Tümör metastaz üzerinde Hipoksi Test Etkisinin Vivo Modeli

Bu el yazması, tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkilerinin doğrudan test edilmesine ve etki mekanizmalarının deşifre edilmesine izin veren bir hayvan modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Burada açıklanan deneyler Ewing sarkomuna odaklansa da, benzer bir yaklaşım diğer tümör tiplerine de uygulanabilir.

Bu prosedürün genel amacı, bir hayvan modeli kullanarak tümör hipoksisinin metastaz üzerindeki etkisini doğrudan test etmektir. Bu yöntem, hipoksinin prometastatik etkilerinin altında yatan mekanizmayı ve tümör yayılımını önlemek için potansiyel yeni terapötik hedefleri belirlemeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin iki avantajı, tümör hipoksisinin etkilerini in vivo olarak test etme ve kanser hastalarında meydana gelen metastaz ve hücre etkileşimlerinin adımlarını özetleme yeteneğidir.

Modelimizde, tümör hipoksisi, farenin tümör taşıyan hilusuna kan sağlayan femoral arterin ligasyonu ile oluşturulur. Müteakip arka bacak amputasyonu, tekrarlayan primer tümör büyümesi ile ilişkili hareketliliği önleyerek metastaz oluşmasına izin verir. Prosedürü göstermek için Jason Tilan, Sung-Kyeok Hung ve Georgetown'daki Klinik Öncesi Görüntüleme Araştırma Laboratuvarı'nın eş direktörü Dr.Olga Rodriguez olacak.

Ewing sarkom hücrelerini enjekte etmek için, dört ila altı haftalık bir dişi SCID Bej fareyi nazikçe kısıtlayın, alt arka ekstremitenin medial tarafını ortaya çıkarmak için sol bacağını dördüncü ve beşinci parmaklar arasında stabilize edin. 28 gauge 1/2 "inçlik bir iğneyi yaklaşık 30-45 derecelik bir açıyla gastroknemius kasına tibial tepeye doğru öne doğru sokun. İğne ucu tepeye temas ettiğinde, iğneyi hafifçe geri çekin ve iğneyi çekmeye devam ederken 0.1 mililitre Ewing sarkom hücresini yavaşça enjekte edin.

Ardından, tümör boyutu istenen hacme ulaşana kadar medial/lateral ve ön/arka uzunluklar aracılığıyla baldır boyutunu günlük olarak ölçmek için dijital kumpaslar kullanın. Ligasyona başlamadan önce, deri altına analjezik bir ajan enjekte edin ve ardından hipoksi doğrulaması için Hipoksiprobe-1 uygulayın. Daha sonra, anestezi uygulanmış fareyi çalışma yüzeyindeki bir ısıtma pedine yerleştirin ve hayvanın gözlerine merhem sürün.

Ardından, arka ayağı orta hattan yaklaşık 45 derece uzakta bir bant parçasıyla uzatın ve sabitleyin. Cerrahi bölgeyi tüy dökücü kremle epilasyon yapın, kremi 10 saniye sonra etanol hazırlama pedi ile çıkarın ve açıkta kalan cildi art arda üç adet %10 povidon-iyot ve etanol mendil ile dezenfekte edin. Fareyi stereo mikroskop altına aktarın ve deride uyluğun ortasından kasık bölgesine doğru 1 santimetrelik bir kesi yapın.

Tuzlu suyla nemlendirilmiş ince pamuklu çubuklar kullanarak, uyluk kasını çevreleyen deri altı yağ dokusunu nazikçe fırçalayın. Ardından, altta yatan femoral arteri ortaya çıkarmak için deri altı yağ dokusunu dikkatlice inceleyin. Orta-üst adduktor kasının damar sistemini ortaya çıkarmak için yarayı ve cerrahi alanı stabilize edin ve nörovasküler demeti ortaya çıkarmak için membranöz femur kılıfını nazikçe delmek için ince forseps kullanın.

Temiz bir ince forseps seti kullanarak, femoral arteri, kasık ligameninin distalinde, kasıklara yakın proksimal konumda femoral ven ve sinirden diseksiyon yapın ve ayırın. Daha sonra, lateral sirkumfleks femoral arterin brakına distal femoral arterin altından 6-0 ipek sütür geçirin ve femoral arteri çift düğümle kapatın. Kesi 6-0 polipropilen sütürlerle kapatın ve sıvı dengesi tedavisi için deri altına 0,5 mililitre ılık salin enjekte edin.

Daha sonra hayvanı, tamamen iyileşene kadar izleme ile kurtarma kafesinde örtülü ılık bir pedin üzerine yerleştirin. Uygun deneysel zaman noktasında, hayvanı nazikçe kısıtlayın ve tümör taşıyan uzuvdan distal tibiadan pelvik bölgeye kadar kılları tıraş etmek için makas kullanın. Analjezik ajanı enjekte edin ve anestezi uygulanmış hayvanı sağ lateral yaslanmış pozisyonda, bir ısıtma pedi üzerine yerleştirilmiş steril bir örtü üzerine yerleştirin.

