Name: Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Keşfedin fare yumurtalık yağ padine doku transplantasyonu yöntemini. Bu teknik, dişi üreme sistemi epitel dokularının rejenerasyon ve neoplastik potansiyelini incelemek için uygun bir ortam sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz insan hücrelerini HIO118 sağlamak için, Dr. Andrew K. Godwin, Kansas Tıp Merkezi Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum. (; T028095 NYSTEM) Çocuk Sağlığı ve AFN İnsan Gelişimi (P50HD076210) Sağlık / National Institute National Institutes ve NYSTEM (C028125, C024174 ve hibe tarafından bu çalışmalar New York Kök Hücre Programı hibe ile desteklenmiştir T028095), Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü (CA182413) ve Ayn için Yumurtalık Kanseri Araştırma Fonu (327516) National Institutes of.

anlatılan tüm in vivo çalışma Cornell Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık Fat Pad Tahliller için 1. Örnek Hazırlıklar <ol><li> İzolasyon ve Kültür İlköğretim Tubal Epitel (TE) Hücreler <ol><li> CO 8 haftalık bakire β-aktin-Geliştirilmiş Yeşil floresan proteini (EFGP) ya da β-aktin-Discosoma Kırmızı Floresan Protein (DsRed) farelere servikal dislokasyon tarafından takip 2 yönetimini verici 6- euthanize. Bir ayak tutam başarılı ötenazi doğrulayın. </li><li> emici drape, ventral yüzü up bireysel fare yerleştirin ve sonra% 70 etanol ile karın silin. vücut orta hatta lateral kesi yaparak ve parmak uçları üzerinde ve fare baş ve kuyruk doğru kesi altında cilt çekme ile cilt açın. </li><li> Künt forseps kullanarak periton tutun ve vücut boşluğu açmak için ince makas ile kesim yapmak. Yavaşça intestin bobini itmekKenara e ve üreme organları bulun. </li><li> ince forseps ile bir uterin boynuz pick up ve rahim boynuzları ayrı noktasının üstünde 0,5 cm kesti. uterin boynuz tutarken, bağ uterin boynuz bağlı doku, rahim tüp, yumurtalık ve yumurtalık yağ yastığı uzak teşrih. 6 ml steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanak içinde parçalara üreme yolu yerleştirin. İkinci üreme sistemi ile devam edin. </li><li> Bir Biyogüvenlik kabine çanak aktarın ve steril PBS 6 ml dokular 3 kere yıkayın. Biyogüvenlik kabinede yer alan bir diseksiyon mikroskobu altında çalışmaya devam. ince cımbız ile uterin boynuz tut ve utero-tubal kavşakta kesilmesinin uterin tüp uterin boynuz ayırın. 25 G iğne kullanılarak yumurtalık çevreleyen yumurtalık bursa kesin. Not: Yumurtalık bursa çıkarıldıktan sonra, diseksiyon tamamlandıktan ve bireysel uterus borusu PBS çözeltisi kalır. </li><li> Bir Singl aktarın3,5 cm tabak PBS 50 ul damla e uterin boru ve 28 gauge iğne kullanılarak 0.1 mm parçalar halinde kıyma. 200 ul sindirim tamponu 1 (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) F12 (Ham) ortamı 300 birim ml -1 kollajenaz ve 100 ünite ml -1 Hyaluronidaz ile takviye edilmiş) ve transfer, bir% 5 CO, 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe 2 inkübatör. </li><li> İnkübasyondan sonra, 1 mi,% 0.25 Tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve 1 ml pipet ucu (aka mavi ucu), 3 dakika boyunca 20 kez yardımıyla çözelti askıya. (Ham) ortamı,% 2 fetal sığır serumu içeren 5 ml, + 4 ° C DMEM / F12 ekleyin. </li><li> ((Ham) ortamı 7 mg ml -1 Dispase II ve 10 ug ml -1 Deoksiribonükleaz I ile takviye santrifüj (600 RCF, 5 dakika, oda sıcaklığında (RT)), dokuları toplamak ve 1 mi sindirim tamponu 2 (DMEM F12 ekleme DNase I)). 1 ml pipet ti yardımıyla doku topağı 20 kez Askıyas. </li><li> 5 ml serum barındırmayan tüm fare tüp epitel büyüme ortamı (M-TE-GM, Tablo 1) ekleyin. </li><li> santrifüj hücreleri (600 RCF, 5 dakika, RT) toplayın. askıya alma ve hemasitometre hücreleri saymak, 1 ml M-TE-GM ekleyin. Tohum 1 x 10 5, 24, alçak bağlanma plakasında çukur başına 1 ml hücre ve 4 gün boyunca bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de M-TE-GM inkübe edin. </li><li> Her gün orta değiştirin. </li><li> Β-aktin EGFP ya da β-aktin-DsRed farelerden kültürlenen birincil süspansiyonu TE hücreleri tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması. <ol><li> 24-iyi düşük bağlanma plakaları TE süspansiyon kültürleri toplayın. 1 mi% 0.25 tripsin-EDTA ile santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ve askıya hücre peletleri. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 5 ml DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ekleyerek tripsin aktivitesi durdurun. Santrifüj (600 RCF, 5 dakika, RT) ile hücre pelletleri toplayın. </li></ol></li><li> Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C), 4 ml, hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. Buz üzerinde çalışarak, 10 ul PBS 1 x 10 5 hücre ekleyin, daha sonra 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. Not: steril koşullar altında bir Biyogüvenlik kabini içinde tüm diseksiyon ve doku kültürü çalışmaları yapın. </li></ol></li><li> Ölümsüzleştirilmiş insan hücre hattı hazırlanması <ol><li> Ayrıca büyüme lentivirüs EGFP ve -mCherry etiketli insan immortalize over yüzey epitel hücresi lineHIO118 80 kadar - bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 cm yemekler% 90 konfluansa. </li><li> 10 ml PBS ile iki kez bulaşık yıkama, çanak başına 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. 10 mi DMEM / F12,% 5 fetal sığır serumu içeren (Ham) ortamı ilave ederek reaksiyonu durdurun. Toplamaksantrifüjle hücre topakları (600 RCF, 5 dakika, RT). </li><li> Yıkama hücre topakları iki kez soğuk PBS (4 ° C) 10 ml hücre peleti 1 ml PBS ekleyin ve askıya. hemasitometre hücreleri saymak ve 1.7 ml santrifüj tüplerine transfer. </li><li> Buz üzerinde çalışarak, 1.0 x 10 6 Lenti mCherry etiketli hücreleri + 1.0 x 10 6 Lenti EGFP 10 ul PBS hücreleri etiketli ekleyin. 10 ul bazal membran matrisi ekleyin. Askıya ve hayvan odasına buz üzerinde taşımak. </li></ol></li><li> Rahim Tüp hazırlanması <ol><li> 1.1.1-1.1.5 adımlarda açıklandığı gibi, 6- PBS içinde 8 haftalık bakire β-aktin-DsRed farelere ayrı ayrı rahim tüpleri teşrih. Bir diseksiyon mikroskobu altında PBS 200 ul damla içine tek rahim tüpleri aktarın. Yavaşça Mezosalpinksi, rahim tüp segmentleri destekleyen geniş ligament bir kısmını kaldırarak cımbız ve 28 gauge iğne yardımı ile rahim tüpleri uncoil. 2 bir damla tek kıvrıldığı rahim tüpleri yerleştirin00 ul buz gibi soğuk PBS alıcının yumurtalık yağ yastığı maruz kalan ve nakli için hazır kadar. </li></ol></li></ol> 2. Yumurtalık Fat Pad Nakli Not: Her hayvan cerrahisi arasındaki aletleri dezenfekte edin. Hazırlayın ve önceden tüm ekipmanı düzenlemek. Bu dalak önler olarak sağ over yağ yastığı dorsal transplantasyon tercihli vardır. Ancak, alıcılar hem yumurtalık yağ takviyesinde nakli olabilir. <ol><li> singeneik fareler veya birincil hücre alıcıları olarak ağır kombine immün yetmezlik (SCID / NCR) fareler kullanın. insan hücreleri gibi HIO118 hücreleri kullanımı Nod / SCID / gama (NTG) fareler veya SCID fareleri için. </li><li> 0.15 ml / 10 g vücut ağırlığı dozunda 2,2,2-tribromoetanol tek bir intra-peritonal enjeksiyon, alıcı fare anestezisi. hayvan kaput, bir ısıtma pedi üzerinde hayvan koyun ve pedal refleks (ayak tutam) kaybı ile doğru anesthetization onaylayın. ise kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürünhayvan anestezi altında olduğunu. ameliyat sonrası ağrı tedavisi için 4 mg / g vücut ağırlığı dozunda analjezik Ketoprofen hayvan deri altına enjekte edilir. Not: Alternatif olarak, anestezi izofluran kullanımı. indüksiyon odasında hayvan koyun ve 0.8-1.5 L / dk ve% 2-3 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlayın. , Odasından anestezi hayvan kaldırmak o zaman ameliyat başlatmak, bir maskeden izofluran nefes