Name: Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme Escherichia coli: Tasarım, Üretim ve Arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Öğrenin, dış zar veziküllerinde (OMV) enzim paketleme ve arıtma yöntemini. Escherichia coli kullanarak enzim stabilitesini artırın ve hücre dışı kataliz uygulamaları için etkili reaktifler üretin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Deniz Araştırma Laboratuvarı'na sağlanan Temel fonlar aracılığıyla Deniz Araştırmaları Ofisi tarafından finanse edilmiştir.

Plazmidler hazırlanması 1. <ol><li> Bir (çapa-ST olarak bu protokolde anılacaktır) çiftdikgen bağlantı etki kaynaşmış plazmid (örneğin, pET22) çapa protein içeren (OmpA), epitop etiketi (örneğin saflaştırma ve tanımlama için 6xHis, myc veya BAYRAK etiketleri gibi) hazırlayın periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve seçilen bakteri suşunun 7 göre çoğaltma uygun kökeni. <ol><li> Üreticinin protokolü takip edilerek, bir ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin. </li></ol></li><li> Bir plasmid (ör pACYC184) (enzim-SC olarak protokolde adlandırılır) (PTE) bağlantı proteininin tamamlayıcı bioorthogonal bağlantı alanına birleştirilen OMV içinde paketlenmiş enzim / protein ihtiva eden hazırlama, epitop etiketi bağlantı proteini plazmid farklıdır periplazmik lokalizasyon etiketi, antibiyotik direnci ve uygun origçoğaltma seçilen bakteri suşu 7 dayalı. <ol><li> Üreticinin protokolü 7 izlenerek ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak bir gece boyunca kültürden plazmid DNA ekstrakte edin. </li></ol></li></ol> Bir OMV Ambalaj E.coli Kültür 2. Nesil <ol><li> Plazmid izolasyonu <ol><li> Enzim-SC oluşturmak ve bağlantı ST üreticinin protokolü 7&#39;deki gibi ticari bir plazmid izolasyon kiti kullanılarak ayrı bakım hücre çizgilerinden oluşturur kodlayan plazmidler saflaştınlır. 260 nm ve 280 nm &#39;de absorbans ölçülerek DNA konsantrasyonu ve saflık belirler. </li></ol></li><li> Ko-transformasyon <ol><li> Protein ifadesi kolaylaştırılmış ticari olarak temin edilebilen bir E. coli suşu seçin. Not: BL21 (DE3) hücreleri burada kullanılmıştır. T7 lizojenin prot için T7 destekleyici ve T7 RNA polimeraz dayanır çapa ST yapının ekspresyonu için gerekli olanein ifadesi. Diğer bakteri suşlarının kullanımı T7 lizojenin geninin varlığını ya pET22 7 dışında bir plazmidin kullanılması istenmektedir. </li><li> daha sonra seçilen hücreler için imalatçının protokolü izlenerek ısı şoku transformasyonu ya da elektroporasyon ya ile kompetan bakteriyel hücreler içine transforme eş molar konsantrasyonlara saflaştırılmış plazmid DNA ile seyreltilir. </li><li> , Üzerine antibiyotik içeren iki ampisilin (pET22) ve kloramfenikol (pACYC184) ile agar plakaları Luria-Bertani (LB) Levha dönüştürülmüş hücreler her ikisi de 25 ug / ml nihai konsantrasyonlarda mevcut. </li><li> Her iki plazmit ihtiva eden tek klonları izole etmek için gece boyunca 37 ° C &#39;de kültür tabağına yerleştirin. NOT: Antibiyotik seçimi hayatta koloniler gelecekteki tüm OMV hazırlıkları için kullanılacaktır. Antibiyotikler (ampisilin ve kloramfenikol) selektif basıncı korumak ve her iki plazmidlerin varlığını sağlamak için tüm sıvı kültürlere ilave edilecektir. </li></ol></li></ol> 3. OMV Üretimi <ol><li> koloni Genişleme <ol><li> 2.2.4 anlatılan seçme plakaları tek bir koloni ile yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda antibiyotik içeren bir kültür ortamı (tipik olarak Terrific Broth (TB) ve LB) (aşama 2.2.3) 5 ml inoküle. </li><li> şaşkın kültürü şişeler içine bir gecede starter kültür 100 kat seyreltme: 1 gerçekleştirin. NOT: 250-500 ml arasında medya hacmi kullanın. </li><li> kültür yeterli havalandırma elde sağlamak için 250 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de kültür muhafaza edin. </li></ol></li><li> Her plazma indüksiyonu <ol><li> Bakteri kültürü birincil büyüme balonun aşılamadan sonra, bir OD 0.6-0.8 arasında 600 büyüme yaklaşık 3 saat büyümeye olanak sağlar. </li><li> PTE-SC yüklü veziküllerin son verimini artırmak için, 15 dakika boyunca 7.000 xg&#39;de tüm kültür santrifüj. önceden ısıtılmış taze kültür ortamı hücre pelletini. NOT: Bu optuğratarak aşama PTE-SC indüksiyonu öncesinde kültür ortamı içinde mevcut olan herhangi bir boş OMV giderilmesine yardımcı olur. </li><li> 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre L-arabinoz% 20 stok solüsyonu olun. 2-4 hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklayın, L-arabinoz çözeltisi. </li><li> PTE-SC üretiminin başlatılması için bir son% 0.2 konsantrasyonuna kültür şişesine, L-arabinoz solüsyonu ekleyin. NOT: Bu önceki mutant OmpA-ST indüksiyon yoluyla artan vezikülasyon teşvik PTE-SC ile periplazmik boşluk önceden yüklemek için yardımcı olur. </li><li> 0.22 um filtre kullanılarak su ve steril filtre içinde 1 M izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) çözeltisi olun. Not: IPTG kez hemen kullanılmıştır hidrate olması gerekir. IPTG alikotları 3-6 ay donmuş olarak saklanabilir ve kullanımdan önce, hemen çözülmüş olabilir. </li><li> OmpA-ST üretimini başlatmak için 0.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar ilave 3 saat inkübasyon döneminden sonra IPTG ekleyin. </li><li> cul izinçalkalayarak 37 ° C &#39;de ilave bir 8-14 saat boyunca büyümeye Ture. </li></ol></li></ol> 4. OMV Arıtma <ol><li> Bozulmamış Bakterilerin uzaklaştırılması <ol><li> sağlam bakteri pelet 4 ° C&#39;de 7,000 x g&#39;de 15 dakika süre ile bakteriyel kültür ortamı santrifüjleyin. </li><li> Hücre pelet rahatsız değil Durusu ve dikkatli olmak hücre topağı sonrası santrifüj üst kapalı, medya kaydedin. </li><li> bir ek santrifüj döngüsü tüm bozulmamış bakteri süzün ve medyayı kaydetmek için emin olmak kültür ortamından kaldırılır sağlamak için tekrarlayın 4.1.1 ve 4.1.2 adımları. </li></ol></li><li> Protein Agregaların çıkarılması <ol><li> Bundan başka kalıntı bakteri ve kötü büyük hücre malzemenin çıkarılması için 0.45 um zar filtre kullanılarak bakteriyel kültür ortamı saflaştırılması. Not: (örneğin, selüloz asetat (CA) veya poliviniliden diflorür daha yüksek geri kazanımlar ve düşük protein adsorpsiyonu için biyolojik açıdan uyumlu bir membran malzemesi kullanmaPVDF). 