Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme Escherichia coli: Tasarım, Üretim ve Arıtma
November 16th, 2016
Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, in vitro katalitik reaktifler olarak kullanım için enzim dolu bakteri dış zar veziküllerini saflaştırmak ve karakterize etmektir. Bu enzim izolasyon tekniği, bakteriyel OMV'lerin kültür ortamından hasat edilmesine ve daha sonra bir organofosfat bileşiğinin hücresiz katalizini gerçekleştirmek için kullanılmasına izin verir. Bakteriyel OMV'ler içindeki yönlendirilmiş paketleme, genellikle kademeli ve sürekli bir enzim aktivitesi kaybıyla sonuçlanan geleneksel tekniklerin aksine, bir dizi reaksiyon ve depolama koşulu boyunca enzim stabilitesini önemli ölçüde iyileştirir.
Bu tekniğin etkileri, terapötiklerin geliştirilmesi, iyileştirme veya hücresiz katalitik sistemlerin geliştirilmesi gibi birçok alanda ilgili olan proteinlerin paketlenmesine kadar uzanır. Bu protokol, OMV'lerin E.coli'den saflaştırılmasını detaylandırırken, paketleme stratejisinde değişiklik yapılan teknikler, çeşitli mikrobiyal hücre kültürlerinden OMV saflaştırması için kolayca kullanılabilir. Metin protokolüne göre bakterilerde dış zar vezikülleri veya OMV'ler oluşturduktan sonra, sağlam bakteri kültür ortamını 15 dakika boyunca 7.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.
Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarın ve saklayın. Ardından, tüm bakterilerin ortamdan uzaklaştırıldığından emin olmak için süpernatanı ikinci bir dönüşten geçirin. Protein agregatlarını ve büyük hücresel materyali tasarruf edilen kültür ortamından çıkarmak için, çözeltiyi steril 10 ila 50 mililitrelik bir şırıngaya çekin.
Şırınganın ucunu cezbetmek için 0,45 mikronluk bir filtre takın. Ardından pistona bastırın ve akışı yeni bir tüpte toplayın. Alternatif olarak, kültür ortamını steril bir filtrasyon aparatına aktararak vakumla filtreleyin.
Emiş oluşturmak için üniteyi bir vakum pompasına veya lavabo aspiratörüne bağlayın. Filtrelenmiş ortamı yeni bir kaba aktarın. OMV'leri izole etmek için, filtrelenmiş kültür ortamını ultrasantrifüj tüplerine aktarın.
Kullanılan tüplere karşılık gelen bir rotor kullanarak ortamı üç saat boyunca yaklaşık 150.000 kez G ve dört santigrat derecede döndürün. Pelet kütlesi kaybını önlemek için ultrasantrifüjlemeden hemen sonra, OMV tükenmiş kültür ortamını, gözle görülebilen veya görülmeyebilen hafif kahverengi OMV peletinden boşaltın. Ultrasantrifüj sonrası oluşan OMV peleti, santrifüjleme vezikülüne sadece gevşek bir şekilde yapıştırılabilir.
Peletin yerinden çıkmamasını ve kaybolmamasını sağlamak için boşaltma sırasında dikkatli olunmalıdır. OMV parçacıklarının ortamdan tamamen tükendiğini doğrulamak için süpernatanı daha sonraki dinamik ışık saçılımı için saklayın. Peletin üzerine 0,5 ila bir mililitre steril filtrelenmiş PBS, PH 7.4 veya deneysel ihtiyaçlar veya koşullara göre belirlenen başka bir filtrelenmiş tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmesine izin verin.
Ardından, tüm peletin çözündüğünden emin olmak için saflaştırılmış OMV çözeltisini dikkatlice karıştırın. OMV boyut dağılımını belirlemek için, kullanılan cihaz için DLS nano parçacık izleme yazılımını açın. Mikroskobu açın ve mikroskop ve nano parçacık izleme ünitesi üzerindeki tüm yüzeyleri temizleyin.
Bir mililitrelik steril şırınga kullanarak, sisteme herhangi bir hava kabarcığı enjekte etmeden tüm görüntüleme penceresini kaplamaya özen göstererek, yaklaşık 0,5 mililitre OMV örneğini doğrudan partikül izleme cihazının görüntüleme penceresine ekleyin. Nano parçacık izleme ünitesini mikroskop tablasına yerleştirin ve lazeri açın. Ardından Yakala'yı tıklayın yazılımda.
Yazılım penceresinde bulunan önizleme ekranındaki parçacıkları görselleştirmek için mikroskop odağını ve s'yi ayarlayın. Parlak parçacıklar karanlık bir arka plan üzerinde net bir şekilde görüntülenene kadar kamera deklanşörünü ve kamera kazancını ayarlayın. Yakalama süresini 60 saniye olarak ayarlayın ve ardından Kaydet'i tıklayın.
