Name: pH bağımlı aktivitenin tespiti Escherichia coli Chaperone HdeB İn Vitro ve İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin Escherichia coli HdeB şaperonunun pH bağımlı aktivitesini in vitro ve in vivo yöntemlerle karakterize etme tekniklerini. Bu yöntemler asit stresinde bakteri hayatta kalma mekanizmalarını anlamak için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Refakatçi deneyleri onu yararlı tavsiyeler Dr. Claudia Cremers teşekkür ederim. Ken Wan HdeB saflaştırma onun teknik yardım için kabul edilmektedir. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından sağlanan bir doktora sonrası araştırma bursu ile desteklenmektedir (JCAB için) Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve JCAB ve UJJ-UD Sağlık hibe RO1 GM102829 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. Ekspresyonu ve periplazmik HdeB saflaştırılması Not: HdeB E. ifade edildi polimiksin lizizi sonrasında periplazma plazmid pTrc- hdeB 10 ve saflaştırılmış barındıran E. coli hücreleri. <ol><li> E. bir gecede kültürü hazırlayın 200 ug / ml ampisilin (LB Amp) içeren 30 ml LB plazmidden pTrc- hdeB 10 barındıran E. coli hücreleri. 0.7 OD 600nm ulaşılana kadar LB Amp dört adet 1 L kültürlerinin aşılanması ve 37 ° C &#39;de büyümek ve 200 rpm&#39;de. Daha sonra, HdeB ifadesinin sağlanması ve 30 ° C&#39;ye kadar bir büyüme sıcaklığı azaltmak için 300 uM IPTG ilave edin. </li><li> 30 ° C&#39;de protein ekspresyonu 5 saat sonra, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 8000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 8000 x g&#39;de Hücreler tekrar A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCI, pH 7.5) ve santrifüj ml tampon 100 hücre pelletini yıkayın. </li><li> Daha sonra, tekrar süspansiyon80 hücre peleti mi, 1 mg / ml polimiksin sülfat içeren bir tampon. Dış membran etkin bozulması için, hafifçe 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile süspansiyon karıştırılmıştır. </li><li> sitoplazmik bölümünü ve hücre artıkları çıkarmak için 4 ° C&#39;de 15,000 x g&#39;de 20 dakika süre ile süspansiyon santrifüj. Bu ~ çözünür HdeB ihtiva eden 60 ml süpernatant sonuçlanır. </li><li> 6 kDa MW bir diyaliz membranı kullanılarak B tamponu (20 mM Tris / HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0) 150X birim karşı gece boyunca periplazmik özü ihtiva eden üst sıvıyı Dialyze cut-off. 3 kDa&#39;lık bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanarak 15 ml proteinleri konsantre edilir. 0.2 mikron gözenek filtre kullanarak protein çözüm Filtre. </li><li> 2.5 ml / dakika bir akış oranı ile 5 kolon hacmi tampon B ile dengelenmiş olan bir anyon değiştirme kromatografisi kolonuna (kolon hacmi 5 mi) üzerine protein uygulanır. Protein kolonuna yüklenir sonra, 10 dakika ile için tampon B ile sütun yıkama/ Dakika 2.5 ml&#39;lik bir akış oranı. 2.5 mL / dakika 6 bir akış oranı ile 50 dakika arasında bir zaman süresi içinde tampon B içinde 0.5 M NaCI, 0 ila bir doğrusal gradyan ile elüte HdeB. </li><li> % 15 SDS-PAGE kullanılarak HdeB ihtiva eden fraksiyonlar tanımlar. 