pH bağımlı aktivitenin tespiti Escherichia coli Chaperone HdeB İn Vitro ve İn Vivo

Bu in vivo ve in vitro şaperon tahlillerinin genel amacı, asidik pH koşulları altında Escherichia coli şaperon HdeB'nin pH'a bağlı aktivitesini karakterize etmektir. Asitle aktive edilen şaperonların yapması gereken tek bir iş vardır, proteinleri asit kaynaklı protein açılımına ve bozulmasına karşı korumaları gerekir. Bu işlev, bağırsakları başarılı bir şekilde kolonize etmek istiyorlarsa midenin asidik ortamında hayatta kalmak zorunda olan enterik bakteriler için özellikle önemlidir.

Burada sunduğumuz yöntemler, asitle aktive olan şaperonları tanımlamanıza ve karakterize etmenize ve aktivasyonlarına yol açan pH koşullarını tanımlamanıza olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, in vitro ve in vivo olarak HdeB gibi şaperonların nasıl karakterize edileceğini iyi anlamalısınız, bu da aktivasyon mekanizmasını deşifre etmenize yardımcı olur. Bu yöntemler, HDA gibi diğer asit koruyucu şaperonlar için başarıyla uygulanmıştır ve diğer şaperonlarla ve / veya stres koşullarıyla çalışmak için daha fazla değiştirilebilir.

Saflaştırılmış HdeB'nin farklı pH değerlerinde termal olarak açılan domuz mitokondriyal malat dehidrojenazın agregasyonu üzerindeki etkisi izlenir. Dört litre tampon C'ye karşı gece boyunca dört santigrat derecede diyalize edilmiş MDH.Daha sonra, moleküler ağırlığı 30 kilodalton olan santrifüj filtre üniteleri kullanarak proteini yaklaşık 100 mikromolara konsantre edin. Agregaları çıkarmak için, proteini dört santigrat derecede 20.000 kez G'de 20 dakika santrifüjleyin.

MDH konsantrasyonunu 280 nanomolar'da absorbans ile belirleyin. Daha sonra 50 mikro litrelik MDH alikotları hazırlayın ve alikotları saklamak için hızlı dondurun. Bir mililitrelik bir kuvars küveti, sıcaklık kontrollü numune tutucular ve karıştırıcılarla donatılmış bir floresan spektrofotometreye yerleştirin.

Uyarma ve kabul dalga boyunu 350 nanometreye ayarlayın. İstenilen pH değerlerinde uygun hacimlerde önceden ısıtılmış tampon D'yi küvete ekleyin. Toplam hacim 1.000 mikrolitredir.

Küvet tutucusundaki sıcaklığı 43 santigrat dereceye ayarlayın. Tampona 12.5 mikromolar HdeB ekleyin, ardından 0.5 mikromolar MDH ekleyin. Işık saçılımını izlemeye başlayın.

MDH'nin yeterli şekilde açılmasını sağlamak için reaksiyonu 360 saniye inkübe edin. 0.16 ila 0.34 hacim iki molar tamponsuz dipotasyum fosfat ekleyerek pH'ı yediye yükseltin ve 440 saniye daha ışık saçılımını kaydetmeye devam edin. Verileri metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin.

HdeB eksprese eden plazmidi veya MD vektör kontrolünü, PBAD 18'i, kimyasal olarak yetkin hücreler kullanarak BB7224 Delta RPOH suşuna dönüştürün. Bu suş sıcaklığa duyarlıdır ve 30 santigrat derecede yetiştirilmelidir. 42 santigrat derecede 45 saniyelik ısı şokundan sonra ve kaplamadan önce, hücreleri 30 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin.

Pozitif klonların tek koloni çizgilerini gerçekleştirin ve gece boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ampisilin ile 50 mililitre LB'de bir gece kültürü hazırlayın ve hücreleri 200 RPM ve 30 santigrat derecede yetiştirin. Gece boyunca seyreltin kültürler 40 kat Ampisilin ile 25 mililitre LB'ye.

