Name: Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Öğrenin, mineralize dokuların yüksek verimli çoklu resim cryohistolojisini. Bu yarı otomatik platform, gözlemciden bağımsız ve tamamen dijital analiz sağlayarak kas-iskelet biyologları için maliyet etkin çözümler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarına teşekkür etmek ister: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 ve T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada birlikte lokalize ve tek bir bölüm üzerinde lekelenme / görüntüleme birden mermi görüntüleri hizalayarak çeşitli biyolojik önlemlerin ölçmek için detaylı bir cryohistology protokolü sundu. Bu bölüm, dokuya güç morfolojisi (örneğin, mineralize edilmiş kemik ve kıkırdak) muhafaza etmesi cryotape kullanılarak belirtilen yöntem özellikle faydalıdır. Buna ek olarak, kesit doku, aynı bölümün boyama / görüntüleme sanmı için izin cam slayt sıkıca yapıştırılır; seri bölümlerde her bir farklı bir protokol ile boya...

Biyolojik araştırmalar genellikle sık histolojik analiz 1-3 çeşit ile ilişkili verimli fenotiplendirilmesini gerektirir. Bu ihtiyaç, fare genomuna 4 her genin bozmaya daha da belirgin iddialı projelerle olduğunu. Bu histolojik analizler tek tek hücrelere spesifik genlerin veya proteinlerin eşleme ifadesi hücre morfolojisi ve / veya anatomik özellikleri değerlendirmek arasında olabilir. Aslında, genomik alana histoloji temel katkılardan biri, belirli bir bölge ya da hücre tipine özel bir moleküler sinyali ilişkilendirmek yeteneğidir. Özellikle kas-iskelet dokular için histoloji geleneksel yöntemler, genellikle zaman alıcı ve zahmetli, bazen düzeltmek için hafta gerektiren vardır, decalcify, bölüm, leke ve görüntü numune daha sonra insan yorumuna aracılığıyla görüntüleri analiz. In situ hybridizat edip, immünohistokimya ile, çoklu moleküler sinyallerin incelenmesiiyon ya da özel lekeleri, uygun gerçekleştirmek için birden çok bölüm ve hatta birden fazla örnekleri gerektirir. Ayrıca, bu çoklu tepkiler verilen bir örnekten içinde belirli bir bölgeye eş lokalize edilemez bazen aynı hücreye birlikte lokalize ve olamaz. genomik ve epigenomics alan dijital çağa hareket ettikçe, histolojik alanı da verimli, yüksek verim ve tek histolojik bölüm içinde moleküler sinyallerin çeşitli otomatik analizini sağlamak için davayı takip gerekir. Gerçekten de, belirli bir numune içindeki belirli hücrelere birden fazla moleküler sinyalleri ilişkilendirmek geliştirilmiş histolojik teknikler için bir talep vardır. Son zamanlarda, mineralize dokusundan 5-14, belirli bir bölüm içinde birkaç yanıt tedbirleri değerlendirmek için yeni bir yüksek verimli cryohistological yöntemi yayınlamıştır. işlem, bir mikroskop lamı katı bantlanmış bölümüne yapışan, dondurulmuş cryotape ile cryosection stabilize içerir veHer bölümünde boyama ve görüntüleme birkaç tur yürütülmesi. Görüntülerin bu tur daha sonra elle veya görüntü analiziyle önce bilgisayar otomasyon (Şekil 1) ile hizalanır. Burada, bu sürecin ayrıntılı protokolleri sunmak ve bu tekniklerin değişik biyolojik süreçlerin anlayışımızı geliştirdik örnekler sunmak.