5 ul 5x indirgenmiş SDS yükleme tamponu ile 20 ul örnek karıştırın. Yük 10 jel üzerine ul Tris-glisin tamponu (14.4 g / L glisin, 2.9 g / L Tris, 1 g / L sodyum dodesil sülfat, pH 8.3) &#39;de çalışır. Bromophenol bant jel (~ 45 dk) tabanına yakın göç kadar 150 V jel çalıştırın. </li><li> Havuz Tüm HdeB içeren fraksiyonlar, 4 L HdeB depolama tamponuna karşı gece boyunca 4 ° C&#39;de diyalize (50 mM Tris / HCI, 200 mM NaCI, pH 8.0) ve bir moleküler ağırlığa sahip santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 300 uM proteini konsantresi cut-off 3 kDa. Sönümleme katsayısı ε 280nm = 15595 M kullanılarak 280 nm&#39;de HdeB konsantrasyonunu belirlemek -1 cm -1. 100 ul hacimde ve flaş ücretsiz hazırlayınsıvı azotta ze. Not: HdeB en az 6 ay boyunca -70 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 2. Şaperon Aktivite Deneyi Malat Dehidrogenaz Unfolding Termal Kullanma (MDH) Not: termal farklı pH değerlerinde domuz mitokondriyal malat dehidrojenaz (MDH) açılma agregasyonu üzerinde saflaştırıldı HdeB etkisi aşağıda tarif edildiği gibi gözlenmiştir. Listelenen tüm protein konsantrasyonları monomer konsantrasyonunun bakın. <ol><li> MDH hazırlanması için, bir gece boyunca 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı 4 ° C&#39;de diyaliz MDH ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 100 um proteini konsantresi kDa. NOT: MDH amonyum sülfat çözeltisi olarak teslim edilir olarak MDH dikkatli diyaliz gereklidir. </li><li> birikimlerin çıkması için, 4 ° C&#39;de 20,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj protein. ε &lt;(280 nm&#39;de absorbans ile MDH konsantrasyonunu belirleyinalt&gt; 280 nm = 7,950 M-1 cm-1). MDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma. </li><li> Sıcaklık kontrollü numune tutucu ve bir karıştırıcı ile donatılmış bir floresan spektrofotometrede 1 ml kuartz küvet yerleştirin. Set λ eski / em 350 nm. </li><li> küvete ve ayarlamak için: (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde önceden ısıtılmış (43 ° C) tampon D (150 mM potasyum fosfat, 150 mM NaCl), uygun hacimleri ekleme 43 ° C&#39;ye kadar bir küvet taşıyıcısına sıcaklık. toplam hacmi 1000 ml. </li><li> 0.5 uM MDH ilave edildi tampon 12.5 uM HdeB (ya da seçenek olarak bir tampon kontrol HdeB depolama, aynı hacimde tampon) ekleyin. ışık saçılması izleme başlayın. MDH açılma yeterli olacak şekilde 360 ​​saniye boyunca reaksiyon inkübe edin. </li><li> HPO 4 2 M tamponsuz K 2 0,16-0,34 hacmi eklenerek 7 pH değerini arttırmak ve yeniden devamBaşka bir 440 sn için ışık saçılması Cording. </li><li> nötralizasyon sonra belli bir zaman noktasında hastabakıcı yokluğunda kaydedilen MDH agregasyon derecesini ayarlamak% 100 (burada MDH maksimal ışık saçılması gözlendi 500 saniye sonra). Her belirtilen pH değeri HdeB yokluğunda MDH ışık saçılması sinyaline HdeB etkinliğini normalleştirmek. </li></ol> Analitik Ultrasantrifügasyon tarafından HdeB-LDH Kompleks Oluşumunun 3. Algılama (AUC) Not: HdeB tek başına ya da termik olarak laktat dehidrojenaz (LDH) açılma ile kompleks içinde çökelme hızı deneyleri analitik ultrasantrifüj kullanılarak