100 ml ve 100 ml daha fazla vakum filtre hacimleri daha az şırınga filtresi birimleri. <ol><li> şırınga filtresi için steril 10-50 ml şırınganın içine kültür ortamı çizin. şırınga Luer sonuna kadar 0.45 mikron filtre takın. pistonu basınız ve akış yoluyla yeni bir kap içinde toplamak. </li><li> Filtreyi vakum steril filtrasyon aparatına kültür ortamı aktarmak için. Pompayı vakum veya emme oluşturmak için aspiratör batmaya birimi takın. Yeni geminin filtrelenmiş orta aktarın. </li></ol></li></ol></li><li> Ultrasantrifügasyon üzerinden OMV İzolasyonu <ol><li> santrifüj karşıt tüpleri dengelemek için dikkatli olmak santrifüj tüplerine süzülmüş kültür ortamı ekleyin. </li><li> alet ve tüpler her iki eşleştirme mukabil rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjdeki 4 ° C sıcaklıkta 3 saat ~ 150.000 x g&#39;de topak kullanılmaktadır. </li><li> hemen tamamlama o da OMV pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, OMV pelet OMV tükenmiş kültür ortamı DurusuOMV kurtarma azaltarak pelet yumuşatır medyada kalmasını OMV pelet izin olarak f santrifüj. NOT: Bu pelet hafif kahverengi bakteri kültürü başlangıç ​​miktarına bağlı olarak ya da gözü tarafından görülemeyen olabilir olacaktır. santrifüj tüpünün üst doğrudan medya aspire da OMV kaldırıldı fazla medya son OMV örnek olacak daha saf pelet akılda tutmak bir seçenektir. </li><li> OMV parçacıklar tamamen medyadan tükenmiş olduğunu doğrulamak için, daha sonra dinamik ışık saçılımı (DLS) test için santrifüj süpernatant kaydedin. </li><li> Ekle, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübasyona izin OMV topak, pH 8.0, steril filtre edildi fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.4 ve 100 mM N-sikloheksil-2-aminoetansülfonik asit (CHES), tampon 0.5-1 mi. pelet kuru değil emin olun. NOT: Çözelti iyonik kuvvet, pH ve sıcaklığın aşırı düşük OMV çözünürlük neden olabilir ve Birikmesi arttırabilirNavigasyon. </li><li> Dikkatle çözünür hale olmuştur tüm pelet sağlamak için hafifçe karıştırarak, santrifüj tüpüne saflaştırılmış OMV çözümünü pipetlemeyin. </li></ol></li></ol> 5. OMV Karakterizasyonu <ol><li> OMV boyut dağılımı ve parçacık konsantrasyonunu belirlemek için her enstrümanın özgü sağlanan üreticinin protokolleri takip piyasada mevcut DLS veya nanopartikül izleme yazılımı kullanın. NOT: Burada, OMV boyut dağılımı ve konsantrasyon NanoSight LM10 Nanopartikül İzleme ve NTA 2.3 Analiz yazılımı kullanılarak tespit edildi. <ol><li> yazılımını açın. </li><li> mikroskop açın ve mikroskop ve nanoparçacık izleme ünitesi üzerindeki tüm yüzeyleri temizleyin. </li><li> ~ Bir hava enjekte olmadan tüm görüntüleme penceresi kapak emin olarak 1 ml steril bir şırınga ile montaj Luer aracılığıyla parçacık izleme cihazının bakma penceresi ile doğrudan OMV numune 0.5 mi sisteme kabarcıklar ekleyin. </li><li> Yeri to mikroskop sahnede birimi, izleme ve lazeri açın nanoparçacık. </li><li> Yazılımda &quot;yakalama&quot; tıklayın. </li><li> mikroskop odağı ayarlayın ve yazılım penceresindeki önizleme ekranı şimdiki parçacıkları görselleştirmek için sahne. </li><li> parlak parçacıklar açıkça karanlık bir arka plan görsel kadar &quot;Kamera Shutter&quot; ve &quot;Kamera Gain&quot; ayarlayın. </li><li> 60 sn yakalama süresini ayarlayın. </li><li> &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li><li> , Giriş numune / cihaz sıcaklığı istendiğinde, örnek etiket ve bir kullanıcı belirlenen klasöre çalıştırmak her tamamlanmasından video verileri kaydetmek. </li><li> (Algılama Eşiği, Blur, Min Parça Uzunluğu Min Beklenen Partikül Boyutu) oto modunu algılamak ve tıklayın tüm analiz parametrelerini tutmak &quot;Süreç Sırası.&quot; NOT: Her bir parametre ince ayar analiz sonuçlarına bağımsız olarak ayarlanabilir nasıl kılavuzuna başvurun. </li><li> Telaffuz parçacık boyutu dağılımı ve parçacık / myazılım tarafından tespit edildiği üzere l konsantrasyonu. Not: Tipik bir OMV hidrodinamik boyutu aralığı ~ 10 x 10 8 bir parçacık / ml konsantrasyonu ile 30-200 nm arasındadır. </li></ol></li><li> OMV Protein İçeriği belirlenmesi <ol><li> OMV saflık, enzim üretimi, ve SK-ST çapraz bağlama verimliliği 7 değerlendirmek için standart SDS-PAGE ve Batı benek protokolleri kullanarak. Not: çapraz bağlama verimliliği% 100 7 olmayacaktır. </li></ol></li></ol> Enzim Ambalaj 6. Doğrulama <ol><li> PTE Aktivite Deneyi <ol><li> ya da bir küvet içinde, 25 ° C&#39;de, uygun bir tampon maddesi, örneğin 100 mM CHES tamponu (pH 8) &#39;de, tüm enzimatik testleri gerçekleştirmek veya 96/384 oyuklu bir plaka içerisinde multiplekslenmektedir. </li><li> 1 5 ul ekleyin: Ches 90 ul ve saflaştırılmış OMV 5 ul CHES tamponunda paraoksonun 1000 seyreltme (~ 36 kat kültür ortamında bulunan OMV konsantrasyonuna göre konsantre). Dikkat: Paraokson bir toksik pestisit olduğunuve üretici ve kurumsal kurallarımıza göre ele alınması gerekir. </li><li> 405 nm&#39;de düzenli aralıklarla absorbans okumaları (~ 2 saat, toplam reaksiyon süresi boyunca her 20 sn) alın (ε = 18.1 mM -1 cm-1) ve 348 nm (isosbestic nokta s = 5.4 mM -1 cm-1) en kromojenik paraokson arıza ürün, p-nitrofenolu reaksiyon ilerlemesini izlemek. Not: pH değeri 8 den P-nitrofenolu baskın protonu giderilmiş formu 405 nm&#39;de doğru izlenmesi için izin mevcuttur. Tüm diğer karmaşık ya da daha düşük pH değerli solüsyonlarda p-nitrofenolu birden formları, mevcut olacak şekilde 348 nm isosbestic noktasını kullanmak gerekmektedir. </li><li> Her bir örnek, paket verimliliği, toplam PTE üretiminde PTE nispi miktarı karşılaştırma aşamasında 6.1.3 İlerleme eğrileri doğrusal kısmının eğimi belirleyerek başlangıç ​​reaksiyon hızları