<table><tbody><tr><td>% 10 nötr tamponlu formalin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur. Zehirli. % 4 paraformaldehit ile ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Dokuya bağlı olarak farklı boyutlar kullanılabilir</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Diğer kriyomatrislerle ikame edilebilir. Bununla birlikte, PVA/PEG bazlı reçineler elimizde en iyi sonucu verdi.</td></tr><tr><td>2-metil-bütan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Diğer marka/modellerle değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Numune diski</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Diğer markalar/modeller ile değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Kriyostat bıçakları</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Diğer marka/modellerle değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Kriyobant</td><td>Bölüm Laboratuvarı</td><td>Kriyofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Silindir Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>62800-46</td><td>Diğer markalar/modeller ile değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Plastik mikroskop slaytları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71890-01</td><td>Diğer markalar/modeller ile değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Cam mikroskop slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Diğer marka/modellerle değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>Norland Optik Yapıştırıcı, 61</td><td>Norland Optik</td><td>Norland Optik Yapıştırıcı, 61</td><td></td></tr><tr><td>UV Siyah Işık</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Kitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>InSpeck kırmızı mikroskoplar</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>InSpeck yeşil mikro küreler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Alizarin kompleksi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Demeklosiklin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcut.</td></tr><tr><td>ELF 97 sarı floresan asit fosfataz substrat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur. Hoechst 33342 veya diğer nükleer boyalarla ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Cy5 nükleer karşı boya)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Sodyum asetat susuz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>sodyum tartrat dibazik dihidrat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Sodyum nitrit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>MgCl2 hekzahidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Hızlı Kırmızı TR Tuz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur. Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr> <tr><td>Naphthol AS-MX&nbsp;</td> gibi diğer substrat kitleri ile de kullanılabilir;<td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>N, N dimetilformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Toluidin mavisi O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>Diğer doğrusal veya döşemeli tarayıcılar da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>DAPI Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>GFP Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>YFP Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Özel sarı (ELF 97) Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>töre; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Filtre Seti</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane Bant Transfer Sistemi Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>62800-10</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>CryoJane Bant Windows Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>62800-72</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr><tr><td>CryoJane Yapıştırıcı Slaytlar Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>62800-4X</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur.</td></tr></tbody></table>

yüksek verim, mineralize dokuların Çoklu resim cryohistology

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

Çeşitli dokuların etkin fenotiplemesi ve histopatolojisine artan bir ihtiyaç vardır. Bu fenotipleme ihtiyacı, fare genomundaki her geni bozmaya yönelik iddialı projelerle belirgindir. Araştırma topluluğu, histoloji yoluyla dokuları fenotiplemek için hızlı ve ucuz araçlara ihtiyaç duymaktadır. İskelet dokularının histolojik analizleri genellikle zaman alıcıdır ve en iyi ihtimalle yarı kantitatiftir ve düzenli olarak eğitimli bireylerden alınan slaytların öznel olarak yorumlanmasını gerektirir. Burada, mineralize dokuların verimli ve ucuz fenotiplemesi için kriyohistolojik bir paradigma sunuyoruz. İlk olarak, mineralize dokuların morfolojisini koruyan yeni bir bant stabilize kriyoseksiyon yöntemi sunuyoruz. Bu bölümler daha sonra cam slaytlara sağlam bir şekilde yapıştırılır ve birkaç tur boyama boyunca tekrar tekrar görüntülenir. Elde edilen görüntüler daha sonra manuel olarak veya bilgisayar yazılımı aracılığıyla hizalanır ve birkaç katmanlı görüntüden oluşan bileşik yığınlar elde edilir. Protokol, belirli bir bölümdeki belirli hücrelere çok sayıda moleküler sinyalin birlikte lokalizasyonuna izin verir. Ek olarak, bu floresan sinyaller bilgisayar yazılımı aracılığıyla objektif olarak ölçülebilir. Bu protokol, mineralize dokuların histolojisi ile ilişkili birçok eksikliğin üstesinden gelir ve kas-iskelet dokularının ilerlemesi için yüksek verimli, yüksek içerikli fenotipleme için bir platform görevi görebilir.

Yüksek Verim, Çok Görüntü Cryohistology için Genel İş Akışı Şekil 1, bu teknik için kullanılan genel akışını gösterir. Bu görüntüleme ve nihayet görüntü hizalama / analiz birkaç tur aracılığıyla tespit edildiği yerden birkaç adım içerir. Haftada o örneklerin bu tür kirecini için gereken daha az zaman görüntüleme 4 mermi yoluyla numune sabitleme gitmek için süreç biraz alabilir. Görüntüleme düz...

Bu el yazmasında, mineralize dokuların donmuş kesitleri üzerinde birkaç tur floresan görüntülemeden çoklu yanıt ölçümlerinin hizalanmış kompozit görüntülerini üretmek için yüksek verimli, yarı otomatik bir kriyohistoloji platformu sunuyoruz.

