Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Bu prosedürün genel amacı, sinkrotron ve x-ışını serbest elektron lazer kaynaklarında seri kristalografi veri toplama işlemi için lipidik kübik fazda membran proteini kristal örnekleri hazırlamaktır. Bu yöntemin, membran proteinlerinin yapısal biyolojisi alanındaki membranlar arası taşıma ve sinyal iletimi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olması beklenmektedir. Bu tekniğin temel avantajı, membran proteinlerinin yapı tayininin, oda sıcaklığında, minimum örnek tüketimi ve ihmal edilebilir radyasyon hasarı ile kendi doğal lipid ortamlarında gerçekleştirilmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntemde yeni olan kişiler, lipidik kübik fazın özel aletler ve ön deneyim olmadan işlemesi zor, viskoz ve jel benzeri bir materyal olması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde, bir ve iki numaralı şırıngaları kullanarak membran proteinlerinin Lipidik Kübik Faz (LCP) içinde yeniden konstitüsyonu ile başlayın. Şeffaf ve homojen bir LCP oluştuktan sonra, numunenin tamamını İki Numaralı Şırıngaya aktarın.

Kuplörü Bir Numaralı Şırınga'dan ayırırken İki Numaralı Şırınga'ya bağlı tutun. Çıkarılabilir bir iğneyi, Üç Numaralı Şırınga olarak adlandırılan başka bir 100 µL temiz şırıngaya takın. İçine yaklaşık 70 µL çöktürücü çözelti aspire edin.

Teflon küreciği şırınganın içinde tutarak iğneyi 3 Numaralı Şırıngadan ayırın. 2 Numaralı ve 3 Numaralı Şırıngaları, Teflon küreciklerin her iki şırıngada da doğru konumda olduğundan emin olarak bağlayıcı aracılığıyla birbirine bağlayın. Bağlayıcıyı dikkatlice ve sıkıca vidalayarak yerine sabitleyin.

Birleştirilmiş şırıngaları, İki Numaralı Şırınga altta olacak şekilde dikey konuma getirin ve protein yüklü LCP örneğini İki Numaralı Şırıngadan Üç Numaralı Şırıngaya, LCP şeridi Üç Numaralı Şırınganın pistonuna değene kadar yavaşça ve sabit bir hızla enjekte edin. Enjekte edilen LCP hacmi, Üç Numaralı Şırıngadaki başlangıç çöktürücü hacminin yaklaşık 1/10'una denk gelecektir. Hacmi, her iki şırıngadaki ölçek okumalarıyla doğrulayın.

Ardından, İki Numaralı Şırıngayı ayırın. Bağlayıcı şu an sadece çöktürücü çözeltiye daldırılmış örneği içeren Üç Numaralı Şırıngaya bağlıdır. Piston-şırınga arayüzü, bağlayıcının açık ucu ve iğne somunu da dahil olmak üzere Üç Numaralı Şırıngayı tamamen mühürlemek için Parafilm kullanın.

Bu adım sırasında sızdırmazlığın tam sağlanmaması, çöktürücü koşulların değişmesine ve örneğin susuz kalmasına neden olabilir. Toplamda yaklaşık 50 µL LCP örneği kullanarak, altı ek şırıngada kristalizasyonu başlatmak için protein yüklü LCP örneğinin enjeksiyon adımlarını tekrarlayın. Örnek susuzlaşmasını önlemek için, mühürlenmiş şırıngaları suyla önceden ıslatılmış bir veya iki adet lifsiz temizleme mendili ile birlikte plastik, kapatılabilir bir torbada saklayın.

Torbayı mühürleyin ve kristal büyümesi sırasında şırıngaları 20 °C'lik bir inkübatörde saklayın. Kristal tespiti için, her 12 ila 24 saatte bir şırıngaları inkübatörden çıkararak LCP örneklerini doğrudan şırıngaların içinde, çapraz polarize ışıklı bir stereo mikroskop altında inceleyin. Kristalleri, sıkıca paketlenmiş parlak partiküller veya kristal boyutunun daha küçük olduğu durumlarda, LCP filamentinden gelen tekdüze bir ışıma olarak tanımlayın.

Mühürlü şırıngaları torbaya geri yerleştirin ve gelecekteki kullanımlar için 20 °C'de saklayın. Lipid titrasyon adımı, fazla çöktürücü çözeltiyi absorbe etmek ve X-ışını serbest elektron lazer demetine enjeksiyon sırasında lipidlerin donmasını önlemek için gereklidir. Veri toplama işleminin başlamasından yaklaşık bir saat önce, numunelerin bulunduğu şırıngaları 20 °C'lik inkübatörden çıkarın.