hesaplanır. </li><li> Standart enzimatik gerçekleştirinTahlil protokolleri K M, V max belirlemek ve OMV k kedi PTE kapsüllü. NOT: Lineweaver-Burk analizi bu kinetik parametrelerin belirlenmesi için kullanılabilir nerede y kesişim = 1 / V maks ve eğim = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembran Yüzey / Ürün Difüzyon. <ol><li> hacimce Aşama 0-3 ile% CHES tamponu, Triton X-100&#39;ün artan konsantrasyonları kullanılarak 6.1 de tarif edildiği gibi aynı kinetik deney analizi yapın. Not: çözündürülmüş OMV fonksiyonlarına Triton X-100 eklenmesi OMV içeriği, reaksiyon çözeltisine serbestçe erişilebilir olduğu için izin lipid çift bozabilir. </li><li> Hesaplamak ve aktivitesi enzim göre enzim aktivitesinde çok az bir değişiklik (başlangıç ​​hızı) ile gösterilen alt-tabaka / ürün transmembran geçişini kontrol etmek için her bir Triton X-100 seviyesinde İlk hızlar, karşılaştırmaN Triton X-100 bulunmaması. enzim aktivitesinde bir artış, Triton X-100&#39;ün varlığında görülürse alt-tabaka serbest OMV nüfuz etmez olasıdır. </li><li> enzim aktivitesi doğrulamak için Triton X-100&#39;ün varlığında deneyi serbest enzim aktivitesi (Bölüm 6.1&#39;de yukarıda anlatıldığı gibi) yüzey aktif maddeler ile inhibe değildir. NOT: aktivitesi büyük ölçüde Triton X-100 gibi saponinler veya çeşitli polisorbat gibi alternatif katkı etkilenirse / ara yüzey aktif OMV membran rüptürü için daha uygun olabilir. </li></ol></li></ol> 7. OMV Depolama <ol><li> Dondurucu <ol><li> doğrudan sıvı azot içine saflaştırılmış OMV Yeri ~ 100 ul alikotları ek emin tam şişeleri batığın veya numune kendisi ile herhangi bir sıvı azot temas olmaması alikotları dondurma. NOT: Arıtılmış OMV tampon doğrudan donduruldu olabilir purificat sırasında OMV pelet çözülmesi için seçildi7 Gerekirse ek dondurarak saklama koruyucuları ile iyon süreci. </li><li> -80 ° C&#39;de ek dondurulmuş alikotları saklayın. </li><li> RT emin örnekleri ısıtmak için değil varlık onları yerleştirerek adım 7.1.1 dondurulmuş alikotları çözülme. </li><li> Bu şekilde depolama için tüm örnekler hazırlamak önce aşamasından önce başlangıç ​​hızları karşılaştırarak 6.1 ve enzim aktivitesi sonrası dondurularak çözülme önemli bir kayıp olmadığını doğrulamak için dondurulduktan sonra tarif edilen enzim tahlili gerçekleştirmek. Not: enzim aktivitesinde bir azalma dondurma nedeniyle gözlenmesi halinde saklayın 4 ° C&#39;de OMV arıtıldı. </li></ol></li><li> liyofilizasyon <ol><li> Piyasada mevcut liyofilizasyon donanımları 21 kullanılarak anında dondurulmuş saflaştırılmış OMV alikotları liyofilize. </li><li> Mağaza hafta veya aylarca, -80 ° C&#39;de, oda sıcaklığında alikotları liyofilize edildi. </li><li> Liyofılizasyon öncesinde şekilde liyofilize OMV saf suyun aynı hacimde ekleyin ve t rehidrate, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilmiştirO örnek. Gerekli emin olunca girdap ya da OMV ses dalgalarına maruz değil hafifçe karıştırın. </li><li> önce seyreltme / çözündürme gerekli olmadığı yerlerde işaret-bakım uygulamaları için doğrudan liyofilize OMV tozu ekleyin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li>
<li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li>
<li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li>
<li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li>
<li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein%2C+through+engineering+a+bacterial+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li>
<li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li>
<li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li>
<li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biochim.+Biophys.+Acta%2C+Proteins+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li>
<li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+organo-phosphate+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Toxicol.+Adverse+Drug+Exper%22%5BJournal%5D)">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li>
<li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX%3A+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li>
<li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-negative+bacteria%3A+the+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Outer+Membrane+Vesicles+of+Bacteria.+SpringerBriefs+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li>
<li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li>
<li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soluble%2C+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li>
<li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li>
<li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li>
<li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+%28LEP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li>
<li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li>
<li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast%2C+efficient%2C+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+BioSyst%22%5BJournal%5D)">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li>
<li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils%3A+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li>
<li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866(2016).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme%2Fprotein+packaged+bacterial+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Delivery%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Temsilcisi göstermek için bu protokol işlevleri, ilgili bir enzim üretimi ve E. coli OMV içine paketlenmiş olan bir paketleme tekniği yöneliktir. birçok karmaşık tekniklerle de protokol aşağıda ayrıntılı olarak bazıları, farklı özel uygulamalarda, kullanım için uyum için değiştirilebilir olan birden çok alan vardır. OMV paketleme ve enzim kapsülleme mekanizması özel ihtiyaçlarına göre adapte edilebilir olsa da başarısı için kritik olan bu protokol kapsamında birkaç adım vardır. sağlam bir bakteri ve hücresel en...

