İşitsel HEI-OC1 Hücreleri ile Çalışma

Bu protokolün genel amacı, farmakolojik ilaçların işitsel hücreler üzerindeki etkilerini incelemek ve motor protein prestin'in fonksiyonel karakterizasyonuna yardımcı olmak için kullanılabilecek HEI-OC1 hücreleri ile çalışmak için temel prosedürleri tanımlamaktır. HEI-OC1 hücreleri, dünya çapında birçok araştırmacı tarafından farklı deneylerde, farklı amaçlarla ve farklı teknikler kullanılarak kullanılmaktadır. Umarım, burada açıklanan prosedürler, bu çalışmaları karşılaştırılabilir hale getirmek için ortak bir temel sağlayacaktır.

Tabii ki, bu deneysel prosedürler daha da geliştirilebilir. Ancak burada açıklananlarla olan farklılıklar, muhtemelen çelişkili sonuçları anlamak ve açıklamak için anahtar olabilir. Bu gösteride, donmuş bir alikottan başlayarak, yaygın olarak bulunan tekniklerle farklı çalışmalar yapmak için numunelerin hazır bulundurulmasına kadar HEI-OC1 hücreleri ile nasıl çalışılacağını açıklayacağız.

Bu işleme başlamak için, kriyoprezervasyonlu HEI-OC1 hücrelerinin bir şişesini sıvı nitrojenden çıkarın ve 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Şişenin sadece alt yarısını batırın ve şişede sadece az miktarda buz kalana kadar çözülmesine izin verin. Biyolojik bir güvenlik kabininde, şişenin dışını %70 alkolle silin.

Daha sonra, hücreleri flakondan pipetleyin ve tüm hacmi damla damla, yavaşça,% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM gibi 10 mililitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe verin. Ardından, tüpü beş dakika santrifüjleyerek DMSO'yu çıkarın. Beş dakika sonra, süpernatanı atın ve hücreleri dokuz mililitre taze büyüme ortamında yeniden süspanse edin.

Pipetin ucu tüpün dibine değecek şekilde pipet ile ortam arasındaki asılı hücreleri üç ila dört kez akıtarak ve geri akıtarak hücre kümelerini veya tabakalarını ayırın. Daha sonra, büyüme ortamında asılı kalan toplam hücre hacmini 100 milimetre çapında işlenmemiş bir plastik hücre kültürü kabına yerleştirin. Hücreleri 33 santigrat derecede% 10 CO2 ile inkübe edin.

Bu adımda, eski ortamı çıkarın ve hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın. Ardından, hücre tek tabakasını% 0.25 tripsin ile kaplayın. Hücrelerin %40'ı ayrıldığında ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak inceleyin.

Gerekirse, kalan bağlı hücreleri serbest bırakmak için kültür kabını hafifçe sallayın Hücreleri yeniden askıya alın ve tüpü beş dakika santrifüjleyerek tripsini çıkarın. Daha sonra, süpernatanı atın ve hücreleri dokuz mililitre taze büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, pipetin ucu tüpün dibine değecek şekilde üç ila dört kez, asılı hücreleri pipet ile ortam arasında akıtarak ve geri akıtarak hücre kümelerini veya tabakalarını ayırın.

Hücreleri 100 milimetre çapındaki hücre kültürü kaplarında tohumlamaya devam edin. Bunları 33 santigrat derecede% 10 CO2 ile inkübe edin ve planlanan deneyler veya yeni bir stok oluşturmak için gerektiği kadar bölün. Farklılaşma için, HEI-OC1 hücrelerini yaklaşık% 80 birleşmeye ulaşana kadar izin verilen koşullarda inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri iki ila üç hafta boyunca% 5 CO2 ile 39 santigrat derecede inkübe edin ve ölü hücreleri çıkarmak için ortamı her gün değiştirin. Bu prosedüre, otomatik bir hücre sayacı veya bir hemositometre kullanarak hücreleri sayarak başlayın ve hücre konsantrasyonunu istenen değere ayarlayın. Daha sonra, hücreleri 96 kuyulu düz tabanlı bir plakaya, beyaz duvarlı 96 oyuklu bir plakaya veya altı oyuklu bir plakaya tohumlayın.

