Name: Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, PIPAAm kaplı mikrofiltre kullanarak canlı dolaşım tümör hücrelerini (CTC) kandan yakalama ve salma yöntemini. Bu teknik metastaz araştırmalarında ve tedavi yanıtı izlemede kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmayı desteklemek için kan örneği bağışlayan tüm hastalara teşekkür ederiz. Klinik örnek alımındaki yardımları için Dr. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli ve Marc E. Lippman'a ve anlayışlı tartışmaları için Dr. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez'e teşekkür ederiz. Zheng Ao, Sheila ve David Fuente Kanser Biyolojisi Yüksek Lisans Programı, Sylvester Kapsamlı Kanser Merkezi'nden kısmi destek ve yardım için teşekkür eder.

Etik Beyanı: insan deneklerin haklarını korumak için, kan örnekleri IRB 20150020 altında Miami kurumsal inceleme kurulları Üniversitesi tarafından onaylanan protokoller altında bilgilendirilmiş onam aşağıdaki elde edilmiştir. NOT: CTC yakalamak için filtre edilecek Kan pıhtılaşmasını önlemek için bir EDTA tüp içinde toplanmalıdır. 1. Poli (N-izo-propylacrylamide) (PIPAAm) ile Mikrofiltre kaplanması <ol><li> butanol içinde bir% 10 ağırlık / hacim solüsyonu hazırlamak için PIPAAm tartılır. Çözelti berrak olana kadar bir vorteks ile karıştırın. </li><li> Kesme plastik mikroskop makas veya keskin bıçak bir çift ile yaklaşık 12 mm x 12 mm kareler içine ya kayar. Alternatif olarak, bir giyotin kullanın. NOT: Bu kareler spin kaplama işlemi sırasında filtreler için bir tutucu olarak görev yapacak. </li><li> düz kenar makas keskin çifti kullanılarak, 8 mm x 8 mm kareler halinde yuva gözenek mikrofiltre gofret kesti. </li><li> Plastik squa üzerine kesme filtreleri emniyete bir poliimid film bant kullanarakres önce adım 1.3 kesti. filtre alanının en az 7 mm x 7 mm un kaplı bantla böylece sadece kenar ve filtre köşesine sürün. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54435/54435fig2.jpg" /> Şekil 2:. PIPAAm Kaplama 8 mm x 8 mm mikrofiltre için mikro filtre Set-up Temsilcisi İllüstrasyon plastik mikroskop lamı 12 mm x 12 mm plastik kare kesim üzerine konumlandırılmış. Poliimid bant referans 15 izniyle kaplamaz PIPAAm.Reproduced dönmeye yerinde Mikrofiltreyi sabitlemek için kullanılır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54435/54435fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="5"><li> Spin-kaplayıcı vakum mandren üzerine, plastik meydanda sabitlenir Mikrofiltreyi yerleştirin. </li><li> Başlat, 10 saniye boyunca 500 rpm, 6.000 r: Aşağıdaki tarifi spin-kaplayıcı Program60 saniye, 10 saniye, Stop için 500 rpm için pm. </li><li> PIPAAm solüsyonu v tamamen standart bir plastik transfer pipet kullanarak mikrofiltre yüzeyini kaplayan ve sıkma kaplayıcı başlatmak için (1.1 hazırlanmış) w / yeterli% 10 koyun. </li><li> Kaplama işlemi tamamlandıktan sonra spin-kaplayıcı gelen PIPAAm kaplı Mikrofiltreyi çıkarın. depolama sırasında plastik kareye bağlı filtreyi bırakın. Not: Kaplanmış filtre kadar 3 ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. </li></ol> PIPAAm Kaplı mikro filtreli ile Filtrasyon Kaset 2. Montaj <ol><li> Hala bir petri içine plastik meydanında güvenli Mikrofiltreyi koyarak oda sıcaklığında PIPAAm kaplı Mikrofiltreyi rehydrate. mikrofiltre tamamen batık kadar 1x PBS ekleyin ve 5 dakika bekletin. </li><li> hidrasyon adımından sonra, makas bir çift kullanarak Polyimide film bandı keserek plastik meydanından filtreyi bırakın. NOT: sahip filtrenin hangi tarafı dikkat edinPIPAAm kaplama. </li><li> 2 polidimetilsiloksan (PDMS) adet, bir conta / mühür olarak hareket ile birlikte üst ve alt akrilik parça arasında Mikrofiltreyi sandviç ile, filtrasyon kaset içine Mikrofiltreyi birleştirin. Filtreyi güvence altına almak ve sıkı bir mühür sağlamak için kliplerle akrilik kaseti Kelepçe. Not: Örnek süzülür olarak, hücreler filtrenin (Şekil 1) PIPAAm kaplanmış yüzeyi üzerine çekilecek olan şekilde PIPAAm kaplama yukarı bakacak şekilde olmalıdır. </li></ol> Mikro filtreli gelen yakalama ve CTC Release Kan Örneğinin 3. Filtrasyon <ol><li> Her şırınga pompası marka kendi kullanıcı arayüzü var gibi, pompanın kullanım kılavuzuna bakın ve 75ml / saat hızında akış ve 20 ml seviyesini ayarlamak için şırınga pompası programlayın. </li><li> McCoy (ticari olarak temin edilebilir) hücre kültür ortamının Sıcak 3 mi, 37 ° C (% 10 Fetal Sığır Serumu ve% 1 penisilin ve streptomisin içinde ilave edilerek hazırlanır). <br /&gt; NOT:. Ortam seçimi ya da başka bu kültür hücreleri hücrelerin normal kültürlü olan ortamı kullanmak, sağlıklı donör kana çivili edilecek bir model sistem deneme ise hastanın kanser türüne göre olacak emin değilseniz, lütfen hücreler satın alındı ​​şirketi tarafından sağlanan kültür kılavuzuna / yöntem. </li><li> 7.5 ml kan örnek ticari olarak temin edilebilir Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS), 7.5 ml ilave edilir ve 25 ml&#39;lik bir şırınga içine Bu seyreltilmiş kan aspire. 1 seyreltme: 10 ml kan kullanılırsa, daha sonra 1 elde etmek için 10 ml eşit hacimde HBSS ile karıştırmak HBSS, mesela 1:. Not: kan örneği 1 eşit hacimde seyreltilmiştir için HBSS hacmi ayarlayın. </li><li> şırınga ile filtrasyon kasetini Engage ve şırınga pompası üzerine yerleştirin. aracılığıyla akışını toplamak ve pompayı çalıştırmak için alt 50 ml&#39;lik tüp yerleştirin. NOT: filtrasyon kabaca 10- 12 dakika sürer. Tüm filtreleme adımlarından yapılacak olanAdım 3.8 de dahil olmak üzere normal oda sıcaklığında (20-25 ° C) dışarı </li><li> filtrasyon işlemi tamamlandıktan sonra, hangi tarafın PIPAAm kaplı bir yüzeye yakalanan hücreleri vardır üst olduğunu filtrasyon kaset alma notu boşa. Aspire, yeni bir şırınganın içine ılık kültür ortamı 1 ml. </li><li> ortamı içeren şırınga ile filtrasyon kaseti yeniden meşgul, ama filtre PIPAAm kaplı yüzey uzakta şırınga bakacak şekilde şu anda kasetin alt ucunu meşgul. NOT: Bu nazik ters akışı uygulanmak suretiyle yuva gözeneklerin içine gömülü olabilecek hücreleri serbest olacaktır. </li><li> geri şırınga pompası üzerine şırınga yerleştirin ve sağ filtrasyon kaset altında küçük bir petri veya 6-plaka tutun. 100 ml / saat akış hızını ayarlamak ve pompayı çalıştırın. </li><li> filtre ile tüm medya Pass ve akış yoluyla petri toplamak. tüm medya geçmek için bekleyin ve daha sonra pompayı durdurun ve şırınga a çıkarmakpompadan ND filtrasyon kaseti. </li><li> şırınga filtrasyon kaseti ayırın ve kaset filtreyi almak için açın. PIPAAm yüzey gözenekleri hücreleri serbest zaman ters akışı toplamak için kullanılan aynı petri içine aşağı bakacak şekilde filtreyi yerleştirin. Sıcak medyanın geri kalanını ekleyin ve 37 ° C&#39;de ayarlanmış bir kültür inkübatör içine petri yerleştirin. </li><li> 30 dakika sonra tüm hücreleri filtreden çıkacak. Bununla birlikte, tüm hücreleri ayırmak sağlamak için en fazla 24 saat için bir petri filtre bırakın. NOT: Alternatif olarak, serbest hücreler mikrosantrifüj tüp içine toplanabilir birkaç örnek isim PCR, ELISA, Western Blot gibi diğer aşağı analiz yapmak için. </li><li> Kültür içerisinde 24 saat sonra, dikkatli bir şekilde forseps kullanılarak mikro filtre çıkarın. NOT: Filtre şu anda atılabilir hücreler ondan serbest bırakıldı gibi. </li><li> Yavaşça yukarı ve bir 1000 &amp; # kullanarak aşağı kültür ortamı pipetle181; l pipet, eritrosit ve yeniden askıya periferik kan mononükleer hücre filtresine yakaladı ve CTC ile plaka salınan (hücre). gevşek bağlı kanser hücrelerini ayrılmakta önlemek için dikkatli ve yavaşça bu eylemi gerçekleştirmek. Dikkatle taze ortam önceden ısıtılmış 37 ° C ile bağlı kanser hücreleri ve yerine geride bırakarak yeniden süspansiyon haline eritrositleri ve PBMC içeren tüm orta kaldırmak. NOT: Aşırı eritrositler tek yıkamadan sonra varsa Bu adım bir kez tekrar edilebilir. </li></ol> 4. CTC Canlılık Değerlendirilmesi <ol><li> Canlı / Ölü Assay 8 kullanarak kültürlü CTC canlılığı değerlendirmek. NOT: Çok sayıda canlı / Ölü tahliller piyasada bulunmaktadır. Üreticinin protokolü takip yüksek tavsiye edilir. Bu deney için kullanılan ticari deney kiti için malzemeler / reaktif maddeler listesine bakınız. </li></ol>