ve 0.4-0.8 L / dk ve% 1.5 izofluran buharlaştırıcı oksijen debimetre ayarlamanızı sağlar. </li><li> 40. makası ile cerrahi alan Tıraş; , Bir alandan 2 kez cerrahi alan saç kaldırmak% 70 etanol ve ardından povidon-iyot üç antiseptik scrubs ile traş cildi hazırlamak ve steril bir örtü ile kaplayın. </li><li> Biyogüvenlik kabini içinde bulunan bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan taşımak. doğrudan yumurtalık yağ yastığı üzerinde dorsomedial pozisyonda bir kesi ile üreme yolu Açığa. Not: Critical adım: Hassas cilt kesi yara iyileşmesini kolaylaştırır, bir neşter kullanılması aşamasında 2.4 tavsiye edilir. </li><li> Kullanarak künt ince forseps sinirler ve büyük kan damarları zarar minimize dikkatle orta çizgisine doğru kesikten yumurtalık yağ yastığı çekin. Kritik Adım: kanama oluşursa, ameliyat durdurmak ve farklı bir konak hayvana nakli düşünün. </li><li> 28 ayar eğimli iğne yardımı ile diseksiyon mikroskobu kontrolü altında yumurtalık yağ yastığı içine 2-4 mm derinliğinde kesi, yumurtalık üzerinde 3-4 mm yapmak. Kritik adım: kesi sadece yağ yastığı yarısı geçer emin olun; alt tarafa tüm yol boyunca delme sızıntı olur. hızlı olun ve bu aşamadan sonra gecikmeden devam edin. </li><li> hücre nakli için, hücre bazal membran matris karışımı 10-20 ul bir şırınga (30 iğne) doldurmak ve yağ yastığı kesi içine enjekte edilir. rahim tüp nakli için, rahim tüp zekâ pick uph ince forseps ve 10 yer - 20 ul bazal membran matrisinin buz üzerinde tutulmalıdır. Bir 0.1-10 / 20 ul kullanarak XL (3 mm kısaltılmış) filtre ucu doku ve taban membran matris süspansiyonu pick up ve yağ yastığı kesi içine bırakın mezun oldu. </li><li> bazal membran matris kuvvetlendirmek ve geri periton içine üreme yolu yerleştirmek için 5 dakika bekleyin. 2 cerrahi sütür stiches ve iki küçük yara klipleri veya cerrahi sütür ile deri ile kasların kapatın. </li><li> Tekrarlayın kontrol olarak görev yapacak hayvan kontra yanal yağ yastığı içine PBS-bazal membran matris karışımı nakli 2.4-2.8 adımları tekrarlayın. Kritik adım: ısı kaybı anestezi farelerde hızlıdır çünkü Ameliyattan sonra bir ısıtma pedi üzerinde hayvan yerleştirin. </li><li> Hayvan yerli kafes içinde bir ısıtma pedi üzerinde kurtarmak ve anestezi tamamen uyanık kadar hayvan inceleyelim. o sterna korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayınl recumbence. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. </li><li> Ameliyat sonrası kafese yiyecek kuru ek olarak kafes içinde ön-ıslak gıda pelet bir avuç koyun. Önümüzdeki birkaç gün için gerekirse ameliyat sonrası analjezik uygulayın ve günlük yara inceleyin. yara enfeksiyonu oluşursa onaylı hayvan protokole göre antibiyotik uygulayın. Yara tamamen kapalı olduğunda ameliyat sonrası yara klipleri 10 gün çıkartın. </li></ol> 3. Histoloji ve Image Acquisition <ol><li> Greft Toplanması ve Korunması <ol><li> 4 mi 10x PBS ve 10 ml% 16 paraformaldehit çözeltisi ile 26 ml GKD 2 O karıştırılarak% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir blok aşılanan yumurtalık yumurtalık yağ yastığı, uterin tüp, 1.1.1-1.1.4 adımda tarif edildiği gibi, 0.5 cm rahim teşrih. Hemen 2 mi% 4 paraformaldehid içinde yer ve oda sıcaklığında, 2 saat süre ile düzeltin. Aynı hayvandan olmayan engrafted teşrihBir kontrol olarak PBS-bazal membran matris karışımı ile nakledilen kontralateral over yağ yastığı sistemi (adım 2.9 bakınız). Düzeltmek ve aynı şekilde işlem. </li><li> sabitleme yıkamadan sonra, 5 dakika boyunca PBS ile üç kere, doku ve 4 ° C de PBS içinde bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> yumurtalık yağ yastığı tüm montaj görüntüleme için 3.2.1 adıma geçin. Not: görüntü alma dokular dondurulmuş olabilir sonra (3.3.1) ya da parafine (3.3.2) için işlenmiş. 4 ° C&#39;de PBS içinde% 30 sukroz içinde bir gece inkübasyon donmuş dokular kalitesini artırır. </li></ol></li><li> Görüntü edinme <ol><li> Bir floresan eki, renkli kamera ve Plan ile donatılmış 4, 10x hedefleri ve stereomikroskopta, epi-floresan eki ve yüksek çözünürlüklü renkli kamera ile donatılmış PBS dolu yemekleri ve ters bir mikroskop kullanılarak görüntüde yumurtalık yağ yastığı sistemleri-bütün montaj yerleştirebilirsiniz apo 1xWD70, ED Planı 1.5xWD45 hedefleri. </li></ol></li><li> histoloji <ol><li> Takip etmetüm montaj görüntü toplama (3.2.1) Laboratuvar film ve forseps kullanarak bir 2 x 1 cm parçası üzerinde dondurulmuş doku örnekleri için orta gömme bir 200-500 ul damla yerleştirin damlasına kadar doku aktarın. bir kenarda filmi Pick up ve 1.8 ml kriyojenik flakon doku orta damla aktarın. şişeyi kapatın ve sıvı azot içine dalma. -80 ° C&#39;de donmuş dokular saklayın. </li><li> Alternatif olarak, standart parafine devam edin. Her adım için doku hacminin 20-40 hacimleri kullanın. <ol><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 65 etanol içerisinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 70 etanol içinde dokuların bırakın. Bu aşamada örnekler oda sıcaklığında ay depolanabilir. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 90 etanol içerisinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca bir kez% 95 etanol içinde dokuların bırakın. </li><li> Oda sıcaklığında hafifçe çalkalanarak, 30 dakika boyunca iki kez mutlak etanol (200 proof) içinde dokuların bırakın. </li> &lt;li&gt; RT&#39;de hafifçe sallayarak, 30 dakika boyunca kloroform iki kez dokuları daldırın. </li><li> 58 ° C &#39;de yavaşça çalkalanarak 30 dakika için parafin içine bir kez dokuları bırakın. </li><li> 58 ° C &#39;de yavaşça çalkalanarak 12 saat için parafin içine bir kez dokuları bırakın. </li><li> 58 ° C &#39;de, 3 saat parafin kez dokuları bırakın. </li><li> Metal histoloji kalıplarında dokuları koyun ve 58 ° C parafin ile kalıpları doldurun. parafin üstüne plastik bir histoloji kaseti ekleyin ve + 4 ° C&#39;ye kadar parafin soğutmak. Oda sıcaklığında parafin doku blok ve mağaza ayıklayın. Not: Parafin sıcaklığı immünohistokimyasal için uygun dokuda optimal korunması için 58 ° C&#39;yi geçmemelidir. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, Örnek İşleme Jel ile Parafin Gömme hazırlanın. <ol><li> PBS aspire ve% 70 etanol ile tüm montaj dokuları aktarın. 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. bir su banyosu içinde, ön-ısıtma numune, 60 ° C&#39;ye jel işlem. </li><li> Pipette laboratuar film kaplı Petri kabı üzerine numune işleme jel 200 ul. Kullanarak ince diseksiyon forseps numune işleme jel düşmesi tüm montaj doku sistemini aktarmak. </li><li> örnek işleme jel yatağından oda sıcaklığında katılaşan, ya da 4 ° C &#39;de 10 dakika süre ile fiş katılaşmasına izin verin. </li><li> biyopsi köpük pedler arasına sıkıştırılan histoloji doku kasetlerde örnek işleme jel gömülü doku yerleştirin. adımlarda 3.3.2-3.3.2.10 gibi parafin gömün. Not: Numune işleme jel gömme kaybını önler ve küçük kırılgan doku örneklerinin korunmasını sağlar. Not: dondurma ya da parafine korunmuş dokular immünohistokimyasal 14,15 için uygundur. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+human+mammary+tissues+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model.</a> Nature protocols. 1, 206-214 (2006).</li>
<li>Shackleton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+heterogeneity+of+breast+carcinomas+and+the+cancer+stem+cell+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis.</a> Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).</li>
<li>Koren, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIK3CA%28H1047R%29+induces+multipotency+and+multi-lineage+mammary+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours.</a> Nature. 525, 114-118 (2015).</li>
