Nöral Kök Hücre Sayım klonal Tahliller Kullanma

Bu prosedürün genel amacı, klonal koşullar altında nörosfer oluşumu ve farklılaşması kullanılarak belirli bir popülasyondaki nöral kök hücre frekansını numaralandırmaktır. Bu yöntem, aday nöral kök hücre belirteçlerinin değerlendirilmesi, nöral kök hücrelerin saflaştırılması ve nöral kök hücrelerin nöral progenitörlerden ayırt edilmesi gibi nöral kök hücreler alanında önemli yardımcı programlara sahiptir. Bu yöntemin avantajları, nöral kök hücre frekansını numaralandırmak için mevcut yöntemlere göre daha kısa olan 13 gün sürmesi ve klonal koşullar altında gerçekleştirilmesidir.

Bu işleme başlamak için, birinci gün, DMEM F12 ortamını B27, EGF, BFGF ve penisilin streptomisin ile birleştirerek NSC büyüme ortamını hazırlayın. Daha sonra, E14.5 fare nörokürelerini bir mililitre NSC büyüme ortamında ve bir mililitre 0.05 normal Sodyum Hidroksit'te oda sıcaklığında yedi dakika boyunca ayırın. Hücreleri askıda tutmak için ara sıra yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından alkaliyi nötralize etmek için bir mililitre 0.05 normal hidroklorik asit ekleyin.

Bundan sonra, tripan mavisi boyama ve bir hemositometre kullanarak bir hücre sayımı yapın. Bu tohumu takiben, 96 oyuklu bir tabakta 100 mikrolitre NSC büyüme ortamında mililitre başına 50 hücre veya daha düşük bir yoğunlukta tek E14.5 fare nörosfer hücreleri. Klonal nöroküreler oluşturmak için hücreleri bir hafta boyunca 37 santigrat derecede,% 5 CO2'de inkübe edin.

Şartlandırılmış ortam için nörosferleri kültürlemek için, üçüncü günde E14.5 fare nörosferlerini ayırın ve tek hücreleri 10 santimetrelik bir kültür kabında 10 mililitre NSC büyüme ortamında mililitre başına 20.000 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Daha sonra, toplu kültürlenmiş nöroküreler oluşturmak için hücreleri beş gün boyunca 37 santigrat derecede,% 5 CO2'de inkübe edin. Sekizinci günde, 700 mikrolitre% 0.01 poli-L-lizin, 70 mikrolitre laminin, mililitre başına bir miligram ve 6.230 mikrolitre PBS ekleyerek kaplama çözeltisini hazırlayın.

Daha sonra, 10 santimetrelik bir kültür kabını, 37 santigrat derecede iki saat boyunca yedi mililitre poli-L-lizin laminin çözeltisi ile kaplayın. 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, tüm toplu kültürlenmiş nöroküreleri 15 milimetrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Nörosferleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 171 kez g'de santrifüjleyin ve süpernasyansı tamamen çıkarın.

Bundan sonra, DMEM F12 ortamını B27 ve FBS ile birleştirerek NSC farklılaşma ortamını hazırlayın. Nörosferlere 10 mililitre NSC farklılaşma ortamı ekleyin ve nörosferleri yeniden süspanse etmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra poli-L-lizin laminini 10 santimetrelik kültür kabından aspire edin ve bir kez 10 mililitre PBS ile yıkayın.

Tüm nörosferleri poli-L-lizin laminin kaplı 10 santimetrelik kültür kabına aktarın, gece boyunca 37 santigrat derecede, nörosferlerin tabağa yapışması için% 5 CO2'de inkübe edin. Sekizinci günde, mikroskop altında her bir oyukta oluşan nörokürelerin sayısını sayın, ardından 50 iyi odacıklı bir örtü fişinin her bir oyuğunu, 37 santigrat derecede iki saat boyunca 10 mikrolitre poli-L-lizin kaplama çözeltisi ile kaplayın. Ardından, her biri 30 mililitre PBS içeren üç adet 50 mililitrelik konik santrifüj tüpü hazırlayın.

Steril forseps kullanarak, kaplanmış 50 iyi odacıklı kapak kızağını çıkarın, odacıklı örtü kızağını PBS'nin ilk tüpüne, ardından ikincisine ve ardından kaplama solüsyonunu yıkamak için üçüncü PBS tüpüne daldırın. Daha sonra, odacıklı kapak kızağının kuyularından kalan sıvıyı aspire edin. Tüm ortamı ve nöroküreleri 96 oyuklu çanağın her bir oyuğundan tek bir 10 santimetrelik kültür kabına nazikçe aktarın.