<ol><li>Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).</li>
<li>de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+predict+survival+benefit+from+treatment+in+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).</li>
<li>Cohen, S. J., Punt, C. J. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer.</a> Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).</li>
<li>Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells+and+Response+to+Chemotherapy+in+Metastatic+Breast+Cancer%3A+SWOG+S0500%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500.</a> J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).</li>
<li>Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cellular+sample+preparation+using+a+Centrifuge-on-a-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip.</a> Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).</li>
<li>Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Sci. Transl. Med. 5 (179), 179(2013).</li>
<li>Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Based+Isolation+of+Circulating+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Microcavity+Array+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System.</a> PLoS ONE. 8 (6), (2013).</li>
<li>Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinched+flow+coupled+shear-modulated+inertial+microfluidics+for+high-throughput+rare+blood+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation.</a> Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).</li>
<li>Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -T., Yobas, L., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+label+free+biochip+for+the+detection+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+in+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients.</a> Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).</li>
<li>Vona, G., Sabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+by+size+of+epithelial+tumor+cells+a+new+method+for+the+immunomorphological+and+molecular+characterization+of+circulatingtumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).</li>
<li>Marrinucci, D., Bethel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Case+study+of+the+morphologic+variation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+pathology%22%5BJournal%5D)">Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells.</a> Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).</li>
<li>Lin, H. K., Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+filter-based+microdevice+for+detection+and+characterization+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells.</a> Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).</li>
<li>Williams, A., Rawal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+translation+of+a+novel+microfilter+technology+Capture%2C+characterization+and+culture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PHT%22%5BJournal%5D)">Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells.</a> PHT. , 220-223 (2013).</li>
<li>Ao, Z., Parasido, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoresponsive+release+of+viable+microfiltrated+Circulating+Tumor+Cells+%28CTCs%29+for+precision+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications.</a> Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).</li>
<li>Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+detection+platform+which+measures+telomerase+activity+from+live+circulating+tumor+cells+captured+on+a+microfilter%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter.</a> Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).</li>
<li>Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+on-off+switching+polymers+for+drug+permeation+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release.</a> J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).</li>
<li>Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermo-responsive+polymeric+surfaces%3B+control+of+attachment+and+detachment+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Makromol.+Chemie%2C+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells.</a> Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).</li>
<li>Deng, Y., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci. Rep. 4, 7499(2014).</li>
<li>Hou, S., Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+stimulated+release+of+circulating+tumor+cells+on+polymer-grafted+silicon+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures.</a> Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+and+selective+cell+retention+and+recovery+from+whole+blood+by+electroactive+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).</li>
<li>Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+HER2+phenotype+of+circulating+tumor+cells+in+metastatic+breast+cancer%3A+a+retrospective+study+in+107+patients%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients.</a> BMC cancer. 15 (1), 403(2015).</li>
</ol>