<li>Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -P., Roy-Burman, P. Prostate stem cells and cancer in animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNikitin%2C+AY+%22Stem+Cells+and+Cancer%22">Stem Cells and Cancer</a>. Bagley, R. G., Teicher, B. A. , Humana Press. New York, NY. 199-216 (2009).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160, 324-338 (2015).</li>
<li>Lu, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cell+populations+in+sweat+glands+and+ducts+reveals+roles+in+homeostasis+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair.</a> Cell. 150, 136-150 (2012).</li>
<li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495, 241-245 (2013).</li>
<li>Orsulic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+ovarian+cancer+by+defined+multiple+genetic+changes+in+a+mouse+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system.</a> Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).</li>
<li>Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ovarian+transplants+to+rescue+a+transgenic+line+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice.</a> Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).</li>
<li>Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+therapeutic+treatments+in+an+orthotopic+mouse+model+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Albihn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+capsular+material+by+equine+trophoblast+transplanted+into+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice.</a> Reproduction. 125, 855-863 (2003).</li>
<li>Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+knock-in+Foxj1%28CreERT2%3A%3AGFP%29+mouse+for+recombination+in+epithelial+cells+with+motile+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia.</a> Genesis. 52, 350-358 (2014).</li>
<li>Perets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+the+fallopian+tube+secretory+epithelium+leads+to+high-grade+serous+ovarian+cancer+in+Brca%3BTp53%3BPten+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models.</a> Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).</li>
<li>Capo-Chichi, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+alterations+of+the+extracellular+environment+of+ovarian+surface+epithelial+cells+in+premalignant+transformation%2C+tumorigenicity%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis.</a> Cancer. 95, 1802-1815 (2002).</li>
<li>Roland, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+surface+and+cyst+epithelial+basement+membranes+and+preneoplastic+morphologic+changes+in+prophylactic+oophorectomies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies.</a> Cancer. 98, 2607-2623 (2003).</li>
<li>Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+stem+cell+niche+in+the+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Oncol%22%5BJournal%5D)">Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers.</a> Mol Cell Oncol. 1, 963435(2014).</li>
<li>Ng, A., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+and+fimbrial+stem+cells%3A+biology%2C+niche+and+cancer+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).</li>
<li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+origin+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469, 314-322 (2011).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).</li>
<li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+high-resolution+imaging+of+epithelial+ovarian+cancer+by+laparoscopic+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy.</a> Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Epitel hücrelerin ve dokuların doğru teslimat saptanmasına izin verir, bir yumurtalık yağ yastığı nakli deneyi kurduk. Yumurtalık yağ yastığı tahlil nakli prosedürü daha az teknik açıdan zor intrabursal enjeksiyon 10-12 daha ve daha düzgün ve intraperitoneal enjeksiyon 9 ile karşılaştırıldığında nakledilen hücrelerin tam yerini sağlar. Aynı zamanda, iyi bir rahim tüp gibi bir organ, uzun süreli nakli için uygundur. Önemlisi, yumurtalık yağ yastığı kadın üreme sisteminin epitel için tanıdık bir mikro sağlar. Bu rejenerasyon ve habis dönüşüm sırasında insan ve fare yumurtalık ve tubal epitel hücrelerinin moleküler ve hücresel çalışmalar için özellikle uygun olacaktır. Diğer organlarda aksine, çok az çalışma dişi r epitelde tanımlanması ve kök hücrelerin karakterizasyonuna odaklanmıştıreproductive yolu 18,19. Birçok kanser yetişkin kök hücrelerin 20 kaynaklandığı düşünülmektedir, çünkü bu tür çalışmalar büyük önem taşımaktadır. Epitelyal over kanserlerinin henüz hücresel kökenleri 18 derece tartışmalı kalır. Epitelyal over kanserleri, yumurtalık kanserlerinin çoğunluğu için hesap ve ABD&#39;de 21 kadın tüm kanser bağlı ölümlerin arasında 5. sırada yer almaktadır. Mevcut transplantasyon teknikleri 9-12 üzerinde çeşitli avantajları ile ortotopik tahlil Böylece gelişme büyük ölçüde bu alandaki çalışmaları kolaylaştıracaktır. yumurtalık yağ yastığı yüzeysel konumu göz önüne alındığında, küçük hayvan görüntüleme sistemleri güçlü floresan veya bioluminescent gazetecilere ile etiketlenmiş engraftments takip etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu doğrusal olmayan mikroskopi 22 minimal invaziv yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme deneyleri, kurulması mümkün olmalıdır. yumurtalık yağ yastığı da organ kültürleri tutulabilir, böylece izinyakından hücrelerin organizasyonu ve hücre dışı matriks yansıtan koşullar altında normal ve neoplastik epitel üç boyutlu kültür ing. Gelecekteki çalışmalar bu umut verici olanakları ele almalıdır. Birkaç kritik adımlar dikkate alınmalıdır. bir ısıtma yastığı sağlanması ve ameliyat sırasında sıcak kemirgenleri tutarak büyük ölçüde hayatta kalma oranını artırır. yağ yastığı taşıma araçlarının Sterilite engrafted sistemler steril tutulmasını sağlar. Bizim deneyim, nakli büyüme geriliği önemli kanama sonuçlarında. Önemlisi, yağ yastığı kesi kesin yapılmalıdır yağ yastığı yırtılma veya kanama nedenleri aracılığıyla delinmesiyle çünkü. Koagülantlar gerekli kanamayı durdurmak için kullanılmalıdır. gelişmez engraftments takdirde, enjekte edilen hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu dikkate alınmalıdır. İlk başarılı çıkıntılar transplantasyon sonrası bir hafta kadar erken gözlenen ve en görünür biri olmalıdır engraftments edilebilirİşlemden sonra ay. nakli için, daha büyük bir çapa (23-25 ​​G) iğneler (çapı 10 um) üzerinden büyük hücreler kesme önlemek için de kullanılabilir. Ancak, bu tür iğneler yağ yastığı daha travmatik olabilir ve bunların kullanımı önceden test edilmelidir. Deneyler için biz 6 ila 8 hafta eski donör ve alıcı fareler kullanılmıştır. her iki amaç için daha küçük veya daha büyük farenin kullanılabilir. Bununla birlikte, enjekte edilen hücrelerin sayısı ayarlanması gerekebilir. genç vericilerden over yağ yastıkları küçük boyutta da dikkate alınması gerekir. herhangi bir yöntem olduğu gibi, fare yumurtalık yağ yastığı nakli testinin bazı sınırlamalar vardır. singeneik immüno-kompetan farelerde kemirgen birincil hücreler / dokular için kullanılabilecek olsa da, bizim teknik NTG veya insan malzemenin nakli için SCID fareleri gerektirir. Insan epitelyum hücrelerinin gelişimini desteklemek için yağ yastığı humanize mümkün muhtemeldir. Ancak, henüz bu yaklaşımı test değil. Genç fe Kullanımıerkekler daha düşük üreme maliyetleri yol açabilir; Bununla birlikte, yetişkin bakire dişi fareler (8 ila 10 haftalık) ve böylece daha büyük bir örneklerin nakli sağlayan daha büyük bir yağ yastığı bulunmaktadır. Son olarak, laboratuvar personeli prosedürün zamanında ve başarılı bir şekilde yürütülmesini sağlamak, hayvan cerrahisi konusunda eğitilmelidir.

