerleştirin. Kalibrasyon çubuğunu ve görünür helyum neon lazerini kullanarak karbondioksit lazerinin odağını ayarlayın. Ardından deseni substrat üzerine kazıyın. İşlem bittiğinde, desenli substratı alın, istenmeyen parçaları çıkarın ve yüzeydeki kalan kalıntıları temizlemek için bir nitrojen akışı kullanın. Bu işlemi çipin her bir bileşeni için tekrarlayın. Kimyasal kayma gerilmesi mikroakışkan çipini monte edin. Bunu gerçekleştirmek için, kimyasal kayma gerilmesi desenli üç PMMA levhayı, kazınmış iki parça çift taraflı bant kullanarak birleştirin. Vida dişleri ve delikleri hizalayarak, ortada vida dişli akrilik adaptörleri çipin en üstteki PMMA katmanına yapıştırmak için hızlı yapıştırıcı kullanın. Bu adaptörler ortam girişleri, çıkışları ve tuz köprüsü konektörleri olarak hizmet edecektir. Ardından çipin altına 0,7 mm kalınlığında bir parça daha çift taraflı bant ekleyin ve çipi 10 cm çapında bir Petri kabına sabitleyin. Montaj tamamlandıktan sonra, çipi bir gece boyunca vakum odasında bekletin. Şimdi kimyasal-elektrik alan çipini monte edin. Kimyasal-elektrik alan çipi için kazınmış PMMA levhayı çift taraflı bant ile 10 cm çapında bir Petri kabına sabitleyin. Çipleri kullanmadan önce, sterilize etmek için onları 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakın. Ardından, plastik tüpler ve elle sıkılan somunlar aracılığıyla çiplerin girişlerini 3 ml PBS dolu şırıngalara bağlayın. Aynı şekilde, çıkışları bir atık tüpüne bağlayın. Akışkan kanallarını PBS ile doldurmak (prime etmek) için şırınganın pistonunu yavaşça bastırın. Kabarcıkları gidermek için şırıngayı ileri geri itin, ardından çipleri bir gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Kimyasal-elektrik alan çiplerini kurmak için, tuz köprülerini oluşturmak amacıyla tüp somunların içine %3 agaroz doldurun. Ardından gümüş-gümüş klorür elektrotlarını tüp somunların içine yerleştirin. Akciğer kanseri CL1-5 hücrelerini, %90 konfluansa ulaşana kadar %10 FBS ile takviye edilmiş D-MEM içinde büyütün. Ardından besiyerini aspire edin. Hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın. Ve 10 cm çapındaki bir plakaya 2 ml %0,5 tripsin tampon çözeltisi ekleyin. Hücreleri tekrar 37°C'ye yerleştirin
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, in vivo mikro-çevreyi yakından taklit eden ve hücre çalışmaları için in vitro bir platform oluşturan, akışkan bileşenlerle entegre edilmiş mikro-fabrikasyon cihazlarını sunmaktadır. Araştırma, çeşitli uyarılara verilen hücresel yanıtları incelemek üzere tasarlanmış polimetilmetakrilat tabanlı mikroakışkan çiplere odaklanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikroakışkanlar
- Hücre Biyolojisi
- In Vitro Çalışmalar
Arka Plan
- Mikro-fabrikasyon cihazlar, hücresel ortamların incelenmesini geliştirmektedir.
- Akışkan bileşenler, deneysel koşulların hassas bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanır.
- Hücresel yanıtların anlaşılması, çeşitli biyolojik uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Polimetilmetakrilat, mikroakışkan uygulamalar için çok yönlü bir malzemedir.
Çalışmanın Amacı
- Hücresel yanıtları kontrollü bir ortamda incelemek için bir platform geliştirmek.
- Mikroakışkan teknolojisi kullanarak in vivo koşulları taklit etmek.
- Kimyasal, elektriksel ve kayma gerilmesi uyaranlarının hücreler üzerindeki etkilerini araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Polimetilmetakrilat kullanılarak mikroakışkan çiplerin tasarımı ve imalatı.
- Geliştirilmiş deneysel kontrol için akışkan bileşenlerin entegrasyonu.
- Hücresel yanıtları değerlendirmek için çeşitli stimülasyonların uygulanması.
- In vivo koşulları simüle etmek için in vitro deneyler.
Ana Sonuçlar
- Hücresel çalışmalar için mikroakışkan çiplerin başarılı bir şekilde geliştirilmesi.
- Çevresel koşulların etkili bir şekilde kontrol edilebildiğinin kanıtlanması.
- Farklı uyarılara karşı belirgin hücresel yanıtların gözlemlenmesi.
- Hücreler ve mikro-çevreleri arasındaki etkileşimlere dair öngörülerin sağlanması.
Sonuçlar
- Mikroakışkan platform, hücresel davranışı incelemek için değerli bir araçtır.
