Name: Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Öğrenin, lipidik kübik fazda membran protein mikrokristalleri hazırlama ve seri femtosaniye kristalografi için teslim etme yöntemini. Bu teknik, oda sıcaklığında minimal örnek tüketimi ile yapısal biyoloji çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma R01 GM108635 ve U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU İşbirlikçi Tohum Hibe Ödülü ve NSF STC ödülü 1231306. Biz yazının hazırlanmasında yardım için A. Walker teşekkür Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.

1. Filtreleme Çözümleri ve Lipitler Not: LCP enjektörü yapışmasına neden olabilir örneklerinde partikül kirleticilerin, giriş önlemek için mümkün olduğunca bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve araçlar olarak temiz olmalıdır. <ol><li> 5 mikron spin-aşağı filtreler aracılığıyla tüm Yağışlı çözümleri ve erimiş lipidlerin Filtre. Temiz şırıngalar iyice kuruması için basınçlı hava uygulayın. İsteğe bağlı olarak, numune hazırlama işlemleri sırasında toz parçacıklarını veya liflerini yakalama önlemek için taşınabilir bir temiz oda kaputu kullanın. </li></ol> LCP MP 2. Sulandırma Not: kristalleştirme için en LCP ana lipid seçimi, hedef MP bağlıdır ve tipik olarak ana lipit incelemesinde kristallendirme çalışmalarında 14 içinde tanımlanır. Monoacylglycerols (mag) LCP kristalleştirme 15 için kullanılan lipitlerin en yaygın sınıfını temsil eder. protokolleri olarak 9.9 MAG (monoolein) kullanılarak dayanmaktadırBu tarihten 16 mezo kristalleşme en başarılı lipit olduğundan, lipid ev sahipliği yapar. 9.9 MAG kendi faz davranış farklılıkları dikkate aldıktan sonra diğer LCP konak lipidler veya lipid karışımları ile ikame edilebilir. Örneğin, GPCR durumunda monoolein tipik olarak reseptör stabilizasyonu için kolesterol ile sertleştirilmektedir. Burada, 9 kullanımı: 1 9.9 MAG (ağırlık / ağırlık): Ana lipid kolesterol karışımı. <ol><li> Daha önce, 13 tarif edildiği gibi Karışım, iki şırınga (# 1 ve 2 #) ve bir bağlayıcı kullanılarak uygun LCP ana lipid deterjan misel çözeltisi içinde saflaştırılır MP, hedef. </li><li> Kısaca, MP çözeltisi ile erimiş lipid ve şırınga # 2 ile yük şırınga # 1. 2 h 9.9 MAG / hac lipit / MP çözeltisi, 1: 1 h / h, sadece karşılık gelen LCP ana lipidin maksimum hidratasyon kapasitesi altında düzeyi, örneğin, 3 tekabül eden lipit ve sulu MP çözeltisi arasında bir oran kullanarak diğer çoğu kısa zincirli mag lipid / MP çözeltisi (7.9 MAG9.7 Gökçek, vb.) </li><li> Bir şırınga coupler ile şırınga bağlayın ve örnek homojen ve şeffaf hale gelene kadar, ileri ve geri şırınga arasındaki karışım taşımak için pistonları basmak suretiyle maddeleri karıştırma başlayın. LCP-SFX tarafından tam bir veri setinin toplanması için LCP örnek yaklaşık 50 ul hazırlayın. son örnek hacmi genellikle örnek konsolidasyon ve lipid titrasyon (Bölüm 5) sonra iki (ul 100 ~ kadar) yaklaşık bir faktör artacak. </li></ol> 3. Şırınga kristalleştirilmesi kurma <ol><li> saydam ve homojen bir LCP oluşturulduktan sonra, şırınga 2. içine tüm örnek hareket ettirin. şırınga 2. bağlanan coupler tutarken, şırınga 1. ayırın. </li><li> başka bir 100 ul çıkarılabilir iğne (gösterge 26s) bağlayın temiz şırınga (enjektör # 3) ve içine Yağışlı çözüm aspire yaklaşık 70 ul. f tetikler Yağışlı çözüm kompozisyonyüksek yoğunluklu mikro kristalleri ormation her hedef MP için tektir ve bu protokollerin geçmeden önce belirlenmelidir. Burada, A2A reseptörü (40 mM sodyum tiosiyanat, 100 mM sodyum sitrat, pH 5, 26-28% PEG400) mikro kristallerinin duş verimleri optimize edilmiş bir çökelti çözeltisi bileşimin kullanımı. </li><li> şırınga içinde teflon halkalı tutarken şırınga 3. iğne ayırın. </li><li> Teflon yüksük her iki şırınga yerinde doğru olduğundan emin olun, coupler üzerinden şırınga 2. ve 3. bağlayın. Dikkatlice yerine sıkıca kuplörünü vidalayın. </li><li> dikey alt şırınga # 2 ile ve LCP dize şırınga içerisinde 3. pistonu temas edene kadar yavaş yavaş ve sürekli şırınga 3. içine şırınga # 2 protein yüklü LCP örneği enjekte Orient akuple şırıngalar. Enjekte LCP hacmi şırınga 3. (~ 7 ul) yaklaşık 1/10 başlangıçtaki Yağışlı hacminin anlamına olacaktır. Her iki Syri üzerinde ölçek okuma sesi doğrulamanges (her iki pistonları yaklaşık 7 ul hareket etmelidir). </li><li> Kes şırınga # 2. bağlantı elemanı şimdi sadece çökeltme çözeltisi daldırılmış örnek içerir, şırınga 3. bağlanır. </li><li> tamamen dalgıç şırınga arayüzü, coupler açılış ucunda ve iğne somunu dahil şırınga 3., mühür Parafilm kullanın. Bu adım sırasında eksik sızdırmazlık değiştirmek Yağışlı koşulları ve kurutmak için örnek neden olabilir. </li><li> Tekrarlayın ~ 6 ek şırıngalar (# 9 4- #) toplam kullanan LCP numunenin 50 ul kristalleşmesini kurmak için 3.3-3.7 adımları (~ her şırınga başına LCP 7 ul). </li><li> Mağaza, bir ya da iki lif içermeyen temizlik dokular örnek dehidratasyon karşı korumak için su ile önceden ıslatılmış bir plastik torba içinde yapışmalı şırınga mühürlü. kristal büyümesi sırasında bir 20 ° C inkübatör çanta ve mağaza şırınga kapatılmalıdır. </li></ol> 4. Kristal Algılama <ol><li> görüntü LC için inkübatör şırıngalar çıkarındoğrudan şırınga içine P örnekleri (# 3 # 9) çapraz polarize ışık ile bir stereomikroskop altında her 12-24 saat. LCP filamandan muntazam ışıma gibi küçük kristal boyutu durumunda, sıkı bir şekilde istiflenmiş, parlak partiküller olarak kristallerin tanımlanması ya da. </li><li> torbaya mühürlü şırınga dönün ve gelecekte kullanılmak üzere 20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 7.9 MAG ile 5. Numune Konsolidasyon ve Titrasyon Not: a) fazla bir çökelti çözeltisi emmek ve b) XFEL ışınına enjeksiyonu üzerine dondurma lipid önlemek için: Burada tarif edilen lipit titrasyon adım iki amaca hizmet eder. 9.9 MAG oluşan bir LCP örnek veri toplama için bir vakum odası içine enjekte edildiğinde, yoğun bir buharlaştırma katmanlı kristalin faz içine numune parçalarını