yapıldı. <ol><li> 4 L tampon C (50 mM potasyum fosfat, 50 mM NaCI, pH 7.5) karşı bir gece boyunca 4 ° C &#39;de LDH diyaliz, LDH hazırlanması ve 30 arasında bir molekül ağırlığı kesmesi olan santrifüj filtre birimleri kullanılarak, yaklaşık 200 uM protein yoğunlaştırmak kDa. NOT: LDH dikkatli diyaliz LD olarak gereklidirH, amonyum sülfat solüsyon olarak iletilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20,000 x g&#39;de 20 dakika süre ile agrega santrifüj LDH kaldırın. 280 nm&#39;de absorbans ile LDH konsantrasyonunu belirlemek (ε 280 nm = 43.680 M-1 cm-1). LDH 50 ul hacimde hazırlayın ve depolama için alikotları flaş dondurma. </li><li> 41 ° C&#39;de 15 dakika süre ile tampon D 30 uM HdeB varlığında ve yokluğunda (sırasıyla pH 4 ve 7), 3 uM LDH inkübe edin. Not: komple agregasyonda yükseltilmiş sıcaklıkta LDH inkübasyon ve HdeB hiç şaperon etkisi gözlemlenebilir. </li><li> Numuneler oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Sonra, standart sektörünü içeren hücrelerin içine yük numuneleri 1.2 cm uzunluğunda bulunan 2 kanallı centerpieces şeklinde. ultrasantrifüjdeki içine hücreleri yükleyin ve önceki çökelme, en az 1 saat boyunca 22 ° C&#39;ye kadar dengeye getirin. </li><li> Sıkma 22 ° C &#39;de numuneler, 12 saat süre ile, ilgili rotor 167.000 x g ve sed izlemekSürekli 280 nm&#39;de protein imentation. Daha önce gösterildiği gibi, her kanalın geçen ışık şiddeti Absorbans yerine ölçüldüğü zaman, sinyal gürültü oranı artırıldı. Bu, daha sonra veri uydurma kalitesini arttırır. </li><li> Sürekli c (ler) dağıtım modeli 17 kullanılarak, SEDFIT (sürüm 15.01b 2015 Aralık) veri analizi yapıyoruz. Nasıl SEDFIT kullanmayı anlatan bir öğretici referans 18 bulunabilir. <ol><li> 0,7 ME (Maksimum Entropi) regularization için güven seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> SEDNTERP 19 kullanılarak tampon yoğunluğunu yanı sıra viskoziteyi hesaplayın. , Toplu müşteri protein miktarını tahmin referans olarak pH 7 pH 4&#39;te tortulaşmış LDH integral karşılaştırmak için. NOT: sedimantasyon dağılımın Entegrasyon SEDFIT doğrudan yapılabilir. Sedimantasyon hızı verilerini analiz etmek için alternatif bir yazılım son inceleme 20 bulunabilir. &lt;/ Li&gt; </ol> HdeB Varlığında 4. İzleme MDH inaktivasyonu ve Yeniden Not: pH katlanmamış MDH yeniden katlanması ile saflaştınldı HdeB etkisi nötralizasyondan sonra MDH faaliyeti gözlenerek belirlenmiştir. <ol><li> ya da yokluğunda 25 uM HdeB mevcudiyetinde 37 ° C &#39;de, 1 saat boyunca (pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 ve pH 5.0 buradan) istenen pH değerlerinde tampon D 1 uM MDH inkübe edin. Daha sonra, 10 dakika boyunca 20 ° C&#39;ye kadar bir sıcaklık geçişi. Not: MDH 37 ° C&#39;den daha yüksek sıcaklıklarda kuluçkaya zaman Resim MDH yeniden katlama da HdeB mevcudiyetinde gözlenmiştir. </li><li> Asit denatüre MDH yeniden katlanması başlatma 0.5 M sodyum fosfat, pH 8.0 0,13-0,42 hacminin ilavesiyle pH 7&#39;ye örnekleri etkisiz hale getirir. </li><li> 20 ° C &#39;de 2 saat süre ile inkübasyondan sonra, 340 nm 9&#39;da NADH düşüş gözlenerek MDH aktivitesi