HDEB protein ekspresyonunu indüklemek için bakterileri 30 santigrat derece ve 200 RPM'de %0.5 arabinoz varlığında 600 nanometrede optik yoğunluğa veya OD 600'ü 1.0'a eşit olarak büyütün. PH kayma deneyleri için, hücreleri 0.5'lik bir OD 600'e seyreltmek için Ampisilin ve arabinoz ile LB kullanın. Uygun hacimlerde beş molar hidroklorik asit ekleyerek ilgili pH değerlerine ayarlayın.

Belirtilen zaman noktalarından sonra, uygun hacimlerde beş molar sodyum hidroksit ekleyerek kültürleri nötralize edin. OD ölçümlerini kullanarak nötralize edilmiş kültürlerin ve sıvı kültürün büyümesini 30 santigrat derecede 12 saat boyunca izleyin. HdeB'nin şaperon aktivitesinin pH optimumunu in vitro olarak araştırmak için, doğal MDH, HdeB'nin varlığında veya yokluğunda veya HdeB'de belirtilen pH'ın önceden ısıtılmış tamponuna seyreltildi.

360 saniyelik inkübasyonun ardından, MDH'nin 43 santigrat derecede toplanması nötralizasyon yoluyla tetiklendi. HdeB varlığında, pH dörtten nötralizasyon üzerine ışık saçılma sinyali önemli ölçüde azalır, bu da HdeB'nin MDH'nin toplanmasını önlediğini gösterir. Agregasyon ölçümleri, sıcaklık veya tampon içeriğindeki değişikliklere karşı çok hassastır.

Yanlış pozitif sonuçları ortadan kaldırmak için, şaperon depolama arabelleğinin istemci toplaması üzerindeki etkisi araştırıldı. HdeB depolama arabelleğinin MDH toplaması üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. HdeB'nin in vivo etkilerini araştırmak için, sıcaklığa duyarlı RPOH delesyon suşu kullanılarak pH'a bağlı sağkalım testleri yapıldı.

Bu suş çoğu şaperondan yoksundur ve bu nedenle yüksek sıcaklığa, düşük pH'a veya oksitlenmiş strese karşı daha hassastır. Nötr pH koşulları altında HdeB'nin aşırı ekspresyonu, boş vektör olan PBAD 18'i barındıran kontrol suşuna nispeten iyi büyüyen suşun büyüme hızı üzerinde hiçbir etki göstermedi. Buna karşılık, pH üç veya pH dört muamelesi üzerine büyümeye devam etme yeteneklerinde belirgin farklılıklar bulundu ve HdeB'nin aşırı eksprese edilen suşu, kontrol suşuna kıyasla düşük pH işleminden tekrarlanabilir şekilde iyileştirilmiş iyileşme gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, saflaştırma üç gün içinde, in vitro saçılma testi bir günde ve in vivo sağkalım testleri uygun şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. Bu deneyleri yaparken, deney tasarımınızı hem istemci proteinlerin türü, hem konsantrasyonları hem de kullandığınız tampon koşulları açısından dikkatlice değerlendirdiğinizden emin olun. Bu tekniğin temel avantajı, in vivo bağlamda şaperon aktivasyon mekanizması ve etkileri hakkında daha ayrıntılı bir anlayış kazanmaya yardımcı olmasıdır.

Ve asit koruyucu bir şaperonun optimum pH'ını incelemenin oldukça zor olabileceğini unutmayın. Bunun nedeni, kullandığınız istemci proteinin kümelenme davranışının da muhtemelen pH ile birlikte değişecek olmasıdır. Bu nedenle, hem şaperon hem de müşteri proteini için uygun tampon sistemleri seçtiğinizden emin olun.

Bu prosedürü takiben, SCS sayfası tarafından spin down testleri gibi diğer yöntemler, istemci agregasyonunun otomatik olarak ölçülmüş şaperon aracılı baskılanmasında gerçekleştirilebilir.