Pipet sütununu mikroskop altında iki mikrolitreye ayarlayarak her seferinde yalnızca tek bir nörosferin toplandığından emin olun, 10 mikrolitrelik pipet ucu ile donatılmış bir P10 mikro pipet kullanarak bir örnek nörosfer seçin. Nörosferler mikroskop altında toplanabilir, laminer akış başlığına veya bir tezgah üstüne yerleştirilebilir. Daha sonra nörosferi, kaplanmış 50 iyi odacıklı kapak kızağının bir kuyusunun merkezine aktarın.

Odacıklı kapak kaymasının her bir oyuğu bir nörosfer içerene kadar prosedürleri tekrarlayın. Daha sonra, odacıklı kapak kızağının her bir oyuğuna 10 mikrolitre NSC farklılaşma ortamı ekleyin. Odacıklı kapak fişini 10 santimetrelik kültür kabına yerleştirin.

10 santimetrelik bir tabağa iki adede kadar odacıklı kapak fişi yerleştirilebilir. NSC farklılaşma ortamının kurumasını önlemek için PBS'yi tabağın kenarları boyunca pipetleyin. Odacıklı örtü kızağını gece boyunca 37 santigrat derece,% 5 CO2'de inkübe edin.

Dokuzuncu günde, şartlandırılmış ortamı toplu kültürlenmiş nörokürelerden 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. 20 mililitrelik steril bir şırınga kullanarak, herhangi bir hücre veya kalıntıyı temizlemek için şartlandırılmış ortamı 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Ardından, filtrelenmiş şartlandırılmış ortamı 10 santimetrelik kültür kabına geri aktarın.

Bundan sonra, steril forseps kullanarak, odacıklı kapak kızağını, numune nörosferleri aşağı bakacak şekilde ters çevrilmiş bir şekilde şartlandırılmış ortama nazikçe yerleştirin. Odacıklı örtü kayışını üç gün boyunca 37 santigrat derece,% 5 CO2'de inkübe edin. 12. günde, steril forseps kullanarak odacıklı kapak fişini 10 santimetrelik kültür kabından nazikçe çıkarın.

Şartlandırılmış ortamı yıkamak için kapak fişini yavaşça PBS'ye batırın. Ardından, silikon contayı kapak kızağından soyun, kapak kızağının kırılmasını önlemek için bunu nazikçe ve yavaşça yapın. Farklılaşmış nörosferlerin yapıştığı tarafa dikkat edin.

Bundan sonra, kapak fişinin boyutuna göre kesilmiş bir parça parafin filme bir milimetre %4 paraformaldehit pipetleyin. Kapak fişini, nörosferler paraformaldehit ile temas edecek şekilde aşağı bakacak şekilde parafin filmin üzerine nazikçe yerleştirin ve nörosferleri oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin. Burada, tek nörosferler seçildi ve üç gün boyunca 50 iyi odacıklı bir örtü astarında farklılaştırıldı.

Bu, dapi ile boyanmış bir tripotent nörosferin ve GFAP, TUJ1 ve O4 için immün olarak boyanmış bir temsili görüntüsüdür. Bu görüntüde dapi GFAP, TUJ1 ve O4'ün yer paylaşımı gösterilmektedir. Bu protokol, bilinen bir NSC belirteci olan LeX'in NSC'ler için zenginleştirme yeteneğini değerlendirmek için kullanılır. Bu grafik, LeX pozitif ve LeX negatif hücreler tarafından üretilen unipotent, bipotent ve tripotent nörokürelerin yüzdesini gösterir. Ve LeX pozitif hücreler, LeX negatiften önemli ölçüde daha fazla tripotent nöroküre üretir.

Bu tablo, LeX pozitif ve LeX negatif hücrelerin NSC frekansının, NFU'nun ürünü ve tripotent nörosferlerin yüzdesi olarak hesaplandığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, nöral kök hücre frekansını numaralandırmak için nörosferlerin klonal koşullar altında nasıl kültürlenebileceğini ve farklılaştırılabileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu yöntemi uygularken, nörosferler için en uygun büyüme ve farklılaşma koşullarını sağlamak için taze hazırlanmış büyüme ve farklılaşma ortamı ve taze hazırlanmış kaplama solüsyonu kullanmak önemlidir.

Bir kez ustalaştıktan sonra bu yöntem, nöral kök hücre frekansını belirlemek için mevcut yöntemlere kıyasla daha kısa bir süre olan 13 günde gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, daha yeni kök hücreleri zenginleştirmek ve kesin bir nöral kök hücre belirteci tanımlamak için nöral koloni oluşturan hücre testi gibi mevcut yöntemlerle birlikte kullanılabilir.