belirlenir. NOT: MDH L-malat içine oksaloasetat ve NADH bağımlı bir azalma katalize eder. <ol&gt; <li> 950 deney tamponu ul (50 mM sodyum fosfat, pH 8.0, 1 mM oksaloasetat ve 150 uM NADH) ile inkübasyon reaksiyon 50 ul karıştırın. Not: Deney tamponunda MDH nihai konsantrasyon 44 nM olması gerekir. </li><li> 20 ° C olarak ayarlanmış bir Peltier sıcaklık kontrol bloğu ile donatılmış bir spektrofotometre kullanılarak absorbans değişikliği, izleyin. </li><li> pH 7.0 tutuldu 44 nM yerli MDH için MDH aktivitesi göreli bildirin. </li></ol></li></ol> E. tarihinde HdeB aşırı ifadesinin 5. Etkisi Asit Stres altında coli Survival NOT: E. E. coli MG1655 genomik DNA yayınlanmış bir protokol 21 kullanılarak izole edilmiştir. <ol><li> E. hdeB yükseltin BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT ve hdeB - - EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. PCR primerleri hdeB kullanarak coli MG1655 </li><li> Aşağıdaki şekilde 50 ul PCR reaksiyonu başlatacak: 10 ul 5x polimeraz tamponu, 200 uM dNTP, 0.5 uM primer JUD2, 0.5 uM primer JUD5, 150 ng genomik DNA, MG1655, 0.5 ul DNA polimeraz, GKD 2 O 50 ul ekle. </li><li> Şöyle hdeB amplifikasyonunu yapmak: Aşama 1: 95 ° C, 1 döngü, 5 dakika; Adım 2: 95 ° C&#39;de 30 saniye, 55 ° C&#39;de 30 saniye, 72 ° C, 40 döngü 30 saniye; Aşama 3: 72 ° C&#39;de 10 dakika. </li><li> Sınırlama mevkisi klonlama için, standart yöntemler kullanılarak plazmid pBAD18 EcoR I ve BamH I bölgeleri içine PCR fragmanı elde Klon. üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti kullanılarak plazmid saflaştırılır. Sıralama 10 ile sonuçlanan plazmid doğrulayın. </li><li> HdeB veya zorlanma BB7224 içine boş vektör kontrolü pBAD18 (Δ rpoH) (genotip ifade plazmid Dönüşümü: F - λ - e14 - [araD139] B / r [6 (argF-lac) 169 flhD5301 Δ (FRUK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-fimE) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: TN 10 (Tc S) suhX401 deoC1 Arad + rpoH :: kan +; 16) kimyasal yetkili hücreleri kullanılarak. NOT: Bu gerginlik ısıya duyarlı olduğunu. </li><li> 45 saniye 42 ° C&#39;de ısı şoku ve önceki kaplama için Sonra, 30 ° C ve 200 rpm&#39;de inkübe hücreleri. Pozitif klonların tek bir koloni çizgi-çıkışları gerçekleştirin ve gece boyunca 30 ° C kuluçkaya yatmaktadır. 50 mi LB Amp bir gece boyunca kültür Hazırlama 200 rpm ve 30 ° C &#39;de hücrelerin kültive edilmesi. </li><li> Bir gecelik kültürler 25 mi LB Amp 40. kat seyreltilir ve HdeB protein ifadesini uyarmak üzere 30 ° C ve bir OD 600 Nm 200 rpm = 1.0, 0.5,% arabinoz (ARA) mevcudiyetinde bakterilerin yetiştirilmesi. </li><li> pH değişim deneyler için, LB kullanmakAmp + Ara 0.5 OD 600Nm hücreleri sulandırmak ve (burada: pH 2.0, pH 3.0 ve pH 4.0) ilgili pH değerlerine ayarlamak için 5 M HCl uygun hacimleri ekleyerek. </li><li> Belirtilen zaman noktalarında (pH 3, 2.5 dakika; pH 2, 1 dakika, pH 4, 30 dakika) sonra, 5 M NaOH uygun hacimleri ilave edilerek kültürleri nötralize eder. </li><li> OD ölçümleri kullanılarak, 30 ° C&#39;de 12 saat süre ile sıvı kültürde etkisiz hale kültürlerin büyümesini izlemek. </li></ol>