Bu çalışmanın bir kısmı, 62/219,808 sayılı ABD Geçici Patent Başvurusu kapsamında korunmaktadır. Siddarth Rawal, bu Makalede kullanılan filtreleri ve filtre kasetlerini/kartuşlarını ticari olarak üreten Circulogix Inc.'in hissedarıdır.

tam kandan canlı CTC yakalamak ve mikro filtre onları bırakmadan süreci oldukça basittir; ancak birkaç kritik noktalar kayda değer bulunmaktadır. Nesnenin steril bir durumda tüm süreç boyunca korunur Tüm hücre kültürü gibi, zorunludur. filtreden hücrelerin serbest tekniği için temel PIPAAm sıcaklık duyarlı arayüz özelliklerinin istismar dayalı olarak PIPAAm filtreyi kaplanması ilk adımı, kritik öneme sahiptir. Filtre etkili kaplanmış temin kaplamadan önce, bir mikroskop altında filtre üzerinde bir gözenek (slot gözenek ...

Metastatik hastalık çoğu kanser ölümlerinin sorumludur. metastaz prognostik ve arkadaşı teşhis biyomarker gelişmekte kanser ve tedavisinde çok önemlidir. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC), tümör yayılması ve metastazında bir rol oynar. Ayrıca, &#39;sıvı biyopsi&#39; belirteç olarak kolay erişilebilir olması, kanser hastalarının içinde CTC kanser biyomarkır araştırma yuva &#39;periferik kan bir şekilde artmaktadır.&#39; 3 - CTC iyi meme, prostat ve kolorektal kanser 1 dahil olmak üzere çeşitli kanser ayarları prognostik belirteç olarak onaylanmıştır. Ancak, CTC alanındaki son gelişmeler girişimsel klinik çalışmalarda 4&#39;te gösterildiği gibi bu nadir hücrelerin sadece numaralandırma, klinik yarar sınırlı olduğunu belirtti. Bu nedenle, CTC moleküler ve fonksiyonel karakterizasyon için izin teknolojileri için gelişmekte olan bir ihtiyaç vardır. Şu anda, sadece birkaç teknolojileri fo izin veren mevcutr olmayan antijen önyargılı, canlı yakalama ve CTC serbest bırakılması, sağlam aşağı moleküler ve fonksiyonel analiz 5,6 sağlayarak. Bu mikrofabrike cihaz çoğunluğu mikroakışkan platformlara birleştirilebilir ve bu şekilde 2-4 mi 7 arasında olduğu, işlenebilir kan miktarının, sınırlayıcı bir faktör sahiptir - 10. CTC büyük yakalama ve ilgi bu hücrelerin izole edilmesi olasılığını engeller, bu nedenle daha da işlenebilir kan miktarını azaltarak, kan alımı (7.5 mi) tek bir tüp içinde nadirdir. Biz büyük tümör hücreleri ve daha küçük normal kan hücrelerinin 11,12 arasında boyut farklılıkları istismar CTC yakalanması için Parylene C membran mikrofiltre cihazları iki tür geliştirdik. Biz daha önce yuvarlak gözenek numaralandırma filtre bildirdi ve mikrofiltre CTC yakalama verimliliği üstün olduğu gösterilmiştir, bir FDA onaylı bir platform ile karşılaştırdık varkanser hastası kan numunelerinin 13,14 için. Ancak, yuvarlak filtre bir sınırlama filtrasyon öncesinde formaldehit esaslı fiksatif kullanmak için bir gerekliliktir. Bu süreç, filtreleme işlemi sırasında kesme stresi ve basınca dayanacak şekilde izin verirken hücre morfolojisi muhafaza eder. Sayım ve moleküler çalışmalar on-chip 13 