farelerde belirli vücut sitelerine hücre ve dokuların getirilmesini, Transplantasyon deneyleri, doku rejenerasyonu ve karsinogenez çalışmaları için önemli bir yaklaşımı temsil etmektedir. hücrelerin Ortotopik transplantasyonlar, yani, bir ana ortamın içine yerleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin tanımlanması için özellikle önemlidir. Meme kök hücrelerin varlığı ilk farelerin 1 bezi serbest meme yağ pedleri içine epitel meme bezi parçalarının nakli önerildi. Insanlaştırılmış fare yağ yastığı 2 Aşı deneyleri, insan primer meme epitelyal hücrelerinin yeniden üretilebilir potansiyel ve normal gelişim özetlemek için kullanılmıştır. Ayrıca, temizlenmiş ve memenin yağlı pedine fenotipik farklı hücre tiplerinin seri ve sınırlayıcı seyreltme transplantasyon meme kök hücrelerin 3-5 kendini yenileme ve multilinaj farklılaşmasını test etmek için çok önemliydi. combinat Transplantasyon deneyleriGenetik soy iyon meme karsinogeneziste 5 menşe hücrenin kanıt sağladı izleme. Böbrek kapsülü nakilleri sıklıkla putatif prostat kök hücreler 6 özelliklerini test etmek için kullanılmıştır. Normal ve neoplastik fare ve insan pankreas organoids ortotopik transplantasyon kanseri ilerlemesinde 7 değişmiş genleri ve yollar ortaya çıkardı. Yerli çevrenin önemi de sonra bu tür meme yağ yastıkları, omuz yağ pedleri ve arka cilt 8 olarak farklı yerlerde, içine ter bezlerinin engraftments farklı rejenerasyon gösterilmesi tarafından desteklenmektedir. Periton boşluğu ve yumurtalık bursa, genellikle dişi üreme yolunun 9-12 epitel hücrelerinin ortotopik transplantasyon için yerler olarak kullanılır. Bu yöntemlerin her ikisi de sınırlamaları bir dizi. hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu karın boşluğu farklı alanlarda implantasyon yol açar, bu şekilde comhücre büyümesini izlemek plicating. Ayrıca, mikro-varyasyonlar, örneğin damarlanma, innervasyon ve immün hücre temsil uzantısı olarak, periton boşluğu farklı alanlarda oldukça önemli olabilir. Yumurtalık bursa sıvının en fazla 10 ul enjekte etmeyi sağlamak, çok sınırlı bir hacme sahiptir. Bu önemli ölçüde tatbik edilebilir hücre miktarını sınırlar. Ayrıca, yumurtalık bursa içine enjeksiyonlar oldukça teknik olarak zor olabilir ve işlem süresi önemli miktarda gerektirir. Bu sınırlamaları gidermek için, biz yumurtalık yağ yastığı özelliklerinin avantajlarından almış. Fare yumurtalık yağ yastığı, büyük bir boyuta sahip yumurtalık ve rahim tüp bitişik ve cerrahi ile kolayca erişilebilir. At trofoblast mouse over yağ yastığı 13 naklediliyor edilebileceği bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemin ayrıntıları tarif edilmemiştir. Aynı zamanda bu benim eğer rapor değilmetod ile yetişkin hücre ve dokuları için uygulanabilir. Burada, fare ve dişinin üreme kanalında insan hücrelerinin nakli için güvenilir bir yöntem anlatılmaktadır, bu yöntem, aynı zamanda, uzun süreli, organ nakli için de uygulanabilir olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>25 gauge iğne</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>28 gauge iğne (ekli iğne ile hipodermik şırınga)</td><td>Kendall</td><td>30339</td><td>Parça Numarası: 8881500014</td></tr><tr><td>temel fibroblast büyüme faktörü-2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9786</td><td></td></tr><tr><td>bazal membran matrisi (Geltrex)</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actin-DsRed fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>6051</td><td>B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J</td></tr><tr><td>&beta;-aktin-EGFP fareleri</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>3291</td><td>C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>sığır albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>kloroform</td><td>VWR</td><td>EM-CX1058-1</td><td></td></tr><tr><td>kollajenaz/hyaluronidaz</td><td>Kök Hücre Teknolojiler</td><td>7912</td><td></td></tr><tr><td>kriyojenik şişeler</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>dispase II</td><td>Worthington</td><td>NPRO2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12 (HAM's)</td> <td>Corning</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI (Deoksiribonükleaz I)</td> <td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7900</td><td></td></tr><tr><td>donmuş doku örnekleri için gömme ortamı (OCT)</td><td>Sakura Finetek&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>epidermal büyüme faktörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>etanol 200 geçirmez</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td>% 70&nbsp;</td></tr><tr><td>fetal sığır serumu</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>filtre ucu 0.1-10 / 20 &mikro; l XL&nbsp;</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>FOXJ1 antikoru</td><td>eBioscience</td><td>E10109-1632</td><td>konsantrasyonda kullanılır 1: 1.000 (maskeleme yok)</td></tr> <tr><td>hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Zoetis</td><td>4396H</td><td></td></tr><tr><td>laboratuvar filmi (Parafilm M)</td> <td>Amerikan Ulusal Can</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>insülin-transferin-sodyum selenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I884</td><td></td></tr><tr><td>izofluran, 250 ml</td><td>Santa Cruz Hayvan Sağlığı</td><td>sc-363629Rx</td><td></td></tr><tr><td>düşük bağlantı plakası 24 kuyulu</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>MEM esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>metal histoloji kalıpları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>62527-22</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop, ters çevrilmiş</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop, stereo</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Nod/SCID/gama (NSG) fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>05557</td><td>NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ</td></tr><tr><td>paraformaldehit %16 çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>parafin (Paraplast, X-TRA)</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>23-021-401</td><td></td></tr><tr><td>PAX8 antikoru</td><td>Proteintech</td><td>10336-1-AP</td><td>1:1,000 konsantrasyonda kullanılır (maskeleme yok)</td></tr><tr><td>PBS (Fosfat Tamponlu Salin)</td><td>Corning</td><td>&nbsp; 21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>penisilin streptomisin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>şiddetli kombine immün yetmezlik (SCID/NCr) fareleri, BALB/C arka planı)</td><td>NCI-Frederick Hayvan Üretim Programı</td><td>01S11</td><td></td></tr><tr><td>sodyum piruvat</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>numune işleme jeli (HISTOGEL)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA,% 25</td> <td>Corning</td><td>25-053-Cl</td><td></td></tr></tbody></table>