dönüştürme aşağı denge faz geçiş sıcaklığı (~ 18 ° C) altındaki sıcaklıklarda numunenin soğutabilir (lc). kiriş çarptı Lc fazın Bu yamalar, yoğun toz diffr üretmekBöyle Cornell-SLAC piksel dizisi detektörü (CSPAD) gibi hassas dedektör 6 zarar verebilir eylem halkaları. Bu tür karışımlar alt faz geçiş sıcaklıklarına sahip olarak daha kısa zincirli lipit (9.7 MAG veya 7.9 MAG) ile 9.9 MAG örnek Titrasyon, bu sorunu azaltır. Burada, bir 7.9 MAG ile 9.9 MAG oluşan bir LCP titrasyonu açıklar. Kısa zincirli mag (9.7 MAG, 7.9 MAG, vs.) kristalizasyon için kullanılan veya seri kristallografi verileri, ortam basıncında toplanır aşamasının 5.11 titrasyon hala gereklidir, ancak ne zaman için kullanılan orijinal LCP ana lipid kullanılarak gerçekleştirilebilir kristalizasyon. <ol><li> Yaklaşık 1 saat veri toplama başlamadan önce, 20 ° C inkübatör örnekleri ile şırınga çıkarın. </li><li> kristalleşme koşulları benzer bir kristal görünüm ve benzerlik dayalı örnek konsolidasyonu için 2-4 şırınga seçin. </li><li> Özenle seçilmiş şırınga gelen sızdırmazlık Parafilm çıkarın. </li><li> Kaldırşırınga bağlantı ve ilk seçilen şırıngaya temiz çıkarılabilir iğne (gösterge 26s) ekleyin. Ve yavaşça bir mikrosantrifüj tüp içine iğne yoluyla Yağışlı sıkmak ileri pistonu itin. Bu aşamada dikkatli olun, bu aşamada piston üzerine yüksek basınç uygulanarak numunenin bir kısmen ya da tamamen kaybına yol açan, çökeltme çözeltisi ile birlikte kristal yüklü LCP bazı çıkarma çünkü. </li><li> Yağışlı çoğu kaldırıldı ve LCP iğne girişinde birikmiş zaman piston durdurun. </li><li> seçilen diğer şırınga ile adımı yineleyin 5.4-5.5. </li><li> , Ortaya çıkan LCP örnekleri pekiştirmek temiz bir coupler ile birlikte iki şırınga bağlamak için. </li><li> başka şırınga birinden tüm örnek aktarmak için bir şırınga pistonu basınız. </li><li> Boş şırınga ayırın. </li><li> Tekrarlayın 2-4 pre kristal yüklü LCP tüm malzeme pekiştirmek için 5.7-5.9 adımlarıbir şırıngaya -Seçilmiş şırıngalar. mümkün olduğu kadar çöktürücü çıkarın. </li><li> Boş bir şırıngaya 7.9 MAG veya orijinal kısa zincirli MAG konak lipid ~ 5 ul ekleyin. Bir şırınga coupler ile konsolide numune ile şırınga bu şırınga bağlayın ve alternatif şırınga pistonları basarak karıştırın. Tüm kalan solüsyon emilir ve homojen ve şeffaf LCP oluşana dek tekrarlayın. titrasyon sonra LCP nihai tutarı aşırı Yağışlı ve kompozisyon hacmine bağlı olarak 20 ila 35 ul değişebilir. </li><li> bir şırınga içine tüm karışık LCP örneği taşımak ve boş şırınga ayırın. </li></ol> Mikro kristallerinin 6. karakterizasyonu <ol><li> Konsolide numune ile şırınga bir LCP-enjektör yükleme iğne (nokta tarzı 3, ölçer 22, uzunluğu bir inç) takın. </li><li> Dikkatle cam slayt LCP örnek ~ 1 ul çıkarmak ve bir cam kapak slip ile kaplayın. Hafifçe basınsandviç kapak kayma örnek. </li><li> Parlak alan aydınlatma ve çapraz polarize kullanılarak mümkün olan en yüksek büyütme (tipik olarak 100 X) bir stereo mikroskop altında LCP numunenin görüntüleri al. Mümkünse, numunedeki protein mikro kristallerin varlığını doğrulamak için bir UV floresan mikroskop ve (Kiral Kristallerin İkinci Derece Lineer Olmayan Görüntüleme) bir SONICC 17 görüntüleyici kullanarak ek görüntü alabilir. </li><li> Kristal boyutu ve yoğunluğu 10 tahmin ediyoruz. Veri toplama deney için ideal bir kristal yoğunluğu kristal boyutu, X-ışın kirişinin çapı ve LCP akımının çapına bağlıdır ve yaklaşık% 10-40 arasında bir kristal isabet oranı ile sonuçlanacaktır. </li></ol> Kristal Yoğunluk 7. Ayarlama Not: Kristal yoğunluğu Aşama bulunan 6.4 birden fazla kristal isabet büyük bir yüzdesi ile sonuçlanan çok yüksek kristaller optimize etmek için aşağıdaki adımları takip seyreltilmelidirVeri toplama örnek. Kristal yoğunluğu her hazırlanan örneklerde etkin veri toplanması için çok düşükse LCP MP kristaller konsantre edilmesi için güvenilir bir yöntem yoktur, çünkü, daha sonra, kristal büyüme koşulları yeniden optimize edilmelidir. <ol><li> düzgün LCP gerekli miktarda hazırlanması seyreltilerek kullanılır kristalleri ile orijinal numunenin LCP bileşimi (Aynı şey lipit ve yağışlı) taklit ederek seyreltme için kullanılır. </li><li> bir şırınga içine tüm düzgün LCP taşıyın. Boş şırınga ayırın ancak bağlı kuplörünü bırakın. </li><li> mikro kristalleri ile LCP örneği içeren şırınga iğne çıkarılır. Kuplörün aracılığıyla düzgün LCP içeren şırıngaya örnek şırınga bağlayın. </li><li> homojenlik elde edilene kadar Kuplörün yoluyla ileri ve geri iterek şırınga içeriğini karıştırın. </li><li> Tekrarlayın Bölüm 6 düzeltilmiş örneklemde mikro kristal yoğunluğu yeniden değerlendirmek. </li></ol> 8. LCP Enjektör yükleniyor and LCP-SFX Veri Toplama <ol><li> numune ile şırınga kuplörü çıkarın ve şırınga 1 &quot;yükleme iğne takılır. </li><li> bir LCP enjektörün rezervuar içine örnek 20-40 ul aktarın. </li><li> Örnek odasına 18 içine LCP enjektörü yerleştirin enjektörü başlatmak, akış hızını ayarlamak ve LCP-SFX veri toplamak. </li></ol> LCP 9. Ortaklığın Çözünür Protein kristalleri Not: çözünür proteinler kristallerinin verilmesi için bu LCP olarak viskoz ortam, kullanılarak bir büyük ölçüde seri kristalografi deneyinde protein tüketimi azaltmak için olanak sağlar. Bu adımları LCP çözünebilir proteinlerin kristalleri dahil açıklanmıştır. Kristaller, bir kristal süspansiyon şeklinde bir araya konsolide ve gerektiğinde süzüldü herhangi bir teknikle elde edilebilir. <ol><li> Yaklaşık% 10-40 kristal isabet oranları sağlamak için süspansiyon kristal yoğunluğunu ayarlayın. </li><li> Test 7.9 MAG, 9.7 MAG veya 1 kullanılarak LCP ile Yağışlı çözüm uyumluluğu: 7.9 MAG 1 karışımını ve ana lipid olarak 9.9 MAG. </li><li> Mix ~ ile kristal süspansiyonu 25 ul ~ homojen bir LCP oluşana kadar bir şırınga mikser kullanılarak ev sahibi lipid 25 ul. </li><li> Bölüm 8&#39;de açıklandığı gibi verileri LCP enjektör Bölüm 6. Yük numune anlatıldığı ve toplamak gibi kristal boyutu ve yoğunluğu değerlendirin. </li></ol>

