Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma

Bu prosedürün genel amacı, nörosfer oluşumu ve klonal koşullar altında farklılaşma yoluyla belirli bir popülasyondaki nöral kök hücre frekansını belirlemektir. Bu yöntem; aday nöral kök hücre belirteçlerinin değerlendirilmesi, nöral kök hücrelerin saflaştırılması ve nöral kök hücrelerin nöral öncül hücrelerden ayırt edilmesi gibi nöral kök hücreler alanında temel kullanım alanlarına sahiptir. Bu yöntemin avantajları, nöral kök hücre frekansını belirlemeye yönelik mevcut yöntemlerden daha kısa olan 13 günlük bir sürede gerçekleştirilmesi ve klonal koşullar altında uygulanmasıdır.

Bu prosedüre başlamak için birinci günde, DMEM F12 medyumunu B27, EGF, BFGF ve penisilinle streptomisin ile birleştirerek NSC büyüme medyumunu hazırlayın. Ardından, E14.5 fare nörosferlerini bir mililitre NSC büyüme medyumu ve bir mililitre 0.05 normal Sodyum Hidroksit içerisinde oda sıcaklığında yedi dakika boyunca ayrıştırın. Hücreleri süspansiyon halinde tutmak için ara ara pipetle yukarı aşağı çekin, ardından alkaliyi nötralize etmek için bir mililitre 0.05 normal hidroklorik asit ekleyin.

Ardından, trypan-blue boyama ve bir hemositometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin. Bunun ardından, tekli E14.5 fare nörosfer hücrelerini, 96 kuyucuklu bir plakta 100 µL NSC büyüme ortamı içerisinde, mililitre başına 50 hücre veya daha düşük bir yoğunlukta ekleyin. Klonal nörosferler oluşturmak için hücreleri 37 °C'de, %5 CO2 ortamında bir hafta boyunca inkübe edin.

Şartlandırılmış ortam için nörosferleri kültürlemek amacıyla, üçüncü günde E14.5 fare nörosferlerini ayrıştırın ve tek hücreleri 10 santimetrelik bir kültür kabında, 10 mililitre NSC büyüme ortamında mililitre başına 20.000 hücre yoğunluğunda ekleyin. Ardından, toplu kültürlenmiş nörosferler üretmek için hücreleri 37 °C, %5 CO2 ortamında beş gün boyunca inkübe edin. Sekizinci günde; 700 mikrolitre %0,01 poly-L-lysine, 70 mikrolitre laminin (mililitre başına 1 mg ekleyerek) ve 6.230 mikrolitre PBS karıştırarak kaplama solüsyonunu hazırlayın.

Ardından, 10 santimetrelik bir kültür kabını yedi mililitre poli-L-lizin laminin çözeltisi ile 37 °C'de iki saat boyunca kaplayın. 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, dökme kültürlenmiş tüm nörosferleri 15 milimetrelik konik bir santrifüj tüpüne aktarın. Nörosferleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 171 ×g'de santrifüjleyin ve süpernatantı tamamen uzaklaştırın.

Ardından, DMEM F12 medyumunu B27 ve FBS ile birleştirerek NSC diferansiyasyon medyumunu hazırlayın. Nörosferlerin üzerine 10 mililitre NSC diferansiyasyon medyumu ekleyin ve nörosferleri yeniden süspand etmek için pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekin. Sonrasında, 10 santimetrelik kültür kabındaki poli-L-lizin laminini aspire edin ve 10 mililitre PBS ile bir kez yıkayın.

Tüm nörosferleri poli-L-lizin laminin kaplı 10 santimetrelik kültür kabına aktarın; nörosferlerin kaba yapışması için 37 °C ve %5 CO2'de gece boyunca inkübe edin. Sekizinci günde, mikroskop altında her kuyucukta oluşan nörosfer sayısını sayın; ardından 50 kuyucuklu bir chambered cover slip'in her kuyucuğunu 10 µL poli-L-lizin laminin kaplama solüsyonu ile 37 °C'de iki saat boyunca kaplayın. Daha sonra, her biri 30 mL PBS içeren üç adet 50 mL'lik konik santrifüj tüpü hazırlayın.

Steril penset kullanarak kaplanmış 50 kuyucuklu oda bölmeli lamı çıkarın, kaplama solüsyonunu yıkamak için oda bölmeli lamı sırasıyla birinci, ikinci ve ardından üçüncü PBS tüpüne daldırın. Sonrasında, oda bölmeli lamın kuyucuklarında kalan sıvıları aspire edin. 96 kuyucuklu plağın her bir kuyucuğundaki tüm besiyerini ve nörosferleri nazikçe tek bir 10 santimetre kültür kabına aktarın.