Enzim yüklü bakteriyel dış membran veziküllerinin (OMV) tasarımı, üretim ve saflaştırma için bir yöntem olup burada sunulmuştur. OMV, 30-200 nm 1,2 büyüklükleri değişen proteoliposomes öncelikle tek katmanlı, küçük. Bugüne kadar incelenen tüm gram-negatif ve Gram-pozitif bakteriler, yüzey 3,4 OMV veya hücre dışı vesiküller (EV), ya serbest göstermiştir. OMV üretildiği kesin mekanizma henüz tam olarak nedeni onları yanı sıra hizmet ettikleri farklı işlevleri salgılayan çeşitli bakteri nüfusa açıklanacaktır zorunda. OMV kompleksi arası iletimde, gen translokasyon çeşitli hizmet genetik malzemenin küçük moleküller, peptitler ve proteinler yükün geniş taşıma gösterilmiştir ve hastalık oluşturma 5,6 çalışır. OMV biogenez kesin mekanizmaları iyi karakterize ve bakteriyel türler arasında farklılık göstermedi değildir. thi rağmens aslında, ilgi bir protein ve bakteriyel dış zar için son derece fazla protein endojen ve daha sonra OMV ile sentetik bir bağ oluşturarak OMV bir rekombinant proteinin ambalaj etkinliğinin arttırılması için bir yöntem geliştirdik. Sentetik bağlantı ya da yapay olarak dahil afinitesi yokluğunda, rekombinant şekilde sentezlenmiş protein ile OMV arasında gözlenen paketleme verimliliği 7 çok düşüktür. Bu sonuç, iyi anlaşılmış değildir mekanizmalar yoluyla bakteriyel yüzeye ya da yönlendirilmiş paketleme ile OMV formasyonunun kesin bir anda rastgele olasılık kapsülleme yoluyla gerçekleşir OMV içindeki proteinler dahil edilmesi gibi beklenebilir. inci kıyasla yüksek verimde ambalaj bazı proteinleri ile bağlı protein yüksek bir başarı rastgele olasılık kapsülleme ama etkili paket dayanır periplazmik boşluk içinde ekspresyonu üzerinde, sadece yoluyla proteinlerin paketleme gözlenmiştir olduğutüm 8-10&#39;da paket yok. Ortak sentetik biyoloji tekniklerini kullanarak biz Escherichia coli (E.coli) aynı anda üretmek, paket ve kargo için bakteriler tarafından seçilir nasıl OMV oluşturulur ve nasıl ilgili güncel bilgi sınırlamaları ortadan OMV içine ilgi aktif bir enzim salgılaması için mühendis çalıştı ambalaj. tercih edilen, sentetik bağlantı OMV içine yönsel ve paketlemeyi kolaylaştırmak için, bu başvurunun amaçları için, bir bölme proteini bioconjugation sistemi seçildi. Adından da anlaşılacağı gibi bölünmüş bir protein bioconjugation sistemi birbirleriyle etkileşim iki tamamlayıcı alt birim etki oluşur. Bu protokolün amacıyla seçilen bölünmüş protein domainleri Streptococcus pyogenes fibronektin bağlama proteini (FbaB) 11 elde edilir SpyCatcher (SC) SpyTag (ST) etki gibi ifade edilir. Bu bölme, protein sisteminin bu w sıradışıTavuk, iki alt birimi yakınlık içinde isopeptide bağ spontan bir kovalent bağ oluşturma asit ve lizin amino asit kalıntıları, aspartik proksimal arasında oluşturur. Isopeptide bağı oluşumu şaperon protein, katalitik enzimlerin veya kofaktörlerin eklenmesini gerektirmez ve kolayca, oda sıcaklığında (RT) ve fizyolojik olarak ilgili koşullar, 12, geniş bir aralıkta meydana gelebilir. Kavramının bir kanıtı olarak, Brevundimonas diminuta gelen phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) OMV 13 türetilmiş E. coli &#39;içine paketlenmiş seçildi. PTE binükleer Zn / Zn etkin bir yeri içerir ve Dialkilfosfatlar ve aril alkolleri 14&#39;e aryldialkylphosphates dönüştürme bir hidroliz reaksiyonu ile organofosfatlar ayrıştırma kabiliyeti yer alır. Organofosfatlar maruz kalma nöromüsküler kavşak makin de asetilkolinesteraz tarafından asetilkolin hidrolizini inhibe yoluyla uygun nörotransmitter fonksiyonu bozar15 derece tehlikeli g organofosfat türetilmiş bileşikler. Uzun süreli veya Organofosfatlar önemli maruziyet sık kontrol edilemeyen kasılmalar oluşur ve genellikle boğulma yoluyla ölüme neden olur. PTE paraokson doğru yüksek bir katalitik aktivite sergiler ise, çok güçlü bir insektisit, aynı zamanda diğer ilaç ve V / G tip kimyasal sinir ajanları 16 geniş bir hidrolize yeteneğine sahiptir. OMV ve paketlemeyi kolaylaştırmak için bir bakteriyel plazmid indüklenebilir bir promotör, bir periplazmik lokalizasyon sekansını ve SK gen dizisinin üst akışında bir kısa çoklu klonlama yerini içeren bir gen yapısı kodlayan tasarlanmıştır. OMV ambalaj periplazmik bölgeye PTE-SC füzyon proteinini hedefleyen genetik anahtarın oluşturulması için izin lideri ve SC sekansı arasındaki PTE geninin yerleştirilmesi. Burada tarif edilen çalışmalar PTE odaklanırken, enzim gen değiştirilebilir ve hali hazırda Fakültesi için diğer bir gen sekansı ile değiştirilebilirAlternatif bir enzim veya protein ilitate ambalaj. Sentetik bağlantı ikinci bir parçası olarak bir çok dış zar proteini (OmpA) Abone terminali peptid dizisi sunmak tercih edilir. değişebilir bağlantı proteininin tercih protein, periplazmik boşluk içinde sunulur permisif alan adına sahip sitotoksisite neden olmadan bir füzyon yapısı tolere esastır iken rekombinant olduğunda, OMV mevcut olduğu bilinmektedir, ve toplam etmez üretilmiş. OmpA yüksek bakteriyel dış zar ve daha sonra OMV 17&#39;de ifade edildiği bilinen bir 37.2 kDa transmembran Porin proteinidir. Küçük moleküllerin taşınması karıştığı, bakteri membranı 18 arasında, boyutu 2 nm &lt;. Ana OmpA iki yapısal benzersiz etki, bir transmembran p varil motif ve peptidoglikan 19 ile etkileşim için bilinen periplasmically çözünebilir bir C-terminal bölümüne sahiptir. Mutant OmpA-ST füzyon designe olarakBuradaki D ompA C-terminal kısmı silinmiştir ve ST periplasmically bakan N- ya da C-ucu ile kaynaştırılır. OMPA periplazmik bölümünü silme dış membran ve hiper-vezikülasyon 7 giden membran istikrarsızlaştırma sonuçlanan peptidoglikan arasındaki etkileşimlerin sayısını azaltır. Genomik OmpA Brüt membran destabilizasyonuna azaltmak için, rekombinant şekilde eksprese OmpA-ST yapısına ek olarak muhafaza edildi.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Herhangi Bir Daima</td><td></td><td>taze veya alikot hazırlayın ve dondurun.</td></tr><tr><td>L-arabinoz</td><td>Herhangi biri</td><td></td><td>önceden hazırlanabilir ve 4 ° C'de saklanabilir.</td></tr><tr><td>Ampisilin:</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>Ekleme, ortam otoklavlanmaktan yeterince soğuduktan sonra kullanımdan hemen sonra. &nbsp;</td></tr><tr><td>Kloramfenikol&nbsp;</td><td>Herhangi bir</td><td></td><td>Ekleme, ortam otoklavlanmaktan yeterince soğuduktan sonra kullanımdan hemen önce. &nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Kültür Ortamı</td>: <td>Diğer herhangi bir</td><td></td><td>büyüme ortamı muhtemelen benzer şekilde çalışacaktır.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td> Birçok potansiyel uygun yüzey aktif maddeden <td>herhangi biri</td><td></td><td>. &nbsp;</td></tr><tr><td>Şaşkın kültür şişeleri</td><td>Herhangi Bir</td><td></td><td>Bölmeler daha yüksek havalandırma seviyelerini teşvik eder.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Paraokson bozunması için kullanılan optimal tampon (pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Dikkatli kullanılması ve uygun şekilde atılması gereken çok toksik bir maddedir. &nbsp;</td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi 0.45 ve mikro; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td> <td>Filtre çapı numunenin hacmine bağlı olacaktır. Düşük protein bağlayıcı membran kritiktir.</td></tr><tr><td>Çalkalayıcı inkübatör</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Tekrarlanabilir bakteri üremesi için hassas sıcaklık ve karıştırma şarttır.</td></tr><tr><td>Sorvall Kültür Santrifüjü</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>7.000 x g kapasiteli büyük hacimli (500 ml) kültür santrifüjü.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultrasantrifüj&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Merkezkaç kuvveti ve ge yeteneğine sahip; 150.000 x g.</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Uygun rotor ve tüplerin kullanıldığından ve her şeyin uygun şekilde dengelendiğinden emin olun.</td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Ultrasantrifüj Tüpleri (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Kullanmadan önce herhangi bir stres kırığı olmadığından ve tüplerin önceden dengelendiğinden emin olun.</td></tr><tr><td>Spektrofotometre&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Enzim kinetik deneyleri için gereklidir.</td></tr><tr><td>DLS/parçacık izleme</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>OMV boyut dağılımı ve konsantrasyon tayini için gereklidir. &nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 (DE3)</td> <td>NEB</td><td></td><td>Uygun bakteri ekspresyon suşu.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Bunların yerine başka plazmitler de kullanılabilir. &nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Bunların yerine başka plazmitler de kullanılabilir. &nbsp;</td></tr><tr><td>Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Örnek kit.</td></tr></tbody></table>