<ol><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>DePonte, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+dynamic+virtual+nozzle+for+generation+of+microscopic+droplet+streams%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+D+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams.</a> J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Fenalti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+bifunctional+peptide+recognition+at+human+%CE%B4-opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Strcut+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor.</a> Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors.</a> Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Angiotensin+Receptor+Revealed+by+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography.</a> Cell. 161 (4), 833-844 (2015).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+allosteric+regulation+of+GPCRs+by+sodium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions.</a> Science. 337 (6091), 232-236 (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Lipid+and+Temperature+as+Important+Screening+Variables+for+Crystallizing+Integral+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases.+Trials+with+Diacylglycerol+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase.</a> Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaffrey%2C+M+%22Current+Topics+in+Membranes%22">Current Topics in Membranes</a>. 63, Elsevier. (2009).</li>
<li>Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoolein%3A+a+magic+lipid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Monoolein: a magic lipid?</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+D+%22Injection+Methods+and+Instrumentation+for+Serial+X-ray+Free+Electron+Laser+Experiments%22">Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments</a>. , Arizona State University. 1-126 (2015).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+bound+to+arrestin+by+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sct+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-resolved+crystallography+of+photosystem+II+using+a+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 513, 261-265 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada açıklanan protokoller bir LCP enjektör ile standart LCP-SFX deney için numune hazırlama prosedürünün bir genel hatlarıyla sağlar. Mikro kristal boyutuna bağlı olarak; bizim deneyime dayalı, tam bir veri kümesi toplama için gerekli nihai mikro-yüklü LCP örneğin toplam miktarı tipik olarak 50-100 ul (ilk protein yüklü LCP örneği 25-50 ul Tablo 1) , kalite ve yoğunluk. Her 100 ul gaz geçirmez bir cam şırınga uygun ve LCP olarak çökeltme çözeltisi da yayılmasını sağlamak için tam olarak uzatılmış bir ip halindeki LCP 7 ul yerleştirilebildiğinden, şırıngalar, en az 4-7 numuneleri hazırlanmalıdır her LCP-SFX deneyi. çapı, kılcal dar 20-50 um ile ekstrüze edildiği için, numune içinde herhangi bir partikül madde önlemek için çok önemlidir. bazen LCP tanıtılan olabilir tozlar ve liflerörnek veya Yağışlı çözümleri enjektör kılcal tıkayabilir ve deney sırasında aşağı süresini uzatabilir. Bu nedenle, numune hazırlama önce 5 um gözenekli filtreden lipid ve bütün solüsyonlar filtre önemlidir. İsteğe bağlı olarak, temiz bir oda ya da taşınabilir bir temiz oda kapağı numune hazırlama için kullanılabilir. Bu protokoller MP kristalleşme için ev sahibi lipid olarak 9.9 MAG (monoolein) kullanılarak dayanmaktadır. Bununla birlikte, 9.9 MAG sınırlı değildir ve kolay bir şekilde dikkate lipit fazı davranış farklılıkları aldıktan sonra başka bir LCP ana lipidler veya lipid karışımları uyarlanabilir. LCP içinde kristalize milletvekillerinin yapıların çoğu 9.9 MAG şimdiye kadar 15 en başarılı temsilcisi olan, mag birini kullanarak elde edilen bulundu. SFX&#39;e 9.9 MAG kullanmanın dezavantajı veri toplama vakumla gerçekleştirilir sık ​​sık oluşan, 18 ° C&#39;nin altında soğutulduktan sonra katmanlı bir kristal faza olan geçiştir. titrati7.9 MAG bu protokolün Bölüm 5&#39;te açıklanan ile bu soruna iyi bir çözüm sağlar. Bizim tecrübelerimize göre, kristaller herhangi bir olumsuz etkisi olmadan böyle bir titrasyon dayanabilir. Bununla birlikte, 7.9 MAG veya başka bir kısa-zincirli MAG eklenmesi arzu edilmez ise, titrasyon 9.9 MAG ile gerçekleştirilebilir. Bu durumda, vakum içinde enjeksiyon sırasında LCP akışını stabilize gaz daha az stabil numune akışını sahip pahasına, en örneklerde kristalli lipit fazının oluşumunu önleyebilir, azot, helyum arasından açık olmalıdır. Modern XFEL ve sinkrotron kaynakları, seri kristalografi veri toplama için müsait geniş bir dizi kristal akış hızı, ayarlanmasını sağlar çünkü LCP jel benzeri kıvama bir kristal taşıyıcı ortam olarak kullanım için büyük bir avantaja sahiptir. kadir c emriyle kristal tüketiminin dramatik azalma XFEL darbe tekrarlama oranı sonuçları ile kristal debisini EşleştirmeSıvı enjeksiyon ompared. LCP değil, aynı zamanda, çözünür proteinler 21 kristalleri için, sadece içinde yetiştirilen MP kristallerinin verilmesi için uygun bir taşıyıcı ortam. Seri kristalografi deneyler için araçlar ve reaktif bir cephanelik uzanan 24 - Çeşitli alternatif viskoz kristal taşıyıcı basında son zamanlarda 22 girmiştir. Ayrıca, kristal dağıtım ortamı olarak LCP seri kristalografi en az iyi kırılma kristaller 24,25, geleneksel sinkrotron kaynaklarına gösterilmiştir. detektör teknolojileri X-ışını büyüklüğe göre yoğunluğunu yanı sıra iyileştirmeler artırmak sinkrotron kaynaklarının gelecek yükseltmeleri, seri kristalografi yapı tayini için daha erişilebilir ve çekici bir yöntem yapacaktır. LCP-SFX MP yapısal tespiti için onun kudret göstermiştir. nerede l (örneğin GPCRs veya makromoleküler kompleksleri gibi) zorlu biyolojik sistemler içinsadece, uygun bir seçenek atom çözünürlüklü yapısını çözmek için eğer arge, kırınım kaliteli kristalleri büyür zordur, LCP-SFX, çekici sağlayabilir. Tüm avantajları, yani, MP kristalleşme ve kristal doğum, düşük protein tüketimi, radyasyon hasarı olmaması, oda sıcaklığı veri toplama, zamana bağımlı çalışmaların 26,27 olanakları ve hiçbir kristal hasat gereksinimi, LCP- için matris olarak LCP kullanarak SFX yapısal biyoloji gelecekte önemli bir rol oynamalıdır.