İstendiğinde, örnek cihaz sıcaklığını girin, örneği etiketleyin ve her çalıştırmanın sonunda video verilerini kullanıcı tarafından belirlenen bir klasöre kaydedin. Tüm analiz parametrelerini otomatik algılama modunda tutun ve İşlem Sırası'na tıklayın. Partikül boyutu dağılımını ve konsantrasyonunu, yazılım tarafından belirlenen şekilde mililitre başına partikül olarak kaydedin.
OMV protein içeriğini belirlemek için, OMV saflık enzim üretimini değerlendirmek için SDS-PAGE ve Western Blots ve SpyCatcher veya SC'den SpyTag veya ST çapraz bağlantı verimliliğini kullanın. Hedef enzimlerin ve çapa proteininin ekspresyonunu doğrulamak zorunludur. Rekombinant proteinlerin ekspresyonu genellikle çeşitli nedenlerle başarısız olabilir ve OMV karakterizasyonundan önce başarılı protein üretimi doğrulanmalıdır.
Bir fosfoteriesteraz veya PTE aktivite testi yapmak için, 90 mikrolitre CHES içinde beş mikrolitre saflaştırılmış OMV'ye CHES tamponunda bir ila 1.000 seyreltme paraoksondan beş mikrolitre ekleyin. Kromojenik paraokson parçalanma ürünü p-nitrofenolün ilerlemesini izlemek için yaklaşık iki saatlik toplam reaksiyon süresi boyunca her 20 saniyede bir 405 nanometre ve 348 nanometrede absorbans okumaları yapın. Son olarak, metin protokolüne göre veri analizi yapın.
Burada, SEM yoluyla E.coli'den saflaştırılmış OMV'lerin morfolojisinin örnekleri gösterilmektedir. OMV'ler, parçacık izleme enstrümantasyonu kullanılarak belirlendiği gibi 50 ila 250 nanometre arasında değişir. Bu grafikte mutlak OMV konsantrasyonu gösterilmektedir.
N terminali OMP-A-ST, arabinoz ve IPTG varlığında PTE-SC ile birlikte dönüştürüldüğünde, kontrol örneklerine kıyasla OMV üretiminde önemli bir artış gözlendi. Burada görülen SDS-PAGE ve Western Blot'lar, OMP-A-ST, doğal OMP-A, PTE-SC ve OMP-A-ST-PTE-SC için OMV protein içeriğini ve rekombinant protein ekspresyonunu daha fazla karakterize eder. Bu şekilde, hücre peletlerinde, UC süpernatantında ve saflaştırılmış UC OMV peletlerinde genel PTE ekspresyon seviyeleri ve OMV paketleme verimliliği, kromojenik substrat olarak paraokson kullanılarak ilk hız ölçümleri ile belirlendi.
Burada, Triton X-100, paraoksonun bozulmamış OMV çift katmanları boyunca translokasyonunu doğrulamak için kullanıldı. Deterjanlı veya deterjansız çok az aktivite farkı vardı, bu da paraoksionun OMV üzerindeki endojen gözeneklerden serbestçe geçtiğini gösteriyor. Son olarak, bu deneyde görüldüğü gibi, PTE-SC kinetik verileri, bir arabinoz varlığında PTE-SC ve arabinoz aktivasyonu varlığında IPTG ve PTE-SC ile birlikte dönüştürülmüş N terminali OMP-A-ST için standart bir Michaelis-Menten enzim kinetik denklemine uygundur.
Tüm genetik yapılar yapıldıktan ve onaylandıktan sonra, enzim paketleme ve OMV saflaştırması iki günlük bir süre içinde gerçekleştirilebilir. Yeni bir yapı geliştirildiğinde OMV'leri doğrulamak ve karakterize etmek için üçüncü bir gün gereklidir. Bu prosedürü denerken, tüm malzemelerin ve santrifüj ekipmanının güvenlik derecelerini doğrulamayı unutmamak önemlidir.
Ek olarak, bir sonrakine geçmeden önce her adımın başarısını doğrulamak önemlidir. Burada açıklanan karakterizasyon adımları, enzim paketlemesini ve OMV morfolojisini doğrulamak için diğerleriyle desteklenebilir. Protein konsantrasyonu, lipid içeriği, LPS konsantrasyonu ve diğer birçok özellik, farklı yüklere ve addüksiyon koşullarına göre değişebilir ve aşağı akış uygulamalarını etkileyebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, enzim dolgulu OMV'lerin nasıl saflaştırılacağı ve karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız ve ayrıca enzim kargosunun aktivitesini değerlendirmek için ön tahliller yapmanız gerekir. Bakteri ve kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun aseptik teknik ve kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, bakterilerden türetilen enzimle dolu dış zarf veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve uygulamasını belirtir. Bu OMV'ler enzim stabilitesini artırarak onları hücre içi katalizi dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygun kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Mikrobiyoloji
- Enzim Teknolojisi
Arka Plan
- Dış zarf vezikülleri (OMV) bakteriler tarafından doğal olarak salınan nanopartiküllerdir.