yapılabilir iken, fiksatif fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek için yeteneğini bozar. Bu sınırlama gidermek için, biz filtrasyon öncesinde hücreler (Şekil 1) düzeltmek için gerekliliğini ortadan bir yarık gözenek filtresi geliştirdi. yuva gözenek geometrisi (6 mikron genişlik x 40 mm uzunluk yuvası gözenekler) sadece kısmen hala diğer kan hücreleri için serbest geçiş izin ve hücre hasarına yol açacak basınç artışı hafifletilmesi böylece gözenek kapatılmasıy ve süre tümör hücrelerinin yakalanmasını sağlar ve nihai patlama 15,16 yuvası gözenek kartuş hangi sandviç 2 akrilik parçadan oluşmaktadırBir conta olarak polidimetilsiloksan (PDMS) oyunculuk ile üst ve alt parça arasında yuva gözenek filtresi bir sızıntı geçirmez conta 14,15 (Şekil 1) temin etmek. Yuva gözenekli filtre yakalama verimliliği yüksek olsa da, (Tablo 1), çekilen CTC yerine yapışma 15 aracılı hücre dışı matrisin (ECM) güçlü özel olmayan elektrostatik etkileşimlerle Parylene Cı zara bağlıdır. örneğin ters akım veya hücre kazıyıcı kullanımı gibi yöntemler etkili filtreden hücreleri serbest ya da hücre hasarı ve hücre ölümüne neden başarısız. Biz bir salım stratejisi 15 formüle PIPAAm bir sıradışı kullanım araştırdı. PIPAAm 32 ° C&#39;lik bir solüsyon ısısına C17 bir geri düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST&#39;nin) faz geçişine maruz kalan bir polimerdir. Geleneksel olarak, PIPAAm bu özellik yaygın doku mühendisliği uygulamaları için incelenmiştir. Tipik olarak, hücrelerPIPAAm kültüre PIPAAm hidrofobik olduğu zaman, 37 ° C&#39;de yüzeyleri kaplama. Kültür sıcaklığı PIPAAm kaplı yüzey hidratlanmış 17,18 olur 32 ° C&#39;nin altında kaydırılır, hücreler daha sonra bir tabaka olarak ayrılabilir. Bu, oda sıcaklığına (32 ° C) bir filtrasyon işlemi gerçekleştirerek ve daha sonra 37 ° C&#39;de muhafaza kültür ortamı filtre yerleştirilerek hücre serbest sağlayarak bu termal özelliği kullandı. Bu sıcaklıkta, PIPAAm polimer tabakası ve böylece elektro statik olarak bağlanmış hücreleri 15 (Şekil 1), serbest bırakma, hidrofobik hale gelir. Sıcaklığa duyarlı bir yöntem yanı sıra diğer yöntemler başarılı 19 uygun bir CTC yakalama elde etmek ve serbest bırakmak için uygulanmıştır, ancak - bildirilen bu teknolojilerin tarafından paylaşılan 21, bir anahtar muhtemel bir mahsur da hepsi CTC yakalama için bir antijene bağımlı ilkesi uygulanır olmasıdır. Antijen temelli CTC yakalama, gösterildiği gibi previously, önyargılı CTC analiz 11,14 yol açabilir. Örneğin, çok sayıda afinite bazlı teknolojileri CTC yakalama EpCAM bağlanan antikor kullanır. Bununla birlikte, CTC, bu teknolojilerin EpCAM, düşük ve EpCAM negatif CTC ihmal yol EpCAM çeşitli düzeylerde eksprese gösterilmiştir. non-epitelyal kökenli CTC melanom ve sarkom ayarlarında gibi CTC gibi ilgi göstermektedir Ayrıca, sınırlamalar meydana gelebilir. Böylece, antijen bazlı yakalama tarafından tanıtıldı potansiyel önyargı