fare yumurtalık yağ pad içine transplantasyon

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Farelerde ortotopik transplantasyon testleri, hücre yenilenmesi ve neoplastik transformasyon çalışmaları için paha biçilmezdir. Over yüzeyi ve tubal epitelin ortotopik transplantasyonu için yaygın yaklaşımlar, hücrelerin intraperitoneal ve intrabursal uygulamasını içerir. Bu yöntemlerin ilgili sınırlamaları, enjekte edilen hücrelerin kötü tanımlanmış konumunu ve sınırlı alan hacmini içerir. Ayrıca, nakledilen organların uzun süreli yapısal korunması için pek uygun değildirler. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, hücrelerin ve doku parçalarının fare yağ pedine sokulmasına dayanan alternatif bir yaklaşım geliştirdik. Fare yumurtalık yağ yastığı, yumurtalık ve uterus tüpünün (diğer adıyla yumurta kanalı, fallop tüpü) hemen yakınında bulunur ve bu organların hücreleri ve dokuları için tanıdık bir mikro ortam sağlar. Bizim yaklaşımımızda, floresan işaretli fare ve insan hücreleri ile uterus tüpünün parçaları minimal travmatik dorsal insizyon cerrahisi kullanılarak engrafte edilmektedir. Nakledilen hücreler ve bunların büyümesi, 40 günden fazla bir süre boyunca yumurtalık yağ yastığına kolayca yerleştirilir. Tüm uterus tüpünün uzun süreli nakli, tüm temel doku bileşenlerinin doğru bir şekilde korunmasına izin verir ve fibroz ve iltihaplanma gibi olumsuz yan etkilere neden olmaz. Yaklaşımımız, belirli hücre popülasyonlarının farklılaşması, rejeneratif ve neoplastik potansiyeli gibi önemli biyolojik soruları yanıtlamak için benzersiz bir şekilde uygulanabilir olmalıdır. Ayrıca, normal gelişim ve kanserde mikroçevresel faktörlerin çalışmaları için uygun olmalıdır.