<ol><li>Smith, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Gastric+Acid+in+Preventing+Foodborne+Disease+and+How+Bacteria+Overcome+Acid+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions.</a> J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).</li>
<li>Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+mechanisms+for+acid+resistance+in+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria.</a> Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).</li>
<li>Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+bacterial+outer+membrane+proteins%3A+barrels+in+a+nutshell%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell.</a> Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).</li>
<li>Reichmann, D., Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+out+of+Disorder%3A+Working+Cycle+of+an+Intrinsically+Unfolded+Chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone.</a> Cell. 148 (5), 947-957 (2012).</li>
<li>Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+disorder+in+chaperone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Conditional disorder in chaperone action.</a> Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).</li>
<li>Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+an+acid-activated+chaperone+allows+promiscuous+substrate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).</li>
<li>Hong, W., Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+Protein+HdeA+Exhibits+Chaperone-like+Activity+Exclusively+within+Stomach+pH+Range+by+Transforming+into+Disordered+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation.</a> J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).</li>
<li>Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+pH-Dependent+Dissociation+of+HdeA+Dimers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers.</a> J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).</li>
<li>Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+refolding+by+pH-triggered+chaperone+binding+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).</li>
<li>Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HdeB+Functions+as+an+Acid-protective+Chaperone+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria.</a> J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).</li>
<li>Waterman, S. R., Small, P. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sigmas-dependent+genes+associated+with+the+stationary-phase+acid-resistance+phenotype+of+Shigella+flexneri%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri.</a> Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).</li>
<li>Mucacic, M., Baneyx, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+Hsp31+Contributes+to+Acid+Resistance+in+Stationary-Phase+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).</li>
<li>Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Chaperone-assisted+Refolding+of+Citrate+Synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase.</a> J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).</li>
<li>Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+Activity+with+a+Redox+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaperone Activity with a Redox Switch.</a> Cell. 96 (3), 341-352 (1999).</li>
<li>Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Molecular%2C+Modeling%2C+and+Systems+Approaches+for+an+Understanding+of+the+Escherichia+coli+Heat+Shock+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).</li>
<li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Distribution+Analysis+of+Macromolecules+by+Sedimentation+Velocity+Ultracentrifugation+and+Lamm+Equation+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling.</a> Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).</li>
<li>Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm">http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm</a> (2016).</li>
<li>Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page">http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</a> (2012).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol%3AChloroform%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).</li>
<li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+activation+by+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chaperone activation by unfolding.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).</li>
<li>Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+the+isolation+and+characterization+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Express+Purif%22%5BJournal%5D)">Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones.</a> Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).</li>
<li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog%2C+Hsp40%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li>
<li>Quan, S., Koldewey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+designed+to+stabilize+proteins+uncovers+a+chaperone+called+Spy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).</li>
<li>Gray, M. J., Wholey, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+Is+a+Primordial+Chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate Is a Primordial Chaperone.</a> Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