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Bu teknolojinin amacı, kas-iskelet biyologları için hem maliyet etkin hem de anlamlı olan; karmaşık model sistemlerini yüksek kapasiteli, gözlemciden bağımsız ve tamamen dijital bir şekilde entegre eden histolojik araçlar sağlamaktır. Çoğu biyolojik araştırmacı için kritik öneme sahip olan histoloji, genellikle emek yoğun ve nicel olmayan bir süreçtir. Bu nedenle, verimli, yüksek kapasiteli ve otomatik analiz sağlayan histolojik tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır.Kriyohistoloji platformumuz ile araştırmacı, aynı lamı yüksek kapasiteli bir şekilde defalarca görüntüleyip boyayarak, belirli bir numunedeki birden fazla moleküler sinyali spesifik hücrelerle ilişkilendirebilir. Bu prosedürü, bu tekniklerin geliştirilmesine ve uygulanmasına öncülük eden laboratuvarımdaki araştırma asistanları Doktor Xi Jiang ve Li Chen tanıtacaklar. Bu prosedüre başlamak için numuneyi formalinden çıkarın, fazla dokuları ayıklayın ve 1x PBS içinde hazırlanmış %30 sükroza aktarın.Numuneleri 4 °C'de 12 ila 24 saat boyunca sukroz içerisinde inkübe edin. Ardından, bir kriyokalıbı kriyogömme ortamı ile doldurun ve numuneleri kalıba yerleştirin. Daha sonra, ilgi duyulan bölgenin kesim düzlemi kalıbın tabanına paralel olacak şekilde numuneleri kalıpta hizalayın.Bundan sonra, kriyogömme ortamının ince bir tabakası donup numuneleri sabitleyene kadar kriyokalıbı bir parça kuru buzun üzerine yerleştirin. Ardından, kriyokalıbı kuru buz pelletinin üzerinde tutmaya devam ederek, kalıbın kalan hacmini kriyogömme ortamı ile doldurun. Bunu takiben, kriyokalıbı kuru buz ile önceden soğutulmuş 2-metilbütan içeren bir kaba yerleştirin.Numuneler tamamen dondurulduğunda, kriyokalıbı çıkarın ve fazla 2-methylbutane'i silkeleyerek uzaklaştırın. Kriyokalıbı selofana sarın ve -20 °C veya -80 °C'de saklayın. Bu prosedürde, numune bloğunu dondurucudan -20 ile -25 °C'ye ayarlanmış bir kriyostata aktarın.Ardından, bloğu kriyokalıptan çıkarın ve fazla kriyogömme ortamını bir jilet yardımıyla kesin. Daha sonra, numune diskine bir miktar kriyogömme ortamı ekleyin ve numune diskinin yüzeyi bloğun alt yüzeyine paralel olacak şekilde bloğu hizalayın. Kriyogömme ortamının donmasını bekleyin.Ardından, numune diskini numune başlığına yerleştirin ve başlığı, bıçağın numune bloğunun yüzeyine paralel keseceği şekilde ayarlayın. Sonra, ilgi bölgesini kapatacak şekilde kriyobant parçaları kesin ve bunları kriyostatta önceden soğutun. Daha sonra, gerektiğinde ayarlamalar yapmaya devam ederek bloğu ilgi bölgesindeki bir seviyeye kadar kırpın.İlgilenilen bölgeye ulaşıldığında ve kesit alınabilecek duruma gelindiğinde, blok yüzeyindeki talaşları fırça ile temizleyin. Ardından, yapışkan olmayan gümüş altın renkli sekmelerden tutarak kriyobantın yapışmayan arka kısmını çıkarın. Daha sonra bandı, yapışkan tarafı aşağı gelecek şekilde bloğun üzerine yerleştirin.Silindir kullanarak kriyobanda basınç uygulayın ve kriyostatın otomatik motorunu veya manuel kesme tekerleğini kullanarak bir kesit alın. Ardından, kesiti kriyostat içindeki plastik bir mikroskop lamı üzerine doku tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Plastik lamı kriyostattan çıkarın ve kesitin lam yüzeyine yapışması için kriyogömme ortamının erimesini bekleyin.Seri kesitler veya ilgilenilen diğer bölgeler için kesme işlemini tekrarlayın. İşlem tamamlandığında, kesitleri bir lam kutusuna yerleştirin ve saklama süresinin uzunluğuna ve sonraki yanıt ölçümlerine bağlı olarak 4, -20 veya -80 °C'de saklayın. UV ile kürlenen yapıştırıcı yöntemini uygulamak için öncelikle mikroskop lamını etiketleyin.