Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

Bu metodolojinin genel amacı, doku mühendisliği uygulamaları için hidrojelleri çok kolay bir şekilde sentezlemektir. Bu yöntem, üç boyutlu hücre kültürü sistemlerinde yüksek hücre canlılığının korunma olasılığı gibi doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hızlı bir reaksiyon kullanarak, hücre canlılığını koruma yeteneklerini artırmak amacıyla hidrojel sistemlerini kolayca modifiye edebilmemizdir.

İskelet içine yerleştirilen hücrelerin hasarlı dokuyu yeniden yapılandırabilmesi nedeniyle, bu tekniğin etkileri omurilik yaralanması tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem, rejeneratif tıp kapsamındaki hücre tedavileri ve bunların birçok metodolojideki uygulamaları hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca kemik, kalp ve kıkırdak gibi diğer çeşitli sistemlerde de uygulanabilir.

RGD-azid türevini sentezlemek için, 50 miligram RGD'yi bir mililitre bir molar sodyum hidroksitte çözün. Ardından, 24 miligram 4-azidobütanoil klorürü iki mililitre tetrahidrofüranda çözün. RGD çözeltisinin tamamını sıfır derece santigrat sıcaklıkta, damla damla 4-azidobütanoil klorür çözeltisine ekleyin.

Oda sıcaklığına geri getirin ve gece boyunca karıştırın. Bir mililitre bir molar HCL ekleyin. Çözücüyü, bir döner evaporatör kullanarak düşük basınç altında uzaklaştırın.

Örnek, döteryum oksit veya D2O içinde çözülerek proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile karakterize edilir. PAA alkin modifikasyonunu gerçekleştirmek için, ağırlıkça %35'lik 200 miligram PAA çözeltisini 15 mililitre distile suda çözün. 15,4 miligram propargilamin hidroklorür ekleyin.

Ardından, 42,8 miligram HOBt'yi, asetonitril ve distile suyun bir bire bir oranındaki çözeltisinin 14 mililitresinde 50 °C'ye ısıtarak çözün. HOBt çözeltisinin tamamını oda sıcaklığındaki PAA çözeltisine ekleyin. Sonrasında, reaksiyon karışımına 53,6 miligram EDC ekleyin.

pH değerini 5,5'e ayarlamak için bir molar HCl kullanın ve reaksiyon sistemini oda sıcaklığında gece boyunca karıştırın. Ardından, 11,2 gram sodyum klorürü iki litre distile suda çözün. Daha sonra 200 µL %37 (ağırlıkça ağırlık) HCl ekleyin.

Çözeltiyi 3.5 kilodalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir membran kullanarak diyalize edin. Diyalizi üç gün boyunca gerçekleştirin. Diyaliz çözeltisini, her gün 200 microliter %37 ağırlıkça ağırlık HCL içeren iki litre taze hazırlanmış distile su ile değiştirin.

Nihai çözeltiyi -80 °C'de saklayın. Numuneyi D2O içerisinde çözerek, fonksiyonelleştirilmiş polimeri proton nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile karakterize edin. PAA-RGD polimerini sentezlemek için, 78 mg alkine modifiyeli PAA'yı 10 mL distile su içerisinde çözün.

Ardından, 25 mg RGD-azid türevini beş mL tetrahidrofuran içinde çözün. RGD çözeltisinin tamamını polimerik çözeltiye ekleyin. Son olarak, 2,2 mg bakır iyodür ekleyin.

Ve 2,2 mg sodyum askorbat. Elde edilen karışımı, karıştırarak 60 °C'de gece boyunca reflükse tabi tutun. Karışımı 25 °C'ye soğutun.

Çözeltiyi diyalize etmek için, 11,2 gram sodyum klorürün iki litre distile su içerisinde çözünmesini sağlayın ve 200 µL %37 ağırlıkça ağırlıkta HCl ekleyin. Diyalizi üç gün boyunca gerçekleştirin. Diyaliz çözeltisini, 200 µL %37 ağırlıkça ağırlıkta HCl içeren iki litre taze hazırlanmış distile su ile her gün değiştirin.

Ardından nihai çözeltiyi -80 °C'de bekletin. Elde edilen PAA-RGD polimerini, bileşenleri için yapıldığı şekilde karakterize edin ve saklayın. 40 mg karbomer ve 10 mg fonksiyonelleştirilmiş PAA'yı, oda sıcaklığında, tam çözünme gerçekleşene kadar 9 mL fosfat tamponlu salin içerisinde karıştırın.

Çözeltiye 400 mg PEG ekleyin ve 45 dakika boyunca karıştırmaya devam edin. Karıştırmayı durdurun ve sistemin 30 dakika boyunca çökelmesini bekleyin. Ardından pH değerini 7.4'e ayarlamak için 1 M sodyum hidroksit kullanın.

Elde edilen karışımın beş mililitresine, 25 miligram agaroz tozu ekleyin. Kaynayana kadar sistemi 500 watt gücündeki mikrodalga radyasyonu ile 30 saniye ila bir dakika boyunca ışınlayın. Ardından çözeltiyi elektromanyetik olarak 80 °C'ye ısıtın.

Karışımı, sıcaklığı 50 °C'ye düşene kadar oda sıcaklığında bırakın. Ardından, bir bire bir hacimsel oranında bir çözelti elde etmek için beş mililitre PBS ekleyin. 1,1 cm çapında çelik silindirler içeren 12'li çok kuyucuklu bir plaka hazırlayın.

Çözeltiden 500 µL'lik alikotlar alarak her bir çelik silindire yerleştirin. Sistemin tamamen jelleşmesi için plakayı 45 dakika boyunca dinlendirin. Hidrojelleri elde etmek için silindirleri paslanmaz çelik penset kullanarak çıkarın.

RGD-fonksiyonalize hidrojellerin fizikokimyasal özelliklerinin karakterizasyonu için metin protokolüne bakınız. Karbomer 974P, PAA-RGD ve PEG, agaroz ile birlikte mikrodalga ışınlamasının ardından istatistiksel rastgele bir polikondansasyona katılır. PEG ve agarozda bulunan hidroksil grupları, Karbomer 947P ve PAA-RGD'de bulunan karboksil grupları ile reaksiyona girerek ACPEG-RGD hidrojellerini oluşturur.

Reolojik özellikler değerlendirildiğinde, depolama modülünün kayıp modülden yaklaşık bir büyüklük mertebesi daha yüksek olduğu saptanmış olup, bu durum materyalin viskozdan ziyade elastik karakterde olduğunu göstermektedir. Dahası, düşük gerinme değerlerinde hidrojel davranışının elastik modül tarafından domine edildiği açıkça görülmektedir. Taramalı elektron mikroskobu, RGD fonksiyonelleştirilmiş bir hidrojel örneğinin ve fonksiyonelleştirilmemiş bir hidrojelin morfolojisini göstermektedir.

Her iki hidrojelin de, bazılarının içinde küçük gözenekler barındıran daha büyük gözeneklere ve gözenek duvarlarında fibriler ağlara sahip, birbirine bağlı gözeneklerden oluşan yüksek derecede dolanık bir yapıya sahip olduğu ortaya çıkmıştır. Benzer özellikler, RGD varlığının polimer ağını değiştirmediğini göstermektedir. Bu gelişmenin ardından, söz konusu teknik, doku mühendisliği alanındaki araştırmaların bu hücre kültürü sistemlerinin diğer çeşitli hastalıklardaki stabilitesini incelemesine yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı kök hücreleri koruma yeteneklerini artırarak hidrojellerin nasıl fonksiyonelleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.