Pipet sütunu iki mikrolitreye ayarlanarak her seferinde yalnızca tek bir nörosferin alındığından emin olun; mikroskop altında, 10 mikrolitrelik pipet ucu takılmış bir P10 mikro pipet kullanarak örnek bir nörosfer seçin. Nörosferler mikroskop altında, laminer akışlı kabinde veya tezgahta seçilebilir. Ardından, nörosferi kaplanmış 50 kuyucuklu oda bölmeli lamelin bir kuyucuğunun merkezine aktarın.

Odacıklı lamın her bir kuyusunda bir nörosfer yer alana kadar işlemleri tekrarlayın. Ardından, odacıklı lamın her bir kuyusuna 10 µL NSC diferansiyasyon medyumu ekleyin. Odacıklı lamı 10 cm'lik kültür kabına yerleştirin.

10 santimetrelik bir kaba iki adede kadar bölmeli lam yerleştirilebilir. NSC farklılaşma ortamının kurumasını önlemek için kabın kenarları boyunca PBS pipetleyin. Bölmeli lamı 37 °C'de, %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.

Dokuzuncu günde, dökme kültürdeki nörosferlerden elde edilen kondisyonlu medyumu 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri veya kalıntıları temizlemek için, 20 mililitrelik steril bir şırınga kullanarak kondisyonlu medyumu 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Ardından, filtrelenmiş kondisyonlu medyumu tekrar 10 santimetrelik kültür kabına aktarın.

Ardından, steril pensler kullanarak, örnek nörosferler aşağı bakacak şekilde hazne dizaynlı lamellenin ters çevrilmiş halini kondisyonlu medyumun üzerine nazikçe yerleştirin. Hazne dizaynlı lamelliyle beraber örneği 37 °C ve %5 CO2 ortamında üç gün boyunca inkübe edin. 12. günde, steril pensler kullanarak hazne dizaynlı lamelli 10 cm'lik kültür kabından nazikçe çıkarın.

Koşullandırılmış medyumu yıkamak için lam örtüsünü yavaşça PBS'ye batırın. Ardından, lam örtüsünün kırılmasını önlemek için nazik ve yavaş bir şekilde hareket ederek silikon contayı lam örtüsünden soyun. Diferansiye olmuş nörosferlerin yapışık olduğu tarafı not edin.

Ardından, kapatma camı boyutunda kesilmiş bir parafin film parçası üzerine 1 mm %4 paraformaldehit pipetleyin. Kapatma camını, nörosferler paraformaldehit ile temas edecek şekilde aşağı bakacak şekilde parafin filmin üzerine nazikçe yerleştirin ve nörosferleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca sabitleyin. Burada, tekil nörosferler seçilmiş ve 50 kuyucuklu bölmeli bir kapatma camında üç gün boyunca farklılaştırılmıştır.

Bu görüntü, dapi ile boyanmış ve GFAP, TUJ1 ve O4 için immünostaynlanmış tripotent bir nörosferin temsili bir görüntüsüdür. Bu görüntü dapi, GFAP, TUJ1 ve O4'ün üst üste bindirilmiş halini göstermektedir. Bu protokol, bilinen bir NSC belirteci olan LeX'in NSC'leri zenginleştirme yeteneğini değerlendirmek için kullanılır. Bu grafik, LeX pozitif ve LeX negatif hücreler tarafından üretilen unipotent, bipotent ve tripotent nörosferlerin yüzdesini göstermektedir. LeX pozitif hücreler, LeX negatif hücrelere göre anlamlı derecede daha fazla tripotent nörosfer üretmektedir.

Bu tablo, LeX pozitif ve LeX negatif hücrelerin NSC frekansının, NFU ile tripoten nörosferlerin yüzdesinin çarpımı olarak hesaplandığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nöral kök hücre frekansını saymak için nörosferlerin klonal koşullar altında nasıl kültüre edilebileceğini ve diferansiye edilebileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalısınız. Bu yöntemi uygularken, nörosferler için optimal büyüme ve diferansiyasyon koşullarını sağlamak amacıyla taze hazırlanmış büyüme ve diferansiyasyon medyaları ile taze hazırlanmış kaplama solüsyonu kullanmak önemlidir.

Bu yöntem bir kez öğrenildikten sonra, nöral kök hücre sıklığını belirlemek için kullanılan mevcut yöntemlere kıyasla daha kısa bir süre olan 13 günde gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, yeni kök hücreleri zenginleştirmek ve kesin bir nöral kök hücre belirteci tanımlamak için nöral koloni oluşturan hücre testi gibi mevcut yöntemlerle birlikte kullanılabilir.