Belirli bir tahlil gerektiriyorsa, hücreleri ilgilenilen ilaçlarla tedavi etmeden önce substrat bağlantısı için gece boyunca inkübe edin. Ardından, tedavinin sonucunu akış sitometrisi veya başka bir uygun teknikle ölçün. Hücreleri hasat etmek için, 10 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile iki kez yıkayın.

İki mililitre enzim içermeyen ayırıcı çözelti ekleyin ve hücreleri %5 CO2 ile 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Hücrelerin ayrılmasını kontrol etmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Gerekirse, daha fazla hücreyi koparmak için hücre kültürü kabını nazikçe hareket ettirin ve sallamamaya dikkat edin.

Ardından, 10 mililitre DMEM artı% 10 FBS ekleyin ve hücreleri beş kez nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Bundan sonra, hücrelere mikroskop altında bakın. Hücrelerin %80'inden fazlası zaten ayrılmışsa, başka pipetlemeye gerek yoktur.

Hücreler hala kümeler halindeyse, hücrelerin %80'inden fazlası artık küme halinde olmayana kadar nazikçe pipetlemeye devam edin. Hücrelerin optik kontrolü, pürüzsüz zar kenarlarına sahip birçok tek yuvarlak hücre göstermelidir. Daha sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi yama-kelepçe ve NLC ölçümlerine devam edin.

İzin verilmeyen koşullarda kültürlenen HEI-OC1 hücreleri, izin verilen koşullarda hücre kültürlerine göre hücre canlılığında oldukça önemli bir azalma ve hücre ölümünde eşit derecede önemli bir artış gösterdi. Halihazırda ölmekte olan veya canlılığı azalmış hücreler üzerindeki ilaç etkileri, aynı ilacın sağlıklı hücreler üzerindeki etkilerinden farklı olabileceğinden, NP-HEI-OC1 hücreleri üzerinde yapılan herhangi bir sitotoksisite çalışmasında ilaç etkilerini kültür koşullarının etkilerinden ayırt etmek için önemli çabalar gösterilmelidir. Bu nedenle, özel olarak farklılaşmış hücreler gerektirmeyen deneyler için izin verilen koşullarda kültürlenmiş HEI-OC1 hücrelerinin kullanılmasını öneririz.

Burada gösterilen konfokal görüntüler, 33 santigrat derece ve 39 santigrat derecede kültürlenen HEI-OC1 hücrelerinde işitsel motor protein prestin'in ekspresyonunu doğrulamaktadır. Prestin'in çoğunlukla izin verilen koşullarda büyüyen HEI-OC1 hücrelerinin sitoplazmasında immünolokalize olduğunu ve daha farklılaşmış hücrelerde plazma zarında daha konsantre olduğunu unutmayın. Akış sitometrisi çalışmaları, her iki durumda da prestin ekspresyonunda belirgin bir artış gösterdi, bu da translokasyona daha fazla prestin molekülünün sentezinin eşlik ettiğini düşündürdü.

Öte yandan, elektrofizyolojik çalışmalar, HEI-OC1 hücrelerinde 33 santigrat derecede büyüyen sağlam bir NLC gösterdi, azalan bir tepe değeri ve hücreler bir ve iki hafta boyunca izin verilmeyen koşullara taşındıkça daha depolarize değerlere kayan tepe kapasitansında bir voltaj. Şaşırtıcı bir şekilde, bu sonuçlar, plazma zarındaki prestin moleküllerinin yoğunluğu çok yüksekse motor fonksiyonun tehlikeye girebileceğini düşündürmektedir. Burada açıklanan protokollerin, iyi bilinen hücre kültürü tekniklerinin doğru kullanımını gerektirdiğini hatırlamak önemlidir.

Ayrıca, antibiyotik kullanımından kaçınmayı unutmayın. Ek olarak, HEI-OC1 hücrelerinin fenotipinin ve yanıtının büyük ölçüde kültür parametrelerine bağlı olacağını unutmayın.