İki cam lam üzerine bir damla UV aktif optik yapıştırıcı uygulayın ve bir lamın kenarını kullanarak yapıştırıcıyı cam lamların yüzeyine ince bir tabaka halinde yayın. Ardından, gümüş altın şeridi kesin ve bantlanmış kesit bölümünü, doku tarafı yukarı gelecek şekilde ilk lamın yapıştırıcı tabakasının üzerine yerleştirin. Bant altında hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için, kesiti bir uçtan diğerine doğru yuvarlama hareketiyle uygulayın.Ardından, bantlı kesiti birinci lamdan çıkarın, ikinci lamın yapışkan katmanına yerleştirin ve hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. Her lama ilgili deney için uygun sayıda kesit yerleştirildikten sonra, çevre bölgelerdeki fazla yapışkanı silin. Son olarak, bant altındaki kesitleri kabarcık veya lifler açısından yakından inceleyin.Ardından, yapıştırıcı tabakayı çapraz bağlamak için mikroskop lamlarını beş ila on dakika boyunca UV siyah ışık altında bekletin. Bu adımda, 50 µL yeşil ve 50 µL kırmızı mikro küreciği 100 µL su içerisinde çözerek referans işaretleyici çözeltiyi hazırlayın. Çözeltiyi karanlıkta, 4 °C'de saklayın.Ardından, bir pipet ucunu mikroküre çözeltisine daldırın ve mikroküre çözeltisini ilgi bölgesinin bitişiğindeki her bir bölüme hafifçe dokundurarak uygulayın. Sonra, lamları oda sıcaklığında kurutun ve eğer lamlar aynı gün işlenecekse, 30 dakika boyunca folyo ile kapatarak ışıktan koruyun. İşlem aynı gün yapılmayacaksa, lamları dört degrees Celsius sıcaklıktaki bir lam kutusuna yerleştirin.Kesitleri boyadıktan sonra, lamelleri uygun bir bağlama medyumu kullanarak lamların üzerine kapatın. Görüntüleme işlemini gerçekleştirmek için lamları mikroskop tepsilerine yerleştirin ve tepsileri lam tarama mikroskobunun tepsi yığınına yerleştirin. Ardından, mikroskop yazılımındaki profil listesine tıklayarak, her bir florofor için uygun pozlama süresine sahip olan her lam için bir profil yükleyin.Her bir lamın önizleme görüntüsünü almak için Start Preview Scan düğmesine tıklayın. Yazılım, lam etiketlerinde yer alan barkodları okuyarak otomatik olarak bir dosya adı atayacaktır. Alternatif olarak, her bir lama manuel olarak bir dosya adı atanabilir.Doku tespit sihirbazına girerek, çizim aracını kullanarak her bir bölgeyi çizerek, gerekli düzenlemeleri yaparak ve sonraki görüntüleme turları için kaydederek ilgi bölgelerini belirleyin. Her bir lam hazırlandıktan sonra, Taramayı Başlat düğmesine tıklayarak tarama işlemini başlatın. Her görüntüleme turunun ardından, bir sonraki boyama adımından önce, lamları lamel örtüleri kendiliğinden düşene kadar 1x PBS ile dolu bir coplin kavanozuna daldırın.Tüm görüntüleme turları tamamlandıktan sonra, görüntü birleştirme ve analizi için her bir kanaldan alınan görüntüleri TIF veya JPG dosyaları olarak dışa aktarın. Bu şekilde, üç aylık bir fare femurundan alınan bir kesit, kalsiyen mavisi ile boyanmış ve ilk görüntüleme turunda beyaz renkte görülen birikmiş mineral ile yeşil ve kırmızı renkte görülen mineralizasyon işaretleri için görüntülenmiştir. Ardından lamlar, ikinci turda sarı renkte görülen trap aktivitesi ve üçüncü görüntüleme turunda kırmızı renkte görülen AP aktivitesi için görüntülenmiştir.Son olarak, dördüncü turda lamlar toluidin mavisi ile boyanmıştır. Kromojenik tur da dahil olmak üzere her görüntüleme turunda referans işaretleyicilerin görüntüleri alınmış ve özel yazılım kullanılarak hizalanmıştır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, tipik bir örneğin dekalsifikasyonu için gereken süreden daha kısa sürede tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, kas-iskelet sistemi topluluğu tarafından daha yaygın olarak kullanılabileceğini umduğumuz, mineralize dokuların yüksek kaliteli ve yüksek içerikli görüntülerinin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