outer zar vezikülleri içinde yönetmen protein paketleme<em&gt; escherichia coli</em&gt;: tasarım, Üretim ve arıtma

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

dış membran veziküller (OMV) programlamak için sentetik biyoloji teknikleri uygulayarak giderek artan ilgi, geleneksel nanopartiküller sentezlemek için çok zor kanıtlamaktadır OMV&#39;ye için bazı çok ilginç ve benzersiz uygulamalara yol açmaktadır. Bugüne kadar, bütün Gram negatif bakterilerin küçük moleküller, peptitler, proteinler ve genetik malzemesi içeren kargo çeşitli OMV Gösteren ambalaj üretmek için gösterilmiştir. onların çeşitli yük göre OMV hücre-hücre iletişim gen transferi ve bakteri OMV üretiminde hangi bağlı olarak hastalık oluşturma faktörlerinin teslimat kadar birçok biyolojik süreçlere de karışırlar. Sadece son zamanlarda bakteriyel OMV kontrol etmek ve OMV içine rekombinant proteinlerin doğrudan ambalaj tekniklerinin geliştirilmesi yoluyla geniş bir uygulama yelpazesinde kullanım için erişilebilir hale gelmiştir. overa geliştirilmiş Bu protokol, üretimi, saflaştırılması için bir yöntem, ve enzim paketlenmiş OMV kullanımını temin tarifrekombinant enzim, artan vezikülasyon ve gelişmiş enzim stabilitesi ll üretimi. Bu protokolün başarılı kullanımı aynı zamanda, bir rekombinant protein üretimi ve yeniden birleştirici protein ve bir dış membran ankraj protein arasında sentetik bağlantı oluşturma yoluyla OMV kapsüllenmesi için yönlendiren bir bakteri suşunun oluşturulmasıyla sonuçlanır. ilaç ilaç dağıtım, tıbbi teşhis ve çevresel iyileştirme: Bu protokol ayrıca gibi diğer benzersiz uygulamalar için kullanılmak üzere bu protokolü adapte göz önünde bulundurulması gereken bakteri kültürlerinin yanı sıra uygun işleme teknikleri ve şeyler OMV izole etmek için yöntemler göstermektedir.

Bu protokol ayrıntılı OMV ambalaj stratejisi için gerekli olduğu gibi, iki yeniden birleştirici proteinin aynı anda sentezlenmesi, farklı yollar bir numara ile gerçekleştirilebilir. Burada, bir iki vektör sistemi çoğaltma ve ayrı olarak uyarılabilir gen kasetlerinin uyumlu kökeni ile kullanılmıştır. PTE-SC sentezlenmesi için bir arabinoz, indüklenebilir gen kaseti ve bir enzim geninin klonlanmasını kolaylaştırmak için benzersiz sınırlama sitelerinin bir dizi ardından periplazmik lokaliza...

Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bu prosedürün genel amacı, in vitro katalitik reaktifler olarak kullanılmak üzere enzimle doldurulmuş bakteriyel dış membran veziküllerini saflaştırmak ve karakterize etmektir. Bu enzim izolasyon tekniği, bakteriyel OMV'lerin kültür ortamlarından hasat edilmesine ve ardından bir organofosfat bileşiğinin hücre dışı katalizini gerçekleştirmek için kullanılmasına olanak tanır. Bakteriyel OMV'ler içindeki yönlendirilmiş paketleme, genellikle enzim aktivitesinin kademeli ve sürekli kaybıyla sonuçlanan geleneksel tekniklerin aksine, çeşitli reaksiyon ve saklama koşulları altında enzim stabilitesini önemli ölçüde artırır.Bu tekniğin etkileri; terapötiklerin geliştirilmesi, iyileştirme veya hücresiz katalitik sistemlerin geliştirilmesi gibi birçok alanla ilgili proteinlerin paketlenmesine kadar uzanmaktadır. Bu protokol E.coli'den OMV'lerin saflaştırılmasını detaylandırdığı halde, paketleme stratejisindeki modifikasyonlarla bu teknikler, çeşitli mikrobiyal hücre kültürlerinden OMV saflaştırması için kolaylıkla kullanılabilir. Metin protokolüne göre bakterilerde dış membran vezikülleri veya OMV'ler oluşturulduktan sonra, bozulmamış bakteriyel kültür ortamını 4 °C'de 15 dakika boyunca 7,000 ×g'de santrifüjleyin.Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatantı uzaklaştırın ve saklayın. Ardından, tüm bakterilerin ortamdan uzaklaştırıldığından emin olmak için süpernatantı ikinci bir santrifüj işlemine tabi tutun. Saklanan kültür ortamındaki protein agregatlarını ve büyük hücresel materyalleri uzaklaştırmak için çözeltiyi steril 10 ila 50 mililitrelik bir şırıngaya çekin.Seringanın ucuna 0,45 mikronluk bir filtre takın. Ardından pistonu bastırarak süzülen sıvıyı yeni bir tüpe toplayın. Alternatif olarak, kültür ortamını steril bir filtrasyon aparatına aktararak vakum filtrasyonu yapın.Vakum oluşturmak için üniteyi bir vakum pompasına veya lavabo aspiratörüne bağlayın. Filtrelenmiş medyumu yeni bir kaba aktarın. OMV'leri izole etmek için filtrelenmiş kültür medyumunu ultrasantrifüj tüplerine aktarın.Kullanılan tüplere uygun bir rotor kullanarak, ortamı yaklaşık 150,000 ×g'de ve dört °C'de üç saat boyunca santrifüjleyin. Pelet kütlesi kaybını önlemek için, ultrasantrifüj işleminin hemen ardından, gözle görülüp görülmeyebilen hafif kahverengi OMV peletinden OMV'den arındırılmış kültür ortamını dökün. Ultrasantrifüj sonrası oluşan OMV peleti, santrifüj tüpüne sadece gevşek bir şekilde tutunmuş olabilir.Pelletin yerinden oynamadığından ve kaybolmadığından emin olmak için dekantasyon sırasında dikkatli olunmalıdır. OMV partiküllerinin ortamdan tamamen uzaklaştırıldığını doğrulamak amacıyla, daha sonra dinamik ışık saçılımı analizi için süpernatantı saklayın. Pellete, deneysel ihtiyaçlar veya koşullar tarafından belirlenen 0,5 ila bir mililitre steril filtrelenmiş PBS (pH 7,4) veya başka bir filtrelenmiş tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edilmesine izin verin.Ardından, pelletin tamamen çözündüğünden emin olmak için nazikçe karıştırarak saflaştırılmış OMV çözeltisini dikkatlice pipetleyin. OMV boyut dağılımını belirlemek için, kullanılan cihaza ait DLS nano-parçacık takip yazılımını açın. Mikroskobu açın ve mikroskop ile nano-parçacık takip ünitesindeki tüm yüzeyleri temizleyin.Bir mililitrelik steril bir şırınga kullanarak, sisteme herhangi bir hava kabarcığı enjekte etmemeye dikkat ederek, yaklaşık 0.5 mililitre OMV örneğini alt bağlantı üzerinden doğrudan partikül izleme cihazının izleme penceresine ekleyin ve izleme penceresinin tamamını kapladığından emin olun. Nano-partikül izleme ünitesini mikroskop tablasına yerleştirin ve lazeri açın. Ardından yazılımdaki Capture butonuna tıklayın.Yazılım penceresindeki önizleme ekranında partikülleri görüntülemek için mikroskop odağını ve tablasını ayarlayın. Karanlık bir arka plan üzerinde parlak partiküller net bir şekilde görülene kadar kamera perdesini ve kamera kazancını ayarlayın. Yakalama süresini 60 saniyeye ayarlayın, ardından Kaydet'e tıklayın.