olmadan yaşayabilir CTC yakalama ve serbest bırakılması için olanak sağlayan bir teknolojidir arzu edilmektedir. Önemlisi, mikrofiltre yakalama cihazı tamamen dayalı büyüklükte ve bırakma stratejisi belli yüzey belirteçlerinin varlığı agnostik mesafesindedir. Biz PIPAAm kaplı mikro filtre istihdam etkin ve verimli bir yakalama ve alt analizler için CTC serbest bırakmak için yeteneği sağlayarak, metastatik sürecinin anlayışımızı genişletmek için yardımcı olacağına inanıyoruz. güçlü Bu mayısially kolaylıkla izlenebilir ve kanser hastası yönetiminde yardım edilebilir bir biyobelirteç sağlamak gibi yeni hedefli sistemik tedaviler de yönlendirilebilir olabilir için yeni moleküller maruz kalmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Yuva Filtresi</td><td>Circulogix Inc.</td><td>MSF-01</td><td>Kan veya idrardan CTC filtrasyonu için farklı boyutta filtreler mevcuttur (www.circulogixinc.com)</td></tr> <tr><td>poli ( N -izo-propilakrilamid) (PIPAAm) &nbsp;</td><td>Ploysciences Inc.</td><td>21458</td><td>Tehlikesiz. Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7906</td><td>İyi havalandırılan alanda kullanım</td></tr><tr><td>Plastik Mikroskop Slaytları</td><td>Cole-Parmer</td><td>48510-30</td><td>8mmx8mm filtre karesini tutmak için balya olacaksa herhangi bir plastik slayt veya alternatif olarak herhangi bir kare (Metal, Akrilik vb.) kullanılabilir</td></tr><tr><td>Spin Kaplayıcı</td><td>Özel Kaplama Sistemleri</td><td>SCS G3 Spin Kaplayıcı</td><td>Alet</td></tr><tr><td>Poliimid Bant</td><td>Uline</td><td>S-7595</td><td>Poliimid, birden fazla satıcıdan (Amazon, Kaptontape.com) satın alınabilen Kapton Bandının genel adıdır.HBSS</td></tr><tr><td>- Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Petri kapları 35 x 10 mm</td><td>VWR</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofiltre Kaset</td><td>Circulogix Inc.</td><td>FC-01</td><td>Özel catridges, kan veya idrardan CTC için filtrasyona dayalı olarak mevcuttur&nbsp;</td></tr><tr><td>Şırınga 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>KD scientific&nbsp;</td><td>78-0100V</td><td>25 ml'lik bir şırınga tutabilen herhangi bir şırınga pompası kullanılabilir</td></tr><tr><td>Cellstar 50 ml Santrifüj tüpü</td><td>VWR</td><td>82050-322</td><td></td></tr><tr><td>Greiner Bio One 6 kuyulu plaka</td><td>VWR</td><td>89131-688</td><td>Yüzey hücre adezyonu için uygun olduğu ve itici olmadığı sürece herhangi bir marka kullanılabilir</td></tr><tr><td>SKBR3 Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>Canlı Ölü Test</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L3224</td><td>Canlı hücreleri değerlendirmek için makul bir analiz sağlayabilen herhangi bir tahlil işe yarayacaktır</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü İnkübatörü</td><td>VWR</td><td>98000-368</td><td>Hücre kültürü için kullanılabilecek herhangi bir inkübatör yeterli olacaktır</td></tr></tbody></table>