X-ışını kristalografisi membran proteinleri (milletvekilleri) atom çözünürlüklü yapılarını çözmek için bugüne kadar en başarılı tekniktir. Veya, mezo kristalleşme de lipidik kübik faz (LCP) olarak bilinen lipidik Mezofazların, kristalizasyon gibi G protein-eşli reseptörler gibi zorlu hedeflerin yüksek çözünürlüklü yapı tespitine sağladı MP kristalografisi önemli gelişmelerden birini (GPCR&#39;ler temsil ) 1. LCP araçları ve teknolojileri ile ilgili son gelişmeler, dünya çapında 2 yapısal biyologlar büyük bir topluluk için kullanılabilir bu tekniği yaptık. Ancak, birçok durumda LCP formu MP kristalleri yüksek çözünürlükte yeterli sinyal 3 elde edilebilir önce numuneler şiddetli radyasyon hasar ve bozulmalara muzdarip bile en gelişmiş Mikrofokus Sinkrotron ışın demetleri, kullanılmak üzere çok küçüktür. kristalografik veri toplama için yeni bir yaklaşımİlk X-ışını serbest elektron lazeri (XFEL) devreye ile sağlanmıştır. Yöntemi &quot;yıkımından önce kırınım&quot; ilkesi, ilk teorik 4 tanıtıldı ve ardından Linac Tutarlı Işık Kaynağı (LCLs&#39;in) 3, sert XFELs dünyanın öncü biyolojik örnekler üzerinde deneysel olarak doğrulandı dayanmaktadır. Bir XFEL protein atomları radyasyon hasarına yanıt olarak hareket edebilir önce bozulmamış kristalden yaymak femtosaniye süreli birkaç on içinde yüksek parlaklık X-ışını darbeleri üretir. İlk deneylerde, mikro sürekli bir sıvı enjektörü 5 tarafından üretilen bir sıvı akım içinde XFEL ışını ile kesiştiği için temin edilmiştir. Bu deney düzeneği seri femtosaniye kristalografisi (SFX) olarak bilinir. SFX&#39;e için sıvı enjektörler ile temel dezavantaj bunun sonucu olarak tam bir veri seti toplanması için saflaştırılmış protein miligramı On ila yüzlerce gerektirir yüksek akış hızı vardır. emp tarafındanönemli ölçüde azaltılmış protein ile, 9 - jel benzeri LCP örnekleri işleyebilir bir özel enjektörü (LCP microextrusion enjektör) 6 loying, başarılı bir LCP matris içinde yetiştirilen çeşitli insan GPCRs mikro kristalleri teslim ve yüksek çözünürlüklü yapıları 6 elde veri kümesi başına 0.3 altında mg tüketimi. Enjektör kadar 20, 40 ya da 100 bir kristal yüklü LCP ul ve örnek (10,000 kadar bir yüksek basınç uygulanması ile ekstrüde edilen ile dar bir kapiler tüp (çapı 10-50 um) sahip bir hazne oluşur HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) pompadan bir sıvı ile tahrik edilen basınç güçlendirilmiş aşaması ile, bir hidrolik pistonun, pSI). Kılcal memeden çıkan LCP akımı, reaktif olmayan gaz (tipik olarak helyum ya da azot) paralel bir akış ile stabilize edilir. Burada biz hazırlamak ve örnekleri karakterize için gerekli adımların görsel gösteriler sağlamakBir LCP-SFX deney için. Ek ayrıntılar yayınlanan protokolleri 10 bulunabilir. Bir örnek olarak, SFX yaklaşımı kullanan bir X-ışını veri toplama için LCP bu protein kristaller adenozın A2A reseptör 11 kullanımı ve hazırlayacaktır. Bizim protokoller XFEL ve sinkrotron kaynaklarında seri kristalografisi veri toplama LCP akışı yeteneğine sahip herhangi bir enjektör ile uyumlu olmasına karşın, illüstrasyon amaçları için, biz Ref açıklanan LCP enjektörü kullanacaktır. LCP yüksek yoğunluklu mikro kristalleri üretmek 6. Optimize Yağışlı koşulları yüksek verimli kristalleşme bu protokol geçmeden önce 12,13 tarama ile tespit edilmelidir. Bu protokol için tipik bir akış şemasıdır, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>LCP konak lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Kristalize edilecek protein için lipid barındırma</td></tr><tr><td>LCP konak lipid monoolein (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>Kristalleşecek protein için lipit barındırma</td></tr><tr><td>LCP konak lipid monopalmitolein (9.7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Kristalize edilecek protein için barındırma lipidi</td></tr><tr><td>LCP konak lipidi 7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>Numune enjeksiyonu sırasında lameller kristal faz (Lc) oluşumunu önlemek için tirasyon için lipid barındırma</td></tr><tr><td>20-50 mg / ml'ye</td><td></td><td></td> konsantre edilmiş saflaştırılmış protein çözeltisi Hedef <td>protein</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Lipitleri çözmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Şırıngaları yıkamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Eleven 100 & # 956; l Hamilton iğnesiz gaz geçirmez şırıngalar</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>LCP hazırlığı için</td></tr><tr><td>Sekiz şırınga kuplörü</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>LCP hazırlığı için</td></tr><tr><td>LCP-enjektör yükleme iğnesi</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 nokta stili 3, uzunluk 1 inç</td><td>LCP dağıtımı ve enjektör yüklemesi için</td></tr><tr><td>Çıkarılabilir iğne</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Çökeltici çözeltiyi çıkarmak için</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Şırınga sızdırmazlığı için kullanılır</td></tr><tr><td>Tüy bırakmayan lens temizleme dokuları</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj filtre tüpleri, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 &mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Çökeltici çözeltilerin ve lipitlerin filtrelenmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları, 1 inç x 3 inç&nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu iki yıkama şişesi. Biri mili-Q veya damıtılmış su ile doldurulmuş, diğeri metanol</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>ile doldurulur Bunlar şırıngaları, iğneleri ve kuplörü temizlemek için kullanılır. Önce metanol, sonra su kullanılır.</td></tr><tr><td>Eldivenler</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Fön kurutma şırıngaları, iğneler, yüksükler ve kuplörler için</td></tr><tr><td>Koruyucu gözlükler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basınçlı hava kutuları</td><td>Ofis Deposu (Toz Alma)</td><td>527494</td><td>Şırınga temizliği için</td></tr><tr><td>Dijital sıcaklık kontrol cihazlı kuru blok ısıtıcı</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>Lipitleri çözmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Santrifüj</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Eğirme çözümleri</td></tr><tr><td>Temiz Oda Mini - HEPA filtreli 12 inç Taşınabilir Pozitif Basınç Davlumbazı</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Temizleme numunesi hazırlama</td></tr><tr><td>Doğrusal polarizör ve döner analizör ile donatılmış stereo zoom mikroskobu&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Kristal yoğunluk kontrolü</td></tr><tr><td>UV mikroskobu</td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>İsteğe bağlı, kristal görüntüleme amaçları için</td></tr><tr><td>SHG görüntüleyici</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>İsteğe bağlı, kristal görüntüleme amaçları için</td></tr></tbody></table>