<html> aktivasyonu ve HdeB bir şaperon fonksiyonu mekanizmasını araştırmak için, HdeB büyük miktarlarda ifade edilmiş ve saflaştırılmış gerekir. sentezleme vektör sistemleri bir dizi bu çalışmada kullanılmıştır, her ikisi de pTrc ya pBAD vektörleri de dahil olmak üzere, bir hedef proteinin yüksek seviyeleri üretimi için kullanılabilir. Destekleyiciler E. için kolayca erişilebilir E. coli RNA polimerazı ve bir E. HdeB böylece güçlü yukarı regüle getirilmesine olanak tanıyan ifade coli s...

Mikrobiyal patojenler asit kaynaklı protein elinde tutmasına koşulları tecrübe edildiği bir ortak doğal çevre olan asidik pH gıda kaynaklı patojenler 1 karşı etkili bir bariyer görevi görür memeli mide (pH aralığı 1-4) &#39;dir. Amino asit yan zinciri protonasyon nedeniyle protein açılması ve agregasyonu, biyolojik süreçleri, zarar hücresel yapıları etkileyen ve en sonunda hücre ölümüne 1,2 neden olur. Bakteriyel periplazmaya pH nedeniyle gözenekli dış zar boyunca proton serbest difüzyonuna neredeyse aynı anda, çevre pH dengeye için, Gram-negatif bakterilerin periplazmik ve iç membran proteinleri asit, gerilimli şartlar altında 3 en hassas hücre bileşenleri bulunmaktadır. Hızlı asit aracılı olduğu hasarlara karşı gösterdikleri periplazmik Proteomun korumak için, Gram-negatif bakteriler asit ile aktive edilmiş periplazmik şaperonlar HdeA ve HdeB kullanmaktadır. HdeA bir şartlı bozukluğu şaperonudur <sup&gt; 4,5: nötr pH&#39;da, HdeA katlanmış, şaperon hareketsiz dimer olarak mevcuttur. PH 3 altında bir pH kayması sırasında, HdeA en şaperon fonksiyonu hızla 6,7 etkinleştirilir. HdeA aktivasyonu monomerlerin 6-8 açılımı derin yapısal monomerlerin içine ayrışma dahil değişiklikleri, ve kısmi gerektirir. Bu işlemden sonra, HdeA asidik koşullar altında açığa proteinlerine bağlanır. Bu etkili bir düşük pH değerlerinde inkübasyon sırasında hem de pH nötrleştirme sırasında hem agregasyonunu engeller. PH 7.0&#39;a dönüş üzerine, HdeA bir ATP-bağımsız bir şekilde, istemci proteinlerinin yeniden katlanmasını kolaylaştırır ve dimerik, refakat-olmayan yapıya 9 geri dönüştürür. Benzer şekilde, benzer şaperon HdeB da refakat hareketsiz pH 7.0 ile kullanılmıştır. HdeA aksine, HdeB en şaperon aktivitesi, pH 4.0 HdeB hâlâ büyük oranda katlanır ve 10 dimerik olduğu koşullar altında, görünür maksimuma ulaşır. Ayrıca, daha fazla pH gevşeyebilir düşürücüHdeB inaktivasyonu es. Bu sonuçlar, büyük bir homoloji rağmen HdeA ve HdeB bunları koruyucu şaperon fonksiyonu ile geniş bir pH aralığı kapsayan sağlayan fonksiyonel bir aktivasyon tarzı açısından farklılık göstermektedir. E. asit direnci implike edilmiştir Diğer bir şaperon E. coli nötr koşullar restore kadar gelişeceğini istemci proteinleri stabilize görünen sitoplazmik Hsp31 vardır. Hsp31 en müdahale durumu net olarak, bununla birlikte, 12 anlaşılmaz kalmıştır. Salmonella gibi diğer enteropatojenik bakteriler hdeAB operonunu eksikliği göz önüne alındığında, diğer henüz kimliği belirlenemeyen periplazmik şaperonlar bu bakterilerin 11 asit direnci dahil olduğunu var olabilir kuvvetle muhtemeldir. Burada yer alan protokol vivo 10 in vitro ve in HdeB pH bağımlı şaperon etkinliğini izlemek için izin diğer şaperonlar araştırmak için uygulanabilirHsp31 gibi. Seçenek olarak ise, hdeAB ifadesini kontrol transkripsiyon faktörleri karmaşık ağ potansiyel in vivo gerilme testi ile araştırılabilir. In vivo olarak, proteinlerin şaperon işlevini karakterize etmek için, farklı deney düzenekleri uygulanabilmektedir. Birinci yol proteinin açılımı stres koşullar uygulanır ve fenotipik iki ilgili geni aşırı ifade eden ya da genin bir silme taşıyan mutant türünü nitelendirilmesidir. Proteomik çalışmalar chaperone mevcut olduğu zaman, gerilimli şartlar altında, toplam artık bu proteinleri belirlemek için yapılabilir, ya da belirli bir enzimin bir şaperon etkisi Enzimatik 14-16 kullanılarak stres şartlarında belirlenebilir. Bu çalışmada, tüm büyük E. ekspresyonunu kontrol RpoH ısı şoku sigma faktörü 32. yoksun bir rpoH delesyon suşu içinde HdeB aşın tercih E. coli chaperones ve silme sens arttırdığı bilinmektedirprotein 15 açılımı neden olan çevresel stres koşullarına iTivity. HdeB in vivo şaperon aktivitesi Δ rpoH soyunun pH duyarlılığı bastırmak için kabiliyetini izleyerek tespit edilmiştir. Özet olarak, burada sunulan protokoller in vitro hem de in vivo bağlamında bir asit ile aktive edilmiş cinsten aktivitesinin karakterize edilmesi için hızlı ve basit bir yaklaşım sağlar.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta E. coli hücreleri</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Et suyu karışımı, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Polimiksin B sülfat ve nbsp;</td><td>ICN Biyomedikal A.Ş.</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0.2 ve mikro; m gözenekli steril Şırınga Filtresi</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, %15</td> <td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malat dehidrojenaz (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat (Monobazik)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat (Dibazik)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 floresan spektrofotometresi</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oksaloasetat</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Laktat dehidrojenaz (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I analitik Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render& wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764//0/1///0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr><tr><td>Merkez parçası, 12 mm, Epon Kömür dolgulu</td><td>Beckman Coulter</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, Analitik, 8'li</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kiti</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>plazmit saflaştırması için kullanılır (Protokol 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinoz</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Hücre küveti</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonükleotidler</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion Yüksek Kaliteli DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP seti</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL</td><td>Milipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter 393127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 spektrofotometre</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 Diyaliz Membranı MWCO: 6 kDa</td><td>Spektrum Laboratuvarları</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Santrifüj Filtre Üniteleri 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96 Kuyulu Termal Döngüleyici</td><td>Termo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