yakalama ve kan gelen canlı sirkülasyon tümör hücrelerinin yayın

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

Bu alt-analiz ve / veya kültür için yonga bu hücrelerin serbest bırakılması ile birlikte, bütün kandan canlı dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) boyutu esas yakalanması için bir yöntem ortaya koymaktadır. Strateji CTC ve yakalanan CTC thermoresponsive uygulanabilir serbest bırakılması için bir poli kaplama (N-ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) yakalamak için yeni bir Parylene C membran yuvası gözenek mikrofiltre kullanımını kullanır. Canlı hücrelerin yakalama tipik filtrasyon işlemi ile ilgili makaslama stresi azaltmak belirli boyutlara sahip bir yuva gözenek geometrisi tasarımı yararlanarak etkindir. mikrofiltre yüksek yakalama verimliliği sergiler iken, bu hücrelerin serbest bırakma olmayan saçmadır. örneğin ters akım ya da hücre kazıma gibi teknikler kullanıldığında, genellikle, hücrelerin sadece küçük bir yüzdesi serbest bırakılır. Parylene Cı membrana bu epitelyal kanser hücrelerinin güçlü yapışma spesifik olmayan elektrostatik etkileşim atfedilebilir. th önlem olaraketkisi, biz PIPAAm kaplamanın kullanılması istihdam ve filtre hücreleri serbest bırakmak için termal duyarlı arayüz özelliklerinin kullandı. Kan önce oda sıcaklığında süzülür. 32 ° C&#39;nin altında, PIPAAm hidrofiliktir. Bundan sonra, filtre, kültür ortamı ya da hidrofobik getirilmesi ve daha sonra elektro statik olarak bağlanmış hücreleri serbest PIPAAm sonuçlanır 37 ° C&#39;de muhafaza edilen bir tampon ya yerleştirilir.

Sağlıklı donörlerin kan kullanılarak (bir aydınlatılmış onam aşağıdaki Miami IRB 20150020 Üniversitesi tarafından onaylanan bir protokol çerçevesinde elde edilen) kültür kanser hücrelerinin, canlı dolaşan tümör hücrelerinin (CTC), elde edilen yakalama, serbest bırakılması ve alma verimliliği serbest bırakılması için thermoresponsive tekniği ile çivili % 94 ±% 9,% 82 ±% 5 ve% 77 ±% 5 (Tablo 1) 15. Karşılaştırıldığında, kaplanmamış filtrelerin bırakma ve alma ve...

Protokol, bir poli (N-ISO-propylacrylamide) etkili bir yakalama ve canlı dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) arasında thermoresponsive salınması için (PIPAAm) kaplanmış mikro filtre sunulmaktadır kullanılması. Bu yöntem analizleri ve karakterizasyonu, aşağı off-çip kültürü için hastaların kan ve canlı CTC sonraki sürümünden CTC yakalanmasını sağlar.

Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Bu tekniğin genel amacı, tam kandan canlı dolaşan tümör hücrelerini veya CTC'leri etkili bir şekilde yakalamaktır. Bu CTC'ler kültüre alınabilir veya fikse edilmemiş örnekler gerektiren ileri analizler için kullanılabilir. Bu yöntem, metastaz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Ayrıca hastalık progresyonunu ve tedaviye yanıtı takip etmek ve nüks riskini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu tekniğin avantajı, biyobelirteç ekspresyonundan bağımsız olarak, herhangi bir solid tümörden canlı CTC'lerin etiketsiz yakalanmasını sağlayabilmesidir. Filtre üzerinde in-situ kültür yapmak yerine, CTC'lerin ardından RNA analizi ve kültürü gerçekleştirmek istediğimiz için öncelikle CTC'lerin filtreden serbest bırakılması fikrini geliştirdik.Deneye başlamak için, bütanol içeren 15 mililitrelik bir tüp içerisinde %10 ağırlık/hacim çözeltisi hazırlayacak kadar PIPAAm tartın. Çözelti berraklaşana kadar tüpü vorteksleyin. Ardından, plastik mikroskop lamlarını bir makas yardımıyla yaklaşık 12 milimetre x 12 milimetrelik kareler şeklinde kesin.Ardından, keskin bir düz kenarlı makas kullanarak, yarık gözenekli bir mikrofiltre gofretini sekiz milimetreye sekiz milimetrelik kar