hazırlık ve seri femtosecond kristalografi için lipidik cubic faz protein mikro kristallerinin teslimi

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Membran proteinleri (milletvekilleri) hücre zarının ve primer ilaç hedefleri temel bileşenleridir. Akılcı ilaç tasarımı tipik kristalografisi ile elde edilen kesin yapısal bilgilere dayanır; Ancak MP&#39;ler kristalize zordur. MP yapısal belirlenmesinde son gelişmeler Sinkrotron kaynaklarına geleneksel kristalografik veri toplama sırasında radyasyon hasarı muzdarip genellikle iyi kırıcı verim lipidik kübik faz (LCP) kristalizasyon yöntemleri, ama genellikle küçük kristallerin gelişimi büyük ölçüde yararlanmıştır. Yeni nesil X-ışını serbest elektron lazeri (XFEL) son derece parlak femtosaniye darbeleri üreten kaynakların geliştirilmesi ya da hiç ihmal edilebilir radyasyon hasarı olan mikro kristalleri gelen oda sıcaklığı veri toplama sağladı. Seri femtosaniye kristalografisi (LCP-SFX) LCP teknolojiyi birleştirerek Bizim son çalışmalar W, çeşitli insan G proteini ile birleştirilmiş alıcıların yüksek çözünürlüklü yapıları sonuçlanmıştırhich yapı tayini için oldukça zordur hedef temsil etmektedir. LCP SFX teknikte, LCP kristalografik bir veri toplama XFEL demetiyle enjektör akımının kesişme MP mikro hem büyüme ve dağıtımı için bir matris olarak işe. Sadece alt 10 mikron kristalleri mevcut olduğunda LCP SFX büyük ölçüde veya, kırınım çözünürlüğünü artırabilir gösterilmiştir, oda sıcaklığında küçük kristalleri kullanılması bu kusurlar birikimi gibi daha büyük cryocooled kristaller ile ilişkili çeşitli problemlerin üstesinden varken, yüksek mosaicity ve cryocooling eserler. X-ışını kaynakları ve dedektör teknolojileri gelecekteki gelişmeler XFELs değil, aynı zamanda daha erişilebilir sinkrotron ışın demetleri değil sadece uygulama için seri kristalografisi son derece çekici ve uygulanabilir yapmalıdır. Burada seri kristalografi deneyler için LCP hazırlık, karakterizasyonu ve mikro kristallerin teslimat için detaylı görsel protokoller sunuyoruz.Bu protokoller, şırıngalar içinde kristalleşme deneylerini tespit ve kristal örnekleri karakterize, kristal yoğunluğu optimize enjektör cihazın içine mikro kristal yüklü LCP yükleme ve veri toplama için kiriş numunenin teslim yöntemlerini içerir.