- Bulgular, kontrollü bir ortamdaki hücresel yanıtların anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecekteki uygulamalar arasında ilaç testi ve hastalık modellemesi yer alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Uygunluk
Kimyasal, elektriksel ve kayma gerilmesi uyaranları üzerinde hassas kontrol sağlayan mikroakışkan platformlar, karmaşık in vivo mikroortamları taklit ederek hedef doğrulamanın risklerini azaltmak için biyofarma Ar-Ge'sine ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar. PMMA tabanlı bu cihazlar, eşzamanlı uyaranlar altında hücresel yanıtların taranması için deneysel kapasiteyi artırarak erken keşif aşamasında mekanistik içgörüye destek olur. Bu teknoloji, kaynaklar öncü bileşik tanımlamaya ayrılmadan önce, daha yüksek öngörü güvenine sahip hedeflerin önceliklendirilmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hastalık mekanizmalarındaki yolak katılımını aydınlatmak için kimyasal gradyanlara, elektrik alanlarına ve kayma stresine verilen hücresel yanıtların sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: PMMA altlıklar, lazer ablasyonu aracılığıyla düşük maliyetli ve hızlı üretilime olanak tanıyarak hedef hipotez testlerinde iteratif tasarımı destekler.
- Öngörücü Değer: Tanımlanmış stimülasyonlar altında reaktif oksijen türleri üretimini ve hücre migrasyonunu nicelleştirerek, hedef risk azaltma çalışmaları için fonksiyonel okumalar sağlar.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Eş zamanlı kayma gerilmesi veya elektrik alanı gradyanları ile beş konsantrasyon gradyanı oluşturarak, tek bir cihazda çok parametreli taramaya olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Birden fazla stimülasyon koşulunu entegre ederek deneysel tekrarları azaltır ve bileşik veya siRNA kütüphanesi taramaları için analiz verimliliğini artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Standart mikroskopi ve inkübasyon iş akışlarıyla uyumludur, bu da tarama kaskadlarına adaptasyonu kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Mikroçevre kaynaklı fenotipleri incelemek için hastalıkla ilişkili bir model olarak akciğer kanseri CL1-5 hücrelerini kullanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Hücresel yanıtlara yönelik kimyasal, elektriksel ve mekanik uyaranların katkılarını ayrıştırarak kombinasyon tedavisi stratejilerine bilgi sağlar.
- Preklinik Hizalama: Migrasyon ve oksidatif stres gibi çıktılar, metastaz ve invazivite ile ilişkili temel özelliklerle korelasyon gösterir.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Mikroakışkan çipler, kantitatif ve stimülusa yanıt veren hücresel fenotipler sağlayarak, hedef doğrulaması ile erken aşama öncü bileşik taraması arasında köprü kuran bir keşif aşaması analiz platformu olarak işlev görür.
- Keşif Biyolojisi: Mikroçevresel uyaranların kanser ve diğer hastalık modellerinde hücresel davranışı nasıl modüle ettiğine dair hipotezlerin test edilmesini destekler.
- Tarama: Hücresel yanıtların kimyasal konsantrasyon ve fiziksel uyaran gradyanları boyunca paralel olarak test edilmesine olanak tanıyarak deney başına veri yoğunluğunu artırır.
- Analizler: Objektif karşılaştırma için floresan tabanlı ROS deteksiyonu ve zaman atlamalı migrasyon metrikleri dahil olmak üzere ölçülebilir çıktılar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Mikroçevresel yanıtları hastalıkla ilgili invaziv fenotiplerle ilişkilendirmek için metastatik bir akciğer kanseri hattı kullanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: PMMA tabanlı tasarım, mekanobiyoloji veya farmakoloji çalışmalarında tutarlı uyaran iletimi için laboratuvarlar ve projeler genelinde replikasyona izin verir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Değişken katkılarını izole etmek için tekil veya bir arada mevcut uyaranların kontrollü uygulanmasını sağlayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir gradyan üretimi yoluyla uyaran iletimini standartlaştırarak tekrarlar arasındaki değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Fizyolojik olarak ilgili koşullar altında çok parametreli etkinlik ve toksisite okumaları sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Uyaran spesifik hücresel yanıtları modüle eden bileşikleri tanımlayarak riskle ayarlanmış hedef önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Mikroakışkan tasarım, PMMA'nın lazerle ablasyonu ve akışkan arayüz montajı konularında uzmanlık gerektirir.
- CO2 lazer kazıyıcıya, UV sterilizasyona ve şırıngalar ile tüpler gibi akışkan hazırlama ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Ekipler arasında hücre ekiminin, stimülasyon uygulama zamanlamasının ve okuma normalizasyonunun standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer hücre tiplerine adaptasyon; kayma gerilmesini ve gradyan bütünlüğünü korumak için kanal boyutlarının ve akış hızlarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, protokolde belirtildiği üzere, hazırlama sırasında hava kabarcığı oluşumu ve elektrik alanı düzeneklerinde elektrot soyulması yer almaktadır.