high-throughput-multi-image-cryohistology-of-mineralized-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Bu çalışma, konfokal görüntüleme yöntemlerinin tam olarak kullanılmasını sağlayan kalın, üç boyutlu doku kesiti analizi için yeni bir işleme ve görüntüleme protokolü sunmaktadır. Bu protokol antijenliği korur ve cilt histolojisini ve potansiyel olarak diğer doku tiplerini analiz etmek için sağlam bir sistemi temsil eder.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Bu iletişim kuralı bir Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak Nano çözünürlükte görüntüleme için bir doku belirli hücreleri hedef alıyor. Biyolojik malzeme reçine gömülü seri bölümleri çok sayıda hedefi tanımlamak için bir ışık mikroskobu ve sonra SEM hiyerarşik bir düzen izler ilk...

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

Bu yöntem, r26R-Konfeti (Konfeti) fare modelinin mineralize dokuları incelemek için kullanımını açıklar ve üreme stratejisinden görüntü edinimiiçin tüm adımları kapsamaktadır. Dahil tüm yumuşak dokulara uygulanabilir genel bir protokol ve mineralize dokulara uygulanabilir değiştirilmiş bir protokoldür.

Mineralize Dokuları Incelemek için Konfeti Faresini Kullanarak Klonal Genetik İzleme

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, mikroskobik ve makroskopik ölçekleri kapsayan insan kalplerinden elde edilen örnekleri analiz etmek için kapsamlı bir boru hattı sunar.

İnsan Kalbinin Çok Ölçekli Üç Boyutlu Anatomik Çalışması için Boru Hattı

Yinelemeli ağartma-uzatma-çoğullama (IBEX) ve ticari bir nükleotid etiketleme testinin (Click-iT EdU) kombinasyonu, sabit donmuş murin dokusu kesitlerinde oldukça dinamik süreçlerde bölünen hücre tiplerinin saptanmasını ve sınıflandırılmasını sağlar. Ayrıca, yeni bir açık kaynaklı görüntü işleme hattı, yüksek verimli görüntü elde etme ve analiz sağlar.

Doku Örneklerinde Cilt Hücresi Fenotiplerini ve Proliferasyon Durumlarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Görüntüleme ve Analiz İş Akışı

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Bu protokol, kalsifikasyon olmuş damar örnekleri için adım adım bir iş akışı içerir: doku işleme, kalsifikasyon giderilmesi, RNA doğrulama, kalsifikasyon seviyesi tespiti ve Nanostring GeoMx Dijital Mekansal Profiler (DSP) üzerinde ilgi alanı seçim stratejileri. Amaç, güvenilir mekansal transkriptomik analiz için damar dokusu morfolojisi ve RNA'nın korunmasına yönelik kapsamlı bir yöntem sunmaktır.

Dijital Mekansal Profilleme için Korunmuş Morfoloji ve RNA ile Kalsifikasyon Arter Hazırlanması ve İşleme

Bu protokol, kalın dokular için kriyo-elektron tomografisini (kriyo-ET) standartlaştırır; yüksek basınçlı dondurma (HPF) ile waffle yöntemi, kriyojenik odaklı ion ışını (kriyo-FIB) kaldırma ve doz-simetrik, paralel alım ile entegre edilir; böylece fare hipokampusunda tekrarlanabilir in situ analizi için uniform ince lameller ve vitrifikasyon örnekler elde edilir.

Fare Hipokampusunda Kalın Dokular İçin Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışı Gösterildi

Öğrenin, mineralize dokuların yüksek verimli çoklu resim cryohistolojisini. Bu yarı otomatik platform, gözlemciden bağımsız ve tamamen dijital analiz sağlayarak kas-iskelet biyologları için maliyet etkin çözümler sunar.

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

Daha fazla video keşfet