capture-and-release-of-viable-circulating-tumor-cells-from-blood

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Sirkülasyon tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) birçok metastatik kanser prognostik bulunmaktadır. Bu el yazması altın standart CellSearch sistemi (CSS) CTC sayım platformu ve golleri ortak yanlış sınıflandırma hatalar açıklanır. Buna ek olarak, iki uyarlanmış protokolleri bu teknolojiyi kullanarak metastaz klinik öncesi fare modellerinde kapalı zaman eğrilerinin ve CTC numaralandırma kullanıcı tanımlı işaretleyici karakterizasyonu için tarif edilmiştir.

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, hepatosellüler karsinom (HCC) metastazı sinjeneik fare tümörü modelinin tam kanından CTC'lerin izolasyonu ve yayılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Tümör hücreleri ayırdetmek için yeni bir yaklaşım sunuyoruz. Biz DNA Floresan -in-situile ayirt kombine-functionalized tıbbi tel CTCs doğrudan hasta kandan zenginleştirici vivo içinde kabil tarafından yakalanan hücre değerlendirmek için hibridizasyon.

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CtCs) karakterizasyonu çeviri araştırmalarında popüler bir konudur. Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hasta örneklerinde PD-L1 karakterizasyonu ve KTK'ların numaralandırılması için yarı otomatik immünoresans (IF) tahtını tanımlar.

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Kült WC'ler, belirli belirteç ifadesini test ederek ve ilaç direncini ve karaciğeri diğer olasılıklar arasında kolonileştirme yeteneğini değerlendirerek kanserin daha derin bir fonksiyonel karakterizasyonuna izin verir. Genel olarak, CTC kültürü hasta sonucunu iyileştirmek için kişiselleştirilmiş tıp için umut verici bir klinik araç olabilir.

Dolaşımdaki Tümör Hücre Hatları: Temel ve Çevirisel Araştırmalar için Yenilikçi Bir Araç

Bu makalede, hücresiz DNA ve dolaşımdaki tümör hücreleri gibi maddeleri tam kandan kolayca ve verimli bir şekilde ayırmak ve toplamak için otomatik ekipmanın uygulanması açıklanmaktadır.

Kanserle İlgili Maddelerin Klinik Örneklerden Otomatik Olarak Ayrılması ve Toplanması

Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.

Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu

Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler), kanserin ilerlemesi ve metastazının incelenmesi için kritik öneme sahiptir. Bu makale, CTC zenginleştirme ve tek CTC dizilimi için yüksek verimli, entegre bir protokol sunmakta, kontaminasyon ve dizileme maliyetlerini azaltırken yakalama verimliliğini ve CTC saflığını artırmakta, böylece hassas onkoloji araştırmalarını ve klinik uygulamaları ilerletmektedir.

Mikroakışkan Tabanlı Yüksek Verimli Dolaşımdaki Tümör Hücresi Sıralama ve Tek Hücre Dizileme Teknolojisi

Burada, akciğer kanseri hücrelerinde tam kan içeren ve sprek olan yapay bir örnekten nadir kanser hücrelerinin izole edilmesini gösteren bir protokol sunuyoruz. Protokol, yarı otomatik, etiketsiz hücre izolasyon platformu kullanır. Zenginleştirilmiş hücreler, epidermal büyüme faktörü reseptör mutasyonları için damlalı dijital PCR kullanılarak analiz edilir.

Dolaşan Nadir Hücrelerde Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör DNA Mutasyonlarının Profillenmesi Hücre İzolasyon Sistemi ve Damla Dijital PCR Kullanılarak

Öğrenin, PIPAAm kaplı mikrofiltre kullanarak canlı dolaşım tümör hücrelerini (CTC) kandan yakalama ve salma yöntemini. Bu teknik metastaz araştırmalarında ve tedavi yanıtı izlemede kullanılabilir.

Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın

Daha fazla video keşfet