Benzer kristal görünümüne ve benzer kristalleşme koşullarına sahip olan iki ila dört şırıngayı örnek konsolidasyonu için seçin. Seçilen şırıngalardaki Parafilm sızdırmazlık malzemesini dikkatlice çıkarın. Şırınga bağlayıcısını çıkarın ve seçilen ilk şırıngaya temiz, çıkarılabilir bir iğne takın.

Çöktürücüyü iğne aracılığıyla bir mikrosantrifüj tüpüne sıkmak için pistonu nazikçe ve yavaşça ileri itin. Bu adımda dikkatli olun; çünkü pistona yüksek basınç uygulamak, çöktürücü çözeltisiyle birlikte kristal yüklü LCP'nin bir kısmının dışarı atılmasına neden olarak numunenin kısmen veya tamamen kaybına yol açabilir. Çöktürücünün çoğu uzaklaştırıldığında ve LCP iğne girişinde toplandığında pistonu durdurun.

Bu işlemi seçilen diğer şırıngalar için de gerçekleştirin. Elde edilen LCP örneklerini birleştirmek için iki şırıngayı temiz bir bağlayıcı aracılığıyla birbirine bağlayın. Örneği bir şırıngadan diğerine tamamen aktarmak için şırıngalardan birinin pistonuna bastırın.

Boş şırıngayı ayırın. Kristal yüklü tüm LCP materyalini tek bir şırıngada toplamak için bu adımı tekrarlayın. Mümkün olduğunca fazla çöktürücü maddeyi uzaklaştırın.

Boş bir şırıngaya yaklaşık beş µL 7.9 MAG veya orijinal kısa zincirli MAG konak lipidi ekleyin. Bu şırıngayı, bir şırınga bağlayıcı aracılığıyla konsolide örneğin bulunduğu şırıngaya bağlayın ve şırınga pistonlarını sırayla bastırarak karıştırın. Tüm kalıntı çözelti emilene ve homojen ve şeffaf bir LCP oluşana kadar işlemi tekrarlayın.

Karıştırılmış LCP örneğinin tamamını tek bir şırıngaya aktarın ve boş şırıngayı ayırın. Birleştirilmiş örneğin bulunduğu şırıngaya bir LCP enjektörü yükleme iğnesi takın. Bir cam lam üzerine dikkatlice yaklaşık bir microliter LCP örneği püskürtün ve üzerini bir lameli ile kapatın.

Örneği sıkıştırmak için lamelle hafifçe bastırın. Parlak alan aydınlatması ve çapraz polarizörler kullanarak, LCP örneğinin görüntülerini bir stereo mikroskop altında mümkün olan en yüksek büyütmede alın. Mümkünse, örnekteki protein mikrokristallerinin varlığını doğrulamak için bir UV floresan mikroskobu ve görüntüleme sistemi kullanarak ek görüntüler alın.

Kristal boyutunu ve yoğunluğunu tahmin edin. Veri toplama deneyi için ideal kristal yoğunluğu; kristal boyutuna, x-ışını demetinin çapına ve LCP akışının çapına bağlı olacaktır ve yaklaşık %10 ila %40'lık bir kristal isabet oranıyla sonuçlanmalıdır. Son olarak, LCP enjektörünü doldurun ve metin protokolünde açıklandığı şekilde LCP seri femtosaniye kristalografisi veya LCP SFX veri toplama işlemini gerçekleştirin. Burada, serotonin reseptörünün ergotamin ile kompleks halindeki mikrokristallerinin aydınlık alan mikroskop modu ve çapraz polarize ışık mikroskop modu kullanılarak görüntülenmiş halleri gösterilmektedir.

Serotonin reseptörü ergotamin kompleksinin yapısı LCP SFX yaklaşımıyla elde edilmiştir. Burada, çapraz polarize mikroskop modu kullanılarak görüntülenen, siklopamin ile kompleks halindeki düz kas reseptörünün mikrokristalleri gösterilmektedir. Reseptör siklopamin kompleksinin yapısı LCP SFX yaklaşımıyla elde edilmiştir.

Bu prosedürde uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saatten kısa sürede tamamlanabilir. Bu yöntem membran protein hedeflerinin yapısı hakkında bilgi sağlayabilse de, küçük modifikasyonlarla diğer proteinlere de uygulanabilir. Bu tekniğin önemi ilaç keşfine kadar uzanmaktadır; çünkü yüksek çözünürlüklü yapılar, standart ligand-protein etkileşimleri için mükemmel şablonlar sunar ve daha etkili ilaçların tasarlanmasına yardımcı olur.