Bir agonist ergotamin 8 (PDB kimliği 4NC3 ile kompleks içinde serotonin reseptörü 5-HT 2B: Biz temsilcisi bize SFX veri toplamak ve beş insan GPCRs yüksek çözünürlüklü yapıları çözmek için izin yukarıdaki protokolleri takip ederek hazırlanan numuneler, elde edilen sonuçların tarif Aşağıda ), bir antagonist Cyclopamine 6 (PDB İD 4O9R), a ile kompleks bir iki fonksiyonlu peptit ligandı DIPP-NH2 7 (PDB İD 4RWD), anjiyotensin reseptörü ile bir kompleks içinde, δ-opioid reseptörü ile bir kompleks içinde düzeltilir reseptörü (SMO) bloker ZD7155 9 (PDB kimliği 4YAY) ve rodopsin ve 19 (PDB kimliği 4ZWJ) arrestin arasındaki karmaşık; ve çözünür proteinler iki testi: lizozim (PDB kimliği 4ZIX) ve phycocyaninin (PDB kimliği 4ZIZ). 5-HT 2B nörotransmitter serotonin çeşitli santral ve periferal fizyolojik fonksiyonlarını aracılık eder. Bu reseptörkurmak ve İleri Foton Kaynak (APS) geleneksel microcrystallography çözüldü cryocooled yapısı ile LCLs&#39;in elde edilen oda sıcaklığı yapısını karşılaştırarak, LCP-SFX yöntemi doğrulamak için kullanıldı. Protein mikro kristalleri ile 100 ul LCP örnek (ortalama büyüklüğü yaklaşık 5 um) ~ toplam hazırlanmış ve SFX veri toplama için kullanılan ve 5HT 2B LCP-SFX yapısı başarıyla 2.8 Å (Şekil 2) 8 de çözüldü edildi. Numune hazırlama ve veri toplama ilave yararlı detayları Tablo 1 &#39;de verilmiştir. Düzeltilir reseptör (SMO) embriyonik gelişim ve tümör büyümesinde iyi gösterdi fonksiyonları ile F sınıfı GPCRs üyesi ve teratojen Cyclopamine moleküler hedeftir. Başlangıçta, 120 x 10 x 5 um arasında bir ortalama boyutu olan SMO / Cyclopamine nispeten büyük kristaller elde edilir ve daha sonra veri collecti kullanılmıştırBir sinkrotron kaynağında konvansiyonel goniometer tabanlı kristalografisi kullanarak. Bununla birlikte, bu büyük kristaller (2-3 derece), istenen muhtemelen kristal büyümesini hatalarının birikmesi veya cryocooling ilişkin etkilerden büyük mosaicity şikayetçi bir mikro-odaklama ışın-hattı (çapı 10 mm) zayıf kırınım üretti. LCP SFX Ancak, oda sıcaklığında 5 um büyüklüğünde kristallerinden LCLlerin kaliteli difraksiyon verileri toplamak için etkin. Yapısı açıkça bağlayıcı cebi 6 (Şekil 3) Cyclopamine yerini belirleme, üç temel eksen boyunca bir anizotropik 3.4, 3.2 ve 4.0 Å çözünürlükte moleküler değiştirme tarafından çözüldü. μ-opioid reseptörü (μ-OR) hedefleyen morfin gibi alkaloid opiatlar, yaygın şiddetli ağrı yönetimi için kullanılır. Ancak, onların geniş kullanım edinilen tolerans ve bağımlılık yol açar. morfinleri birlikte uygulanmasıδ-opioid reseptörü (δ-OR) antagonistleri ile de bu şekilde karışık agonist μ-TD-δ-TD-antagonisti ve fonksiyonu ile bileşikler için ara teşvik yukarıda belirtilen yan etkileri önlemek için gösterilmiştir. Biz δ-YA bi-fonksiyonel tetra-peptid DIPP-NH 2 ile bir kompleks içinde geleneksel goniometer tabanlı veri toplama stratejisini kullanan bir sinkrotron X-ışını kaynağında 3.3 Å kırınan cryocooled kristalleri kullanarak ilk kırılma verileri elde ettik. Bu veriler, peptit ligandı için kısmen belirsiz elektron yoğunluğu olmadığını ortaya koymuştur. Daha sonra, oda sıcaklığında XFEL difraksiyon verileri elde edilmiş ve yapısı ligand ve reseptör 7 açık bir yoğunluğunu gösteren 2,7 çözünürlükte belirlenmiştir. Bu yapı daha anlayış opioid reseptör fonksiyonu ve seçicilik için bir fırsat sundu ve yeni analjezik gelişimi için değerli bilgiler sağladı. (1 R AT) 1 reseptör, bir GPCR kan basıncının birincil düzenleyicisi olarak görev olduğunu. Biz LCP bir antagonist ZD7155 ile kompleks 1 R AT kristalize. Optimize kristaller bir sinkrotron kaynağında sadece ~ 4 Å ulaşan en sapması ile 40 × 4 × 4 mikron 3 maksimum boyuta ulaştı. Kristalleşme koşullarını değiştirerek, biz XFEL radyasyonu kullanılarak 2.9 Å çözünürlükte oda sıcaklığında yapısını elde etmek için kullanılan küçük kristallerin duş (10 × 2 × 2 um 3), elde edilen. 2.764.739 dedektör görüntüleri bir toplam proteinin 9 yaklaşık 0.29 mg karşılık gelen kristal yüklü LCP yaklaşık 65 | il tam bir veri seti yapmak için toplandı. kare toplam sayısının, 457.275 73.130 kare (hit% 16) başarılı bir şekilde endeksli ve entegre edildiği 17% bir isabet oranına karşılık gelen, kristal hit olarak tespit edilmiştir. GPCR&#39;ler G proteinleri veya arrestins da aracılık ettiği iki ana yol boyunca sinyal verir. Arrestin ile kompleks içinde bir GPCR yapısı zor kalmıştı oysa bir heterotrimerik G ler proteine ​​bağlı β 2 adrenerjik reseptör yapısı, birkaç yıl önce 20 çözüldü. Biz uzun boyutu 25-30 mikron ulaştı LCP bir rodopsin-arrestin füzyon proteininin küçük kristaller elde ancak kapsamlı optimizasyon rağmen, sadece sinkrotron kaynaklarına ~ 7 Å çözünürlüğe Kırınan. LCP-SFX yöntemini kullanarak, XFEL beamtime 12 saat içinde, biz 18.874 desen başarıyla endeksli ve 3.8 Å / 3.8 Å / 3.3 Å 19 çözünürlüğü sınırlarını anizotropik entegre edildiği dışarı 22262 kristal hit, topladı. Rodopsin-arrestin geleneksel yaklaşımları kullanarak yapı tayini direnen çok zorlu bir protein kompleksidir. Bu yapının başarılı belirlenmesi büyük potansiyelini göstermiştirLCP-SFX zor sorunların üstesinden gelmeye yönelik bir yöntem ve GPCRs içinde arrestin-önyargılı sinyalizasyon mekanizmasını incelemek için eşsiz bir fırsat sağladı. Son olarak, lipidik fazı içerisinde büyüyen protein kristallerinin zar ek olarak, numune hazırlama ve dağıtım yöntemi başarıyla önemli ölçüde protein tüketimi azaltmak için bize izin LCP kristallerinin dağıtımı için bir taşıyıcı ortam olarak kullanılan çözünür protein kristaller, için uyarlanmıştır yapı tayini için gerekli. Bu iki model protein, lizozim ve phycocyanin yapısı, her bir proteinin 21 az 0.1 mg kullanılarak, bu yöntem ile, sırasıyla 1,89 a ve 1.75 çözünürlükte çözülmüştür. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Serotonin reseptörü 2B </td><td> düzeltilir reseptör </td><td><strong&gt; Δ-opioid reseptör </td><td> Anjiyotensin II reseptör tip 1 </td><td> Rodopsin-arrestin </td><td> lizozim </td><td> Phycocyanin </td></tr><tr><td> PDB kimliği </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> Toplam numune kullanılan *, ul </td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> 65 </td><td> 75 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Kullanılan toplam protein, ug </td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Ortalama kristal boyutu, um </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 2 × 2 </td><td> 5-10 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 10 × 5 </td></tr><tr><td> İsabet oranı, % </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0.45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> Toplam veri toplama zamanı, saat </td><td> 10 </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0.75 </td><td> 0.67 </td></tr><tr><td> endeksli desen sayısı </td><td> 32.819 </td><td> 61.964 </td><td> 36.083 </td><td> 73.130 </td><td> 18.874 </td><td> 54.544 </td><td> 6629 </td></tr><tr><td> Uzay grubu </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C2 </td><td> C2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H3 2 </td></tr><tr><td> Çözünürlük, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3,2 / 3,4 / 4,0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3.3 / 3.8 / 3.8 </td><td> 1.89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> Tablo temsilcisi yapılar için örnek hazırlama ve veri toplama istatistik 1. Özet LCP-SFX yöntemi kullanılarak çözülmüştür. bir LCP SFX deney için gerekli örnek miktarı kristal kırınım kalitesi, kristal yoğunluğu, enjektör memesinin çapı, hem de XFEL kiriş boyutu, yoğunluğu ve darbe tekrarlama oranına bağlıdır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> LCP SFX. Numune hazırlama için tipik bir örnek hazırlama prosedürü Şekil 1. Akış gaz geçirmez bir cam şırınga hedef proteinin LCP kristalizasyon başlar. kristaller elde edildikten sonra, kristal yüklü LCP bir şırınga konsolide ve ek lipid ile titre edilir, Akustik içinAşırı Yağışlı çözüm, b. Daha sonra önce XFEL veri toplama için çeşitli mikroskopi yöntemleri kullanılarak karakterize edilmiştir kristaller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> Şekil 2 temsili bir sonuç yapı 5-HT 2B ergotamin ile kompleks içinde. (a) 5-HT 2B / ergotamin