ph bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; escherichia coli</em&gt; chaperone hdeb<em&gt; İn vitro</em&gt; ve<em&gt; İn vivo</em

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bakteriler sıklıkla pH değişiklikleri, sıcaklık, redoks durumu, ışığa maruz kalma veya mekanik güç gibi çevresel değişikliklere maruz kalır. Bu durumların çoğu hücrede açılımı proteini neden organizmanın sağkalım üzerine olumsuz etkisi vardır. olmayan, stres-özel moleküler şaperonlar bir grup, bu stres koşullarında hayatta kalması gerekli roller oynadığı gösterilmiştir. Tamamen katlanmış ve hastabakıcı-inaktif stres önce, bu proteinler hızla açılmak ve spesifik stres koşulları altında hastabakıcı aktif hale iken. Bir kez bu koşullu düzensiz şaperonlar farklı toplama eğilimli proteinin çok sayıda bağlanan, aktive edilmiş, bunların birarada toplanmasını önlemek ve, ya doğrudan ya da dolaylı olarak non-stres koşullarına dönüş üzerine yeniden katlama proteini kolaylaştırır. onların aktivasyonu ve müşteri tanıma mekanizması hakkında daha ayrıntılı bir anlayış kazanıyor için birincil yaklaşım arınma ve subsequen içerirnitro şaperon deneyler kullanılarak bu proteinlerin t karakterizasyonu. In vivo stres deneyleri takip bağımsız in vitro sonuçlar elde onaylamak için kesinlikle gereklidir. Bu protokol, E. şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlere tarif E. coli HdeB bir asit aktive şaperon. Işık saçılım ölçümleri, in vitro olarak, kurulu bir modeli istemci protein, MDH asit ile indüklenen, toplanmayı önlemek için HdeB kapasitesi için uygun bir okuma olarak kullanılmıştır. Analitik Ultrasantrifügasyon deneyleri non-stres koşullarına döndükten sonra müşteri proteinlerin kaderi içine ışık tutacak, HdeB ve müşteri protein LDH arasındaki karmaşık oluşumunu ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Müşteri proteinlerin enzimatik aktivite deneyleri pH kaynaklı müşteri inaktivasyonu ve reaktivasyon üzerinde HdeB etkilerini izlemek için yapılmıştır. Son olarak, hayatta kalma çalışmaları için kullanılmıştır monitoin vivo HdeB en şaperon fonksiyonunun etkisini r.