İstendiğinde örnek cihaz sıcaklığını girin, örneği etiketleyin ve her çalıştırma tamamlandığında video verilerini kullanıcı tarafından belirlenen bir klasöre kaydedin. Tüm analiz parametrelerini otomatik algılama modunda tutun ve Process Sequence'e tıklayın. Yazılım tarafından belirlenen partikül boyut dağılımını ve konsantrasyonu mililitre başına partikül cinsinden kaydedin.OMV protein içeriğini belirlemek için, OMV saflığını, enzim üretimini ve SpyCatcher veya SC ile SpyTag veya ST arasındaki çapraz bağlama verimliliğini değerlendirmek amacıyla SDS-PAGE ve Western Blot yöntemlerini kullanın. Hedef enzimlerin ve çıpa proteininin ekspresyonunu doğrulamak zorunludur. Rekombinant proteinlerin ekspresyonu çeşitli nedenlerle sıklıkla başarısız olabilir; bu nedenle, OMV karakterizasyonundan önce başarılı protein üretimi doğrulanmalıdır.Bir fosfotriesteraz veya PTE aktivite testi gerçekleştirmek için, CHES tamponuyla 1:1.000 oranında seyreltilmiş paraokson'dan beş mikrolitreyi, 90 mikrolitre CHES içindeki beş mikrolitre saflaştırılmış OMV'ye ekleyin. Kromojenik paraokson yıkım ürünü olan p-nitrofenolün ilerlemesini izlemek için yaklaşık iki saatlik toplam reaksiyon süresi boyunca her 20 saniyede bir 405 nanometre ve 348 nanometre dalga boylarında absorbans değerlerini ölçün. Son olarak, veri analizini metin protokolüne göre gerçekleştirin.Burada, SEM aracılığıyla E.coli'den saflaştırılmış OMV'lerin morfoloji örnekleri gösterilmiştir. OMV'lerin boyutları, parçacık takip cihazı kullanılarak belirlendiği üzere 50 ila 250 nanometre arasında değişmektedir. Bu grafikte, mutlak OMV konsantrasyonu gösterilmiştir.N terminal OMP-A-ST, arabinoz ve IPTG varlığında PTE-SC ile birlikte ko-transforme edildiğinde, kontrol örneklerine kıyasla OMV üretiminde belirgin bir artış gözlemlenmiştir. Burada görülen SDS-PAGE ve Western Blot analizleri; OMP-A-ST, doğal OMP-A, PTE-SC ve OMP-A-ST-PTE-SC için OMV protein içeriğini ve rekombinant protein ekspresyonunu daha ayrıntılı olarak karakterize etmektedir. Bu şekilde; hücre peletleri, UC süpernatantı ve saflaştırılmış UC OMV peletlerindeki genel PTE ekspresyon seviyeleri ile OMV paketleme verimliliği, kromojenik substrat olarak paraokson kullanılarak yapılan başlangıç hızı ölçümleriyle belirlenmiştir.Burada, paraoksonun sağlam OMV çift katmanları boyunca translokasyonunu doğrulamak için Triton X-100 kullanılmıştır. Deterjanla veya deterjansız durumda aktivite farkının az olması, paraoksonun OMV üzerindeki endojen gözeneklerden serbestçe geçtiğini göstermektedir. Son olarak, bu deneyde görüldüğü üzere, PTE-SC kinetik verileri, arabinoz ve IPTG varlığında PTE-SC ile birlikte ko-transforme edilen N terminal OMP-A-ST ve arabinoz aktivasyonu varlığındaki PTE-SC için standart bir Michaelis-Menten enzim kinetiği denklemine uydurulmuştur.Tüm genetik konstrüktlar oluşturulup doğrulandıktan sonra, enzim paketleme ve OMV saflaştırma işlemi iki günlük bir sürede tamamlanabilir. Yeni bir konstrükt geliştirildiğinde, OMV'lerin doğrulanması ve karakterizasyonu için üçüncü bir güne ihtiyaç duyulur. Bu prosedür uygulanırken, tüm malzemelerin ve santrifüj ekipmanlarının güvenlik derecelerinin kontrol edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.Ek olarak, bir sonraki adıma geçmeden önce her adımın başarısını doğrulamak önemlidir. Burada açıklanan karakterizasyon adımları, enzim paketlemesini ve OMV morfolojisini onaylamak için diğerleriyle desteklenebilir. Protein konsantrasyonu, lipid içeriği, LPS konsantrasyonu ve diğer birçok özellik, farklı yüklemlere ve ekleme koşullarına göre değişiklik gösterebilir ve sonraki uygulamaları etkileyebilir.Bu videoyu izledikten sonra, enzim yüklü OMV'lerin nasıl saflaştırılacağı ve karakterize edileceğinin yanı sıra, enzim kargonun aktivitesini değerlendirmek için önsel analizlerin nasıl yürütüleceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olmalısınız. Bakteriler ve kimyasal reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun aseptik teknik ve kişisel koruyucu ekipman gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Kaynak: Figueroa, D.M., et.al. Antimikrobiyal peptit lokalizasyonunu karakterize etmek için bakteriyel sferoplastların ve protoplastların üretimi ve görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, önce filamentasyonu indüklemek için hücre bölünmesini inhibe ederek, ardından hücre duvarının enzimatik sindirimini izleyerek Escherichia coli sferoplastlarının üretimini göstermektedir. İşlem, mikroskobik gözlem için uygun sferoplast oluşumunu ve stabilitesini sağlamak için bir şelatlama maddesi,...