- OMV'ler enzimleri kapsülleyerek, geleneksel yöntemlere kıyasla stabilitelerini artırabilir.
- Bu teknik, OMV'lerin tedavi geliştirme ve çevresel iyileştirme gibi çeşitli uygulamalarda kullanılmasına olanak tanır.
- Protokol, E. coli'den türetilen OMV'lere odaklanır ancak diğer mikrobiyal kültürler için de uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- In vitro katalitik uygulamalar için enzimle dolu OMV'leri saflaştırmak ve karakterize etmek.
- Çeşitli koşullar altında uzun süreli aktivite için enzim stabilitesini artırmak.
- OMV'lerin terapötik ve katalitik gibi birden fazla alanda potansiyelini keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Kültür ortamından bakteri OMV'leri hasat etmek.
- OMV'leri izole etmek için bakteri kültürlerinin santrifüjlenmesi.
- OMV'ler içindeki enzim aktivitesinin karakterizasyonu.
- Organofosfat bileşiklerinin hücre içi katalizinde OMV'lerin uygulanması.
Ana Sonuçlar
- OMV'ler, geleneksel izolasyon tekniklerine kıyasla enzim stabilitesini önemli ölçüde artırır.
- Enzim aktivitesi, çeşitli reaksiyon ve depolama koşulları altında korunur.
- Protokol, E. coli'den OMV'lerin verimli bir şekilde saflaştırılmasına olanak tanır.
- Terapi ve çevresel iyileştirme gibi potansiyel uygulamalar vurgulanmaktadır.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, stabil enzimle dolu OMV'ler üretmek için güvenilir bir yöntem sağlar.
- OMV'ler, çeşitli biyokimyasal uygulamalarda etkili katalitik reaktifler olarak hizmet edebilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu tekniğin kullanımını diğer mikrobiyal sistemlere genişletebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Directed protein packaging into outer membrane vesicles (OMVs) enables stable enzyme delivery for cell-free catalytic systems, addressing instability challenges in recombinant protein production. This approach supports biopharma R&D by improving enzyme shelf-life and activity under variable conditions, reducing attrition in early-stage enzyme therapeutic and diagnostic development. The method provides a scalable, bacteria-derived nanoparticle platform for targeted payload delivery with applications in therapeutic enzyme replacement, bioremediation, and diagnostic reagent stabilization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of recombinant enzymes by maintaining activity through OMV encapsulation, reducing false negatives in target screening.
- Operational Value: Supports high-throughput assessment of enzyme variants by standardizing stability readouts across constructs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable enzyme presentation format for consistent kinetic measurements in cell-free assays, improving assay reproducibility.
- Operational Value: Facilitates assay standardization by minimizing activity drift during screening campaigns, reducing need for frequent reagent re-preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables evaluation of enzyme therapeutics in physiologically relevant conditions by protecting cargo from proteolytic degradation.
- Operational Value: Supports formulation development for enzyme-based therapeutics by demonstrating enhanced stability under storage and transport stresses.
Pipeline & Workflow Integration
The OMV packaging method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling stable enzyme production for downstream screening and preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Confirms target engagement and pathway modulation by preserving enzyme function during in vitro characterization.
- Screening: Delivers quantitative, stable enzyme outputs for dose-response analysis, improving hit-to-lead transition confidence.
- Analytics: Generates reliable activity data via paraoxon hydrolysis assays, enabling comparative assessment of enzyme variants.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by demonstrating enzyme stability in simulated biological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for encapsulating diverse enzymes, reducing redevelopment effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in enzyme functionality by mitigating activity loss during assay execution.
- Operational Value: Improves reagent consistency and scalability through standardized OMV isolation and quantification protocols.
- Strategic Value: Reduces biological risk in enzyme therapeutic development by validating target modulation capacity early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of enzyme candidates based on demonstrated stability and catalytic efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein expression, and bacterial culture techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation and nanoparticle tracking instrumentation for OMV isolation and characterization.
- Necessitates standardization of induction conditions (e.g., arabinose/IPTG) across teams to ensure reproducible vesiculation and packaging efficiency.
- Involves adaptation considerations for different enzyme sizes, solubilities, and anchoring strategies when extending to non-PTE cargos.
- Includes practical limitations such as variable OMV yield and potential aggregation during storage, requiring empirical optimization per enzyme target.