HdeA ve HdeB E. homologdur asit stres koşulları 10 karşı periplazmik proteinlerin korumak için bilinen E. coli proteinleri. Çalışmalarımız bir asit moleküler koruyucuya aktif olarak HdeA benzer HdeB da işlev ortaya koydu. Bununla birlikte, potansiyel olarak bakteri ama HdeA 6,9,10,22 optimum pH değeri önemli ölçüde daha yüksek olan bir pH değerinde HdeA, HdeB işlevleri tersine. In vitro HdeB en şaperon aktivitesinin pH optimumu araştırmak ...

Bu çalışma, asidik pH koşulları altında E. coli HdeB bir şaperon aktivitesinin karakterize edilmesi için, biyofiziksel, biyokimyasal ve moleküler teknikler tarif eder. Bu yöntemler, örneğin başarılı bir şekilde HdeA gibi diğer asit koruma şaperonlar için uygulanmış ve diğer şaperonlar ve stres koşullarında çalışmak için modifiye edilebilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Bu in vivo ve in vitro şaperon deneylerinin genel amacı, Escherichia coli şaperonu HdeB'nin asidik pH koşulları altındaki pH'a bağımlı aktivitesini karakterize etmektir. Asit ile aktive olan şaperonların tek bir görevi vardır; proteinleri asidin tetiklediği protein açılmasına ve bozunmasına karşı korumaları gerekir. Bu işlev, bağırsakları başarıyla kolonize etmek istediklerinde midenin asidik ortamında hayatta kalmak zorunda olan enterik bakteriler için özellikle önemlidir.Burada sunduğumuz yöntemler, asit ile aktive olan şaperonları tanımlamanıza, karakterize etmenize ve aktivasyonlarına yol açan pH koşullarını belirlemenize olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, aktivasyon mekanizmasını çözmenize yardımcı olacak şekilde HdeB gibi şaperonların in vitro ve in vivo olarak nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntemler, HDA gibi diğer asit koruyucu şaperonlar için başarıyla uygulanmıştır ve diğer şaperonlarla ve/veya stres koşullarıyla çalışacak şekilde daha da modifiye edilebilir.Saflaştırılmış HdeB'nin, farklı pH değerlerinde termal olarak açılan porcine mitokondriyal malat dehidrojenazın agregasyonu üzerindeki etkisi izlenir. Diyalize ed

detection-ph-dependent-activity-escherichia-coli-chaperone-hdeb-vitro

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Kaynak: Dahl, J. ve ark. Escherichia coli Chaperone HdeB'nin pH-Bağımlı Aktivitesinin Tespiti In Vitro ve In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, asit ve ısı stresi altında bir substrat proteininde çaperon aktivitesini değerlendirmek için floresans spektrofotometre tabanlı bir testi göstermektedir. Işık saçılması yoluyla substratın açılması ve toplanmasının izlenmesi adımlarını, eşlikçi ile ve olmadan koşulları karşılaştırarak açıklar.

Bir Model Proteinin Termal Açılması Yoluyla Bakteriyel Şaperon Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Kaynak: Dahl, J. ve diğerleri. Escherichia coli Chaperone HdeB'nin pH-Bağımlı Aktivitesinin Tespiti In Vitro ve In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, asit stresi sırasında asitle aktive edilmiş bir şaperonun koruyucu etkisini değerlendirmek için rekombinant E. coli kültürlerinin kullanımını göstermektedir. Bakteriyel büyüme izleme, kontrol koşullarına kıyasla şaperon eksprese eden kültürlerde daha iyi hayatta kalma oranını ortaya koymakta olup, stres koşullarında protein stabilizasyonunda...

Asit Stresi Altında E. coli'de Asitle Aktive Edilmiş Bir Şaperonun Koruyucu Rolünün Değerlendirilmesi

Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

Bir fare modeli enterohemorrhagic bioluminescence etiketli bakteri kullanarak E. coli (EHEC) kolonizasyon için detaylı bir protokol sunulmuştur. Kollarındaki bu bakteriler tarafından bir non-invaziv görüntüleme sistemi içinde canlı hayvan vivo içinde tespiti geçerli anlayışımız EHEC kolonizasyon ilerletebilirsiniz.

Non-invaziv Vivo içinde Bioluminescence sistemi tarafından fare konak Enterohemorrhagic Escherichia Coli kolonizasyon algılama

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Bu protokol, ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70'in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.

Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

Çeşitli uygulamalarda uygulama için gelişmiş enzim stabilitesi sağlayan enzim paketli dış zar veziküllerinin (OMV) üretimi, saflaştırılması ve kullanımı için bir protokol sunulmaktadır.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Öğrenin Escherichia coli HdeB şaperonunun pH bağımlı aktivitesini in vitro ve in vivo yöntemlerle karakterize etme tekniklerini. Bu yöntemler asit stresinde bakteri hayatta kalma mekanizmalarını anlamak için uygulanabilir.

pH bağımlı aktivitenin tespiti

Daha fazla video keşfet