ve mikro kristalleri bir aydınlık alan mikroskobu modu 8 kullanarak görüntülü. Bu rakam Fen telif hakkı izni ile referans 8&#39;den yeniden olmuştur. (B) mikro kristaller 5-HT 2B / ergotamin bir çapraz polarize mikroskop modunu 8 kullanarak görüntülü. Bu rakam telif ile referans 8&#39;den yeniden olmuşturScience izni. (c) LCP-SFX yaklaşımı ile elde edilen 5-HT 2B / ergotamin yapısının bir karikatür gösterimi. modelde inşa edildi Lipidler sopa gösterimi gösterilmiştir. Ligand ergotamin küreler temsil gösterilir. Düz çizgiler yaklaşık membran sınırlarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> Şekil 3. Bir temsilci sonuç, Cyclopamine ile kompleks içinde SMO yapısı. Sol panel, SMO / Cyclopamine mikro kristalleri çapraz polarize mikroskop modunu 6 kullanarak görüntülü. Bu rakam Doğa Communications telif hakkı izni ile referans 6 yeniden olmuştur. Sağ paneli, bir karikatür representatiLCP-SFX yaklaşımı ile elde edilen SMO / Cyclopamine yapısı üzerinde. Ligand Cyclopamine küre şeklinde tanımlanır. Düz çizgiler yaklaşık membran sınırlarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Bu prosedürün genel amacı, sinkrotron ve x-ışını serbest elektron lazer kaynaklarında seri kristalografi veri toplama işlemi için lipidik kübik fazda membran proteini kristal örnekleri hazırlamaktır. Bu yöntemin, membran proteinlerinin yapısal biyolojisi alanındaki membranlar arası taşıma ve sinyal iletimi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olması beklenmektedir. Bu tekniğin temel avantajı, membran proteinlerinin yapı tayininin, oda sıcaklığında, minimum örnek tüketimi ve ihmal edilebilir radyasyon hasarı ile kendi doğal lipid ortamlarında gerçekleştirilmesine olanak tanımasıdır.Bu yöntemde yeni olan kişiler, lipidik kübik fazın özel aletler ve ön deneyim olmadan işlemesi zor, viskoz ve jel benzeri bir materyal olması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde, bir ve iki numaralı şırıngaları kullanarak membran proteinlerinin Lipidik Kübik Faz (LCP) içinde yeniden konstitüsyonu ile başlayın. Şeffaf ve homojen bir LCP oluştuktan sonra, numunenin tamamını İki Numaralı Şırıngaya aktarın.Kuplörü Bir Numaralı Şırınga'dan ayırırken İki Numaralı Şırınga'ya bağlı tutun. Çıkarılabilir bir iğneyi, Üç Numaralı Şırınga olarak adlandırılan başka bir 100 µL temiz şırıngaya takın. İçine yaklaşık 70 µL çöktürücü çözelti aspire edin.Teflon küreciği şırınganın içinde tutarak iğneyi 3 Numaralı Şırıngadan ayırın. 2 Numaralı ve 3 Numaralı Şırıngaları, Teflon küreciklerin her iki şırıngada da doğru konumda olduğundan emin olarak bağlayıcı aracılığıyla birbirine bağlayın. Bağlayıcıyı dikkatlice ve sıkıca vidalayarak yerine sabitleyin.Birleştirilmiş şırıngaları, İki Numaralı Şırınga altta olacak şekilde dikey konuma getirin ve protein yüklü LCP örneğini İki Numaralı Şırıngadan Üç Numaralı Şırıngaya, LCP şeridi Üç Numaralı Şırınganın pistonuna değene kadar yavaşça ve sabit bir hızla enjekte edin. Enjekte edilen LCP hacmi, Üç Numaralı Şırıngadaki başlangıç çöktürücü hacminin yaklaşık 1/10'una denk gelecektir. Hacmi, her iki şırıngadaki ölçek okumalarıyla doğrulayın.Ardından, İki Numaralı Şırıngayı ayırın. Bağlayıcı şu an sadece çöktürücü çözeltiye daldırılmış örneği içeren Üç Numaralı Şırıngaya bağlıdır. Piston-şırınga arayüzü, bağlayıcının açık ucu ve iğne somunu da dahil olmak üzere Üç Numaralı Şırıngayı tamamen mühürlemek için Parafilm kullanın.Bu adım sırasında sızdırmazlığın tam sağlanmaması, çöktürücü koşulların değişmesine ve örneğin susuz kalmasına neden olabilir. Toplamda yaklaşık 50 µL LCP örneği kullanarak, altı ek şırıngada kristalizasyonu başlatmak için protein yüklü LCP örneğinin enjeksiyon adımlarını tekrarlayın. Örnek susuzlaşmasını önlemek için, mühürlenmiş şırıngaları suyla önceden ıslatılmış bir veya iki adet lifsiz temizleme mendili ile birlikte plastik, kapatılabilir bir torbada saklayın.Torbayı mühürleyin ve kristal büyümesi sırasında şırıngaları 20 °C'lik bir inkübatörde saklayın. Kristal tespiti için, her 12 ila 24 saatte bir şırıngaları inkübatörden çıkararak LCP örneklerini doğrudan şırıngaların içinde, çapraz polarize ışıklı bir stereo mikroskop altında inceleyin. Kristalleri, sıkıca paketlenmiş parlak partiküller veya kristal boyutunun daha küçük olduğu durumlarda, LCP filamentinden gelen tekdüze bir ışıma olarak tanımlayın.Mühürlü şırıngaları torbaya geri yerleştirin ve gelecekteki kullanımlar için 20 °C'de saklayın. Lipid titrasyon adımı, fazla çöktürücü çözeltiyi absorbe etmek ve X-ışını serbest elektron lazer demetine enjeksiyon sırasında lipidlerin donmasını önlemek için gereklidir. Veri toplama işleminin başlamasından yaklaşık bir saat önce, numunelerin bulunduğu şırıngaları 20 °C'lik inkübatörden çıkarın.Benzer kristal görünümüne ve benzer kristalleşme koşullarına sahip olan iki ila dört şırıngayı örnek konsolidasyonu için seçin. Seçilen şırıngalardaki Parafilm sızdırmazlık malzemesini dikkatlice çıkarın. Şırınga bağlayıcısını çıkarın ve seçilen ilk şırıngaya temiz, çıkarılabilir bir iğne takın.Çöktürücüyü iğne aracılığıyla bir mikrosantrifüj tüpüne sıkmak için pistonu nazikçe ve yavaşça ileri itin. Bu adımda dikkatli olun; çünkü pistona yüksek basınç uygulamak, çöktürücü çözeltisiyle birlikte kristal yüklü LCP'nin bir kısmının dışarı atılmasına neden olarak numunenin kısmen veya tamamen kaybına yol açabilir. Çöktürücünün çoğu uzaklaştırıldığında ve LCP iğne girişinde toplandığında pistonu durdurun.Bu işlemi seçilen diğer şırıngalar için de gerçekleştirin. Elde edilen LCP örneklerini birleştirmek için iki şırıngayı temiz bir bağlayıcı aracılığıyla birbirine bağlayın. Örneği bir şırıngadan diğerine tamamen aktarmak için şırıngalardan birinin pistonuna bastırın.Boş şırıngayı ayırın. Kristal yüklü tüm LCP materyalini tek bir şırıngada toplamak için bu adımı tekrarlayın. Mümkün olduğunca fazla çöktürücü maddeyi uzaklaştırın.Boş bir şırıngaya yaklaşık beş µL 7.9 MAG veya orijinal kısa zincirli MAG konak lipidi ekleyin. Bu şırıngayı, bir şırınga bağlayıcı aracılığıyla konsolide örneğin bulunduğu şırıngaya bağlayın ve şırınga pistonlarını sırayla bastırarak karıştırın. Tüm kalıntı çözelti emilene ve homojen ve şeffaf bir LCP oluşana kadar işlemi tekrarlayın.Karıştırılmış LCP örneğinin tamamını tek bir şırıngaya aktarın ve boş şırıngayı ayırın. Birleştirilmiş örneğin bulunduğu şırıngaya bir LCP enjektörü yükleme iğnesi takın. Bir cam lam üzerine dikkatlice yaklaşık bir microliter LCP örneği püskürtün ve üzerini bir lameli ile kapatın.Örneği sıkıştırmak için lamelle hafifçe bastırın. Parlak alan aydınlatması ve çapraz polarizörler kullanarak, LCP örneğinin görüntülerini bir stereo mikroskop altında mümkün olan en yüksek büyütmede alın. Mümkünse, örnekteki protein mikrokristallerinin varlığını doğrulamak için bir UV floresan mikroskobu ve görüntüleme sistemi kullanarak ek görüntüler alın.Kristal boyutunu ve yoğunluğunu tahmin edin. Veri toplama deneyi için ideal kristal yoğunluğu; kristal boyutuna, x-ışını demetinin çapına ve LCP akışının çapına bağlı olacaktır ve yaklaşık %10 ila %40'lık bir kristal isabet oranıyla sonuçlanmalıdır. Son olarak, LCP enjektörünü doldurun ve metin protokolünde açıklandığı şekilde LCP seri femtosaniye kristalografisi veya LCP SFX veri toplama işlemini gerçekleştirin. Burada, serotonin reseptörünün ergotamin ile kompleks halindeki mikrokristallerinin aydınlık alan mikroskop modu ve çapraz polarize ışık mikroskop modu kullanılarak görüntülenmiş halleri gösterilmektedir.Serotonin reseptörü ergotamin kompleksinin yapısı LCP SFX yaklaşımıyla elde edilmiştir. Burada, çapraz polarize mikroskop modu kullanılarak görüntülenen, siklopamin ile kompleks halindeki düz kas reseptörünün mikrokristalleri gösterilmektedir. Reseptör siklopamin kompleksinin yapısı LCP SFX yaklaşımıyla elde edilmiştir.Bu prosedürde uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu yöntem membran protein hedeflerinin yapısı hakkında bilgi sağlayabilse de, küçük modifikasyonlarla diğer proteinlere de uygulanabilir. Bu tekniğin önemi ilaç keşfine kadar uzanmaktadır; çünkü yüksek çözünürlüklü yapılar, standart ligand-protein etkileşimleri için mükemmel şablonlar sunar ve daha etkili ilaçların tasarlanmasına yardımcı olur.