Deneysel hücreler ve dokular doğru bir diseksiyon mikroskobu (Şekil 1) altında yumurtalık yağ yastığı içine transplante edilebilir. Örnekler her yerde görülen EGFP (Şekil 2A) ya da DsRed (Şekil 2B) ve HIO118 16,17 hücreleri MCherry ve EGFP lentivirüs ile işaretlenmiş insan immortalize over yüzey epitel hücrelerinin (F - Şekil 2C) eksprese eden farelerden türetilen birincil fare tüp epitel hücrelerini içerir. Yaklaşım, aynı zamanda, fare uterus borusu (Şekil 3) gibi organların, uzun süreli nakli için geçerlidir. Immünohistokimyasal boyanma göre, her iki kirpikli (FOXJ1 pozitif 14) ve salgı (PAX8 pozitif 15) hücreleri nakledilen dokuların (Şekil 3B ve E) tuba epiteli korunur. <imgalt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54444 / 54444fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1:. Transplantasyonu (ok) Yumurtalık Yağ Pad Nakli (A) Exposed alan. (B) Bir kesi 28 G iğne (ok) tarafından yapılır. Pipet (ok) (C) UT / bazal membran matris karışımı aşılanmasına. (D) UT engrafted (ok, parlak kırmızı, β-aktin-DsRed farelerin UT). FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. Ölçek çubuğu = 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54444/54444fig2.jpg" /> Şekil 2:. Nakledilen Fare İlköğretim Tüp Epitel Hücreleri ve İnsan Algılama ölümsüzleştirdi Yumurtalık Yüzey Epitel Hücreleri (A, B) Out<html> birincil fare tüp epitel hücrelerinin 8 gün singeneik fare transplantasyon sonrası (A, yeşil) ve β-aktin-DsRed (B, kırmızı) β-aktin EGFP farelerin (oklar) büyümeleri. (C, D), 10 gün NTG farelere transplantasyonu sonrası Lenti-EGFP (yeşil) veya Lenti mCherry (kırmızı) ile ya etiketli karışık HIO118 hücrelerinin (oklar) Engraftments. (D) (C, ok) Genişletilmiş alan. (E, F) Greft SCID fare (oklar) D, 43 gün C ile aynı hücre naklinden sonra geliştirdi. AD, F, floresan; E, parlak bir alan, FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A, B, DF) Ölçek çubuğu = 500 mikron; (C) Ölçek çubuğu = 1.600 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> reklam / 54444 / 54444fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: Uterus Tüp nakli Karakterizasyonu. (A) β-aktin-DsRed fare 6 gün yumurtalık yağ yastığı içine naklinden sonra tam rahim tüp (ok) (ok, parlak kırmızı). (B) (a) &#39;da gösterilen transplant yağ yastığı Floresan frozen. Kırmızı, DsRed; Mavi, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer counterstaining. (C) Rahim tüp greft (ok) NSG alıcı fare (ok) içine nakli sonrası 40 gün. Parafin bölümü. Doğru tüm ilke rahim tüp bileşenlerinin korunması ve transplantasyon ilişkili fibrozis ve inflamasyon olmayışına dikkat edin. Hematoksilen ve eozin boyama. (D, E) Algılama tuba epiteli işaretçileri Eşli kutu geni 8 (PAX8) ve Forkhead kutusunun J1 ve (FOXJ1 kahverengi nükleer renk, ok başları) gösterilen greft (oklar) hücrelerinde ( <sTrong&gt; C). Immünoperoksidaz sistemi. metil yeşili ile karşıt. FP, yağ yastığı; Ov, yumurtalık; UT, rahim tüp. (A) Ölçek çubuğu = 1,000 mikron; (B) Ölçek çubuğu = 200 mikron; (CE) Ölçek çubuğu = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54444/54444fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> 1x DMEM F12 (Ham&#39;ın) orta </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Sodyum pruvate </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Epidermal büyüme faktörü </td><td> 10 ng ml -1 </td></tr><tr><td> Temel fibroblast büyüme faktörü-2 </td><td> 10 ng ml -1 </td></tr><tr><td> hidrokortizon </td><td> 500 ng mL -1 </td></tr><tr><td> ensülin </td><td> 5 ug mi -1 </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> 5 ug mi -1 </td></tr><tr><td> sodyum selenit </td><td> 5 ng ml -1 </td></tr><tr><td> sığır albümini </td><td> % 0.10 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> 100 birim mi -1/100 ug mi -1 </td></tr><tr><td> Minimum gerekli ortam (MEM) temel olmayan amino asitler, </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Beta-merkaptoetanol </td><td> 10 -4 M </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Fare Tüp Epithelim Gelişim Ortamı (M-TE-GM) Bileşenler sol sütununda sıralanan 1x DMEM F12 belirtilen konsantrasyonlarda (Ham) orta, sağ sütunda çözündürülür. Nihai orta kompozisyon serbest serum olduğunu.

Bu kadın üreme sisteminin normal ve transforme epitel çalışmaları için uygun bir yumurtalık FAD pedi nakli deneyi tarif eder. Fare yağ yastığı, geniş doku parçalarının nakli izin verir cerrahi ve görüntüleme için kolay erişilebilir ve Müllerian kökenli dokular için en uygun yerli bir ortam sağlar.

Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Bu over yağ yastığı transplantasyon deneyinin genel amacı, kadın üreme sisteminin normal ve transforme olmuş epitellerinin en uygun doğal ortamda incelenmesini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, kadın üreme sistemindeki spesifik hücre popülasyonlarının farklılaşma, rejeneratif ve neoplastik potansiyeli gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fare over yağ yastığının hücrelerin ve büyük doku parçalarının transplantasyonuna olanak tanımasıdır.Cerrahi müdahale ve görüntüleme için kolayca erişilebilirdir. Periton boşluğu ve ovaryum bursası, kadın üreme sisteminin epitel hücrelerinin ortotopik transplantasyonu için sıklıkla kullanılan bölgelerdir. Bu yöntemlerin bir dizi kısıtlaması bulunmaktadır.Metin protokolüne uygun olarak beta-aktin EGFP veya beta-aktin DS red fareler ötanize edildikten sonra, her bir fare emici bir örtü üzerine ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Lateral orta hat boyunca bir insizyon yaparak cildi açın ve parmak uçlarınızla, insizyonun üstündeki ve altındaki cildi farenin başı ve kuyruğu yönüne doğru çekin. Künt pens kullanarak peritonyumu tutun ve vücut boşluğunu açmak için ince makas kullanın.Ardından, bağırsak kıvrımını nazikçe kenara itin ve üreme organlarını bulun. İnce uçlu bir penset ile uterus boynuzlarından birini tutun ve uterus boynuzlarının ayrıldığı noktanın 0,5 santimetre üzerinden kesin. Daha sonra, uterus boynuzunu tutmaya devam ederken uterus boynuzuna, uterus tüpüne, ovaryuma ve ovaryum yağ pedine yapışmış olan bağ dokusunu disseksiyonla ayırın.Diseke edilen üreme kanalını altı mililitre steril PBS içeren bir kaba yerleştirin ve metin protokolüne uygun olarak primer tübal epitel, veya TE, hücrelerini kültüre etmeden önce ikinci üreme kanalıyla devam edin. Altı ila sekiz haftalık bakire beta-actin DS red farelerin uterus kornularından tekil uterus tüplerini metin protokolüne uygun olarak PBS içinde diseke ettikten sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, tekil uterus tüplerini 200 mikrolitrelik bir PBS damlasına aktarın. Cımbız ve 28 gauge iğneler kullanarak, uterus tüpünün segmentlerini destekleyen geniş bağın bir kısmı olan mezosalpinksi uzaklaştırarak uterus tüplerini nazikçe açın.Alıcının over yağ pedi açığa çıkana ve nakli almaya hazır hale gelene kadar, tekli ve kısmen açılmış uterus tüplerini 200 µL'lik buz gibi soğuk PBS damlası içine yerleştirin. Yağ pedi transplantasyonunu gerçekleştirmek için hayvanı bir biyogüvenlik kabinine taşıyın. Siyngenik bir fareyi metin protokolüne uygun olarak anestezi altına aldıktan sonra, cerrahi alanın iki katı büyüklüğündeki bir bölgeyi tıraş etmek için 40 numara tıraş makinesi kullanın.Üç kez cerrahi yıkama gerçekleştirmek için önce povidon-iyot, ardından %70 etanol kullanın. Sonra, hayvanı bir diseksiyon mikroskobunun altına alın. Ardından, bir bistüri kullanarak over yağ yastığının hemen üzerindeki dorsomedial pozisyonda bir insizyon yapın ve üreme yolunu açığa çıkarın.Ardından, bölgeyi steril bir örtüyle kapatın. Sonrasında, küt uçlu ince pensler yardımıyla, sinirlere ve ana kan damarlarına verilen zararı en aza indirerek overal yağ yastığını insizyon boyunca orta hatta doğru dikkatlice çekin. Transplantların büyüme geriliğini önlemek için, yağ yastığı insizyonu mümkün olduğunca hassas yapılmalıdır; çünkü yağ yastığının tamamen yırtılması veya delinmesi kanamaya neden olur.Gerektiğinde kanamayı durdurmak için koagülanlar kullanılmalıdır. Ovaryumun 3 ila 4 mm üzerine, ovaryum yağ yastığına 2 ila 4 mm derinliğinde bir insizyon yapmak için 28 gauge eğimli bir iğne kullanın ve iğnenin yağ yastığının yalnızca yaklaşık yarısına kadar ilerlediğinden emin olun. Hücre transplantasyonları için, 30 gauge iğneli bir şırıngayı 10 ila 20 µL hücre bazal membran matrisi karışımı ile doldurun ve bunu yağ yastığı insizyonuna enjekte edin.Uterus tüpü transplantasyonu için, uterus tüpünü almak üzere ince bir pens kullanın ve tüpü buz üzerinde tutulan 10 ila 20 µL basement membrane matrix içerisine yerleştirin. Ardından, 0.1 ila 10 ila 20 µL'lik bir XL dereceli filtreli uçla dokuyu ve basement membrane matrix süspansiyonunu çekerek yağ pedi insizyonuna bırakın. Basement membrane matrix'in katılaşması için beş dakika bekleyin ve üreme kanalını tekrar peritona yerleştirin.İki adet cerrahi dikişle kasları kapatın ve cildi kapatmak için küçük yara klipsleri veya cerrahi dikişler kullanın. Transplantasyon sonrası, hayvanın metin protokolüne uygun olarak iyileşmesini sağlayın. Greftleri toplamak ve korumak için; 26 mililitre çift distile su, dört mililitre 10X PBS ve 10 mililitre %16 PFA çözeltisini karıştırarak %4 paraformaldehit veya PFA çözeltisi hazırlayın.Greftlenmiş over yağ yastığı, over, uterus tüpü ve uterusu tek bir blok halinde disseke ettikten sonra, dokuyu derhal iki mililitre %4 PFA içine yerleştirin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca fikse edin. Aynı hayvandan, greftlenmemiş kontralateral over yağ yastığı kontrol transplantını da benzer şekilde fikse edin ve işleyin. Fiksasyondan sonra dokuları PBS ile üç kez beşer dakika boyunca yıkayın ve dört santigrat derecede gece boyunca PBS içinde inkübe edin.Metin protokolüne uygun olarak tüm bağ görüntüleme ve histoloji işlemlerini gerçekleştirin. Bu deneyde, bu floresan görüntüde görüldüğü üzere, bir beta-aktin DS red faresinden alınan bir uterus tüpü, ovaryen yağ yastığına transplant edilmiş ve aşılanmıştır. Burada, syngeneic bir fareye transplantasyonun sekiz gün sonrası beta-aktin EGFP farelerinden ve beta-aktin DS red farelerinden elde edilen primer fare tübal epitel hücrelerinin dışa büyümleri gösterilmektedir.Bu görüntü, NSG fareye transplantasyondan 10 gün sonra, Lenti-eGFP veya Lenti-mCherry ile işaretlenmiş karışık HI0118 hücrelerinin engraftmanlarını göstermektedir. Bu panellerde oklar, SCID fareye karışık HI0118 hücrelerinin transplantasyonu sonrası 43 günlük bir grefti işaret etmektedir. Bu floresan görüntüde, beta-actin DS red fareden alınan komple bir uterin tüp, over yağ yastığına transplantasyondan altı gün sonrası ile gösterilmiştir.Bu panelde, floresan yağ yastığından alınan dondurulmuş bir kesit DAPI ile karşı boyanmıştır. Bir NSG-alıcı fareye transplantasyondan 40 gün sonraki bu uterus tüpü grefti, uterus tüpü bileşenlerinin tamamen korunduğunu, fibroz ve inflamasyonun olmadığını göstermektedir. Son olarak, siliyal ve sekretuar hücrelerin korunduğunu sırasıyla göstermek amacıyla kesitler, tübal epitel markerları Pax8 ve FOXJ1 için boyanmış ve metil yeşili ile karşı boyanmıştır.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken cerrahi plakların, reaktiflerin ve aletlerin önceden hazırlanması önemlidir. Bu prosedürün ardından, intravital görüntüleme ve anti-kanser ilaç enjeksiyonları gibi diğer yöntemler; kanser oluşumu ve anti-kanser tedavinin etkileri gibi ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu teknik, üreme biyolojisi ve over kanseri alanındaki araştırmacıların, kadın üreme sistemi dokularındaki normal kök hücre fonksiyonlarını ve kanser gelişimini incelemelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin ve uterus tüpü dokusunun nasıl izole edileceği ve ardından bunların yağ yastığına nasıl nakledileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sağkalım cerrahisi sırasında hayvanlarla steril koşullarda çalışmanın, başarılı bir sonuç için son derece önemli olduğunu unutmayın.Kemirgenleri sıcak tutmak için bir ısıtıcı ped sağlamak, hayatta kalma oranını önemli ölçüde artırır.