E. coli Sferoplastların Hazırlanması

Kaynak: Streather, B. R., ve diğerleri. E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, Vezikül Çekirdekleştirici Peptit (VNp) ile etiketlenmiş rekombinant proteinlerin bakteriyel veziküllerden üretimini ve izolasyonunu göstermektedir. Bir indükleyici, VNp etiketli protein ekspresyonunu tetikler, vezikül oluşumunu ve kapsüllemeyi yönlendirir, ardından hücre lizizi olmadan verimli protein geri kazanımı için santrifüjleme ve...

Rekombinant Protein Üretimi ve Bakteri Kaynaklı Veziküllerden Geri Kazanım

Çinko-Parmak etki doğal olarak hücre-geçirgen ve memeli hücre türlerinin geniş bir aralığı içine protein verilmesinin aracılık edebilmektedir. Burada, hücre içi protein teslimat için çinko-parmak teknolojisi uygulanması için ayrıntılı bir adım-adım protokolü sunulmuştur.

Hücre geçirgen Cys kullanılarak memeli hücrelerinde doğrudan protein teslim<sub&gt; 2</sub&gt; His<sub&gt; 2</sub&gt; Çinko-parmak Alanlar

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Prolin-prolin endopeptidaz-1 (PPEP-1), insan patojeni Clostridium difficile'den salgılanan bir metalloprotaz ve umut verici ilaç hedefidir. Burada, bu proteinin üretimi ve yapısının belirlenmesi için gerekli tüm yöntemleri açıklıyoruz.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

E. coli'de heterolog ekspresyon ve fransız presi kullanılarak hücrelerin lysis'inde üretilen membran vezikül preparatlarında proton-tahrikli membran taşıyıcılarının karakterizasyonu için bir yöntem tanımladık.

E. coli'de Heterolog Ekspresyon ile Membran Taşıyıcılarının Karakterizasyonu ve Membran Veziküllerinin Üretimi

Bu protokol, RNA ve protein üreten sentetik hücrelerin aşağıdan yukarıya hazırlanması için yöntem, malzeme, ekipman ve adımları açıklamaktadır. Sentetik hücrelerin iç sulu bölmesi bir lipid bilayer içinde kapsüllenmiş S30 bakteriyel lizat içeriyordu (yani, istikrarlı lipozomlar), bir su-in-oil emülsiyon transferi yöntemi kullanarak.

Hücre Serbest Bakteriyel Özler, Lipozomlar ve Emülsiyon Transferi Kullanarak Protein Üreten Sentetik Hücreler Hazırlama

Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.

Elastin benzeri Proteinlerin tanımlanmış Supramoleküler Yapılara Yönlendirilmiş Montajı ve Tüp Bebek Tespülasyonu

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Bu protokol, hücre dışı membrana bağlı veziküller içinde paketlenmiş, tipik olarak çözünmeyen veya disülfür bağı içeren proteinler de dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin bakteriyel üretimi için ayrıntılı bir yöntem açıklamaktadır. Bu, uygulamalı biyoteknoloji ve tıp da dahil olmak üzere çok yönlü bilimsel araştırma alanlarına uygulanma potansiyeline sahiptir.

E. coli'den Rekombinant Protein Dolu Veziküllerin Optimize Edilmiş Üretimi ve Analizi

Öğrenin, dış zar veziküllerinde (OMV) enzim paketleme ve arıtma yöntemini. Escherichia coli kullanarak enzim stabilitesini artırın ve hücre dışı kataliz uygulamaları için etkili reaktifler üretin.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme

Daha fazla video keşfet