preparation-delivery-protein-microcrystals-lipidic-cubic-phase-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç ​​koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.

Protein Kristallerinin Mikrokristalografisi ve<em&gt; Selülozda</emKırınım

Burada bir iletişim kuralı protein microcrystals kontrollü üretim için mevcut. Süreç kontrollü kristalizasyon parametreleri çeşitli manipülasyon sağlayan otomatik bir aygıt kullanır. Protein kristalizasyon taşınan-izleme ve kristalizasyon damlacık parçacıklar RADIUS dağılımı soruşturma sırasında kontrollü ve otomatik eklenmesi kristalizasyon çözümleri tarafından out.

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

Bu protokolü nasıl imal ve mikrosıvısal cihazlar x-ışını kırınım veri toplama oda sıcaklığında için ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca, protein kristalizasyon tarafından dinamik ışık saçılma izlemek açıklar ve nasıl işlemek ve analiz kırınım veri elde.

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

Bir seri femtosecond zaman çözüldü kristalografisi deney başarısı verimli örnek Teslimde bağlıdır. Burada, bacteriorhodopsin microcrystals bir yüksek viskozite mikro-ekstrüzyon enjektör üzerinden ekstrüzyon optimize etmek için iletişim kuralları açıklar. Metodoloji bir roman üç yönlü bağlaştırıcı ile örnek homojenizasyon ve görselleştirme ile yüksek hızlı bir fotoğraf makinesi yararlanır.

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

Bu protokolün amacı, yakın zamanda Avustralya senkrotronunda görevlendirilen yüksek viskoz enjektör Lipidico'da veri toplama için seri kristalografi örneklerinin nasıl hazırlanacağını göstermektir.

Avustralya Senkrotron'da Seri Kristalografi Ölçümleri için Lipidico Enjeksiyon Protokolü

Bu makalenin amacı, izleyiciye, büyük, tek protein kristallerini büyütmek için küçük hacimli, buhar-difüzyon protokollerini seri kristalografi için büyük hacimli bir toplu mikro-kristalizasyon yöntemine nasıl dönüştürecekleri konusunda sağlam bir anlayış kazandırmaktır.

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Sunulan protokol, 96 kuyucuklu yüksek verimli bir diyaliz plakası kullanarak protein kristalleşme koşullarını ve kristal büyümesini taramak için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır. Mikrokristallerin büyük ölçekli büyümesi için diyalizör tüplerinin kullanımı, seri kristalografi ve MicroED uygulamaları için de gösterilmiştir.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Öğrenin, lipidik kübik fazda membran protein mikrokristalleri hazırlama ve seri femtosaniye kristalografi için teslim etme yöntemini. Bu teknik, oda sıcaklığında minimal örnek tüketimi ile yapısal biyoloji çalışmalarına olanak tanır.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Daha fazla video keşfet