transplantation-into-the-mouse-ovarian-fat-pad

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Yumurtalık kanseri Ortotopik hayvan modellerinde daha iyi insan hastalığı çoğaltmak ve bu nedenle kanser progresyonu ve tedaviye tümör yanıt anlayışımızı geliştirmek. Bir fare modelinde lusiferaz ifade over tümör hücrelerinin bir İntrabursal enjeksiyon alır. Tedavi ağızdan sonda ile yönetilmektedir. Tümör büyüme...

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Bu videoda, yumurtalık kanseri taşıyan ötenazi uygulanmış bir dişi fare modeli kullanıyoruz. Daha sonra, metastatik kanser hücresi kolonizasyonunu incelemek için beş ana peritoneal organla ilişkili yağ depolarını veya yağ dokularını tanımlamak ve çıkarmak için bir protokol açıklıyoruz.

Peritoneal Yağ Depolarının Toplanması: Fare Modellerinde Peritoneal Yağ Dokularının Yumurtalık Kanseri Kolonizasyonunu İncelemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, deneysel hücrelerin ve doku parçalarının fare yumurtalık yağ yastığına nakli için bir test gösteriyoruz. Bu yöntem, non-invaziv tekniklerle hücre yenilenmesini ve tümör dönüşümünü izlemek için kullanılabilir.

Yumurtalık Yağ Yastığı Nakli Testi: Fare Modellerinde Hücreleri Yumurtalık Yağ Yastığına Sokmak İçin İn Vivo Bir Teknik

Bu videoda, tümör gelişimi ve periton metastazı incelemek için bir fare deneysel modeli oluşturma protokolü açıklanmaktadır. Bu yumurtalık kanseri modeli, insan epitelyal yumurtalık kanseri hücrelerinin dişi bir farenin yumurtalıklarına ortotopik olarak aşılanmasıyla üretilir.

Yumurtalık Kanseri Hücrelerinin Murin Yumurtalığına Ortotopik Aşılanması: Hücrelerin Peritoneal Yayılımını İncelemek için Bir Yumurtalık Kanseri Fare Modeli Oluşturma Prosedürü

Bu videoda, bir fare modelinden sağlam yumurtalık çıkarmak için uygulanan cerrahi bir prosedürü anlatıyoruz.

Fareden Sağlam Yumurtalık Alımı: Tam Yumurtalığı Murin Modelinden İzole Etmek İçin Cerrahi Bir İşlem

Peritoneal yağ dokularının, özellikle omentumun yumurtalık kanseri kolonizasyonunu incelemek için hem in vivo hem de ex vivo yaklaşımları uygulayan bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. Ayrıca, peritoneal yağ metastazlarını teşvik eden ve sütlü lekeler olarak bilinen omentumdaki bağışıklık hücresi yapılarını ölçmek ve analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Vivo ve Ex Vivo Periton yağ içinde Samanyolu Nokta Yapıların Yumurtalık Kanseri Metastatik Kolonizasyon Eğitim Yaklaşımlar içinde

Burada açıklanan orthotopic alıcı fare fizyolojisi yumurtalık etkisi değiştirmek için yumurtalık nakli iletişim kurallarıdır. Bu cerrahi işlem yumurtalık etkisi çeşitli türlerde dişi fareler duyurmak için kullanılan ve heterochronic nakillerine ve ex vivo tedaviler uğramıştır yumurtalık nakli içerebilir.

Dişi farelerde yumurtalık yaşlanma ve sağlık-ömrü etkisini araştırmak için Orthotopic yumurtalık nakli yordamları

Bazı hastalar için dondurma Yumurtalık dokusunun doğurganlık korunması için tek seçenektir. Ne yazık ki, gecikmiş revaskülarizasyon foliküler canlılığı zayıflatmaktadır. Burada, co için doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış kullanımı olarak birleştiren bir hücre tabanlı strateji perfüzyon biyoaktif moleküllerinin endotel hücreleri ile insan yumurtalık dokusu nakli için bir protokol mevcut.

İnsan yumurtalık dokusu mühendislik endotel hücreleri ile ortak nakli: bir hücre tabanlı strateji birleştirerek perfüzyon doğrudan parakrin teslim ile hızlandırılmış

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

Burada, diyabetik ve obez BTBR farelerinde böbrek fonksiyonlarını iyileştirirken kısırlığı, obeziteyi ve hiperglisemiyi tersine çevirmek için umut verici bir strateji sunan beyaz ve kahverengi bir yağ dokusu nakli protokolü sunuyoruz.

Beyaz ve Kahverengi Yağ Greftleri: Siyah ve Ten Rengi Brachyury (BTBR) Obez Farelerde Üreme, Metabolik ve Böbrek Eksikliklerini Düzeltmeye Yönelik Bir Yaklaşım

Burada, intraperitoneal ve intrabursal tümör modellerini oluşturmak için adım adım bir protokol sunuyoruz; bu protokol yumurtalık kanseri kanserinin ilerlemesi, metasatsi ve terapötik yanıt incelenmesidir. Ayrıca, bu modellerde tümör ilerlemesini izlemek için lusiferaz bazlı, invaziv olmayan in vivo görüntülemenin nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Metastatik Yumurtalık Kanseri ve Fare Terapötik Yanıtını İncelemek İçin Klinik Olarak İlgili Nakil Tümör Modelleri

Keşfedin fare yumurtalık yağ padine doku transplantasyonu yöntemini. Bu teknik, dişi üreme sistemi epitel dokularının rejenerasyon ve neoplastik potansiyelini incelemek için uygun bir ortam sağlar.

Fare Yumurtalık Yağ Pad içine Transplantasyon

Daha fazla video keşfet