Gözlere merhem sürün ve cerrahi bölgeyi gösterildiği gibi dezenfekte edin. Daha sonra, hayvanın üzerine steril bir örtü yerleştirin ve orta femoral çevresel bir cilt kesisi yapın, ardından künt diseksiyon ve cildin proksimal geri çekilmesi izleyin. Bacağın medyan tarafında medial femoral nörovasküler pedikülü ortaya çıkarın.

Daha sonra kasık bağının yakınında bağlanmak için 4-0 poliglaktin 910 kaplı emilebilir bir sütür kullanın. Makas kullanarak, kasın orta femoral transeksiyonunu ve ardından yumuşak dokunun koksofemoral ekleme künt diseksiyonunu gerçekleştirin. Bir kemik kesici kullanarak, kanamayı en aza indirmek için orta femoral bir osteotomi ve ardından emilebilir bir jelatin sünger ile osteotomi bölgesine hafif bir baskı uygulayın.

Daha sonra üstteki cildi kapatmak için cerrahi yara klipsleri kullanın ve sıvı dengesi tedavisi için deri altına 0,5 mililitre ılık salin enjekte edin. Haftada en az iki kez, tümör enjekte edilen hayvanların baş, boyun ve koltuk altı bölgelerini ve kontralateral arka bacaklarını dikkatlice palpe edin. Abdominal distansiyon yoluyla iç organ metastazlarını ve işaret parmağı ile hafif ksifoid proses basıncı yoluyla akciğer metastazlarının varlığını kontrol edin.

İç organ metastazını uygun deneysel zaman noktalarında MRG ile değerlendirmek için, fareyi fizyolojik vücut sıcaklığında tutmak için ılık su sirkülasyon sistemine bağlı pompayı açın. Ardından, solunum sensörünü hayvanın üst karnı ile temas edecek şekilde yerleştirin ve BIOPAC Systems solunum izleme ekipmanını açın. Anestezi uygulanmış fareyi özel olarak tasarlanmış bir fare stereotaksik tutucusuna yerleştirin ve hayvanın gözlerine oftalmik merhem sürün.

Hareket artefaktlarını ve gürültüyü azaltmak için, veri toplamayı solunum döngüsü ile senkronize etmek için MRI protokolündeki geçit seçeneğini seçin. Ardından, metastazları görüntülemek için iki boyutlu T2 ağırlıklı bir anatomik görüntüleme dizisi çalıştırın. Amputasyon, insizyon veya nekropsi sonrası primer tümör hücre kültürü için, ilgilenilen her doku örneğinden iki ila üç adet 2-3 milimetrelik ıslak parlak pembe-kırmızı canlı tümör dokusu segmenti toplayın ve izole edilen segmentleri taze birincil kültür ortamı içeren 6 santimetrelik hücre kültürü plakalarına yerleştirin.

Daha sonra, uygun hücresel büyüme periyodu için dokuları bir hücre kültürü inkübatörüne aktarın. Ewing sarkom hücrelerinin gastroknemius kasına enjekte edilmesinin ardından, primer tümörlerin 250 milimetreküp buzağı boyutuna kadar büyümesine izin verilir. Bu hacimdeki kontrol tümörleri, Hipoksiprob-1 boyaması ile belirlendiği gibi, yalnızca vaskülatürden uzak hücrelerde nispeten düşük bir endojen hipoksi seviyesi sergiler.

Buna karşılık, femoral arter ligasyonu, tümör hücrelerinin büyük çoğunluğunda, hatta kan damarlarına yakın olanlarda bile derin hipoksiye neden olur. Femoral arter ligasyonunun etkinliği, femoral arter ligasyonu ile amputasyon arasındaki üç günlük süre boyunca primer tümör büyümesinin tamamen inhibisyonu ile desteklenir. Histopatolojik analiz, ameliyattan üç gün sonra çıkarılan femoral arter ligasyonu ile tedavi edilen primer tümörlerde geniş nekroz alanlarını ortaya koymaktadır.

Bununla birlikte, tümörün damar sistemine yakın kenarlarında bulunan tümör dokusu içinde bulunan canlı tümör hücresi grupları vardır. Bu kalan canlı tümör hücreleri, masif intravazasyonları ile kanıtlandığı gibi oldukça invazivdir. Damar lümeni içindeki birçok hücre Hipoksiprob-1 pozitiftir, bu da femoral arter ligasyonu sonrası hipoksik hücrelerin anjiyoinvazyon başlatmış olabileceğini gösterir.

Bu deneylerde, hipoksi, genellikle kontrol tümörleri taşıyan farelerde etkilenmeyen yerlerde gözlenen metastazların sıklığını ve çokluğunu önemli ölçüde arttırdı. Bir kez ustalaştıktan sonra, hazırlık, anestezi ve iyileşme dahil olmak üzere her cerrahi prosedür hayvan başına 30 dakika içinde tamamlanabilir. Tüm deneyin uzunluğu, kullanılan hücre hattına ve büyüme ve metastaz oranlarına bağlıdır.

MRG ve ötenazi zaman çizelgeleri, metastazların gecikmesine göre değişir ve bir pilot deneyde her bir hücre hattı için oluşturulmalıdır. Bu prosedürü denerken, işlem sonrası uygun ağrı yönetimini ve hayvan izlemeyi sürdürmeyi unutmamak önemlidir. İşlem mükemmel bir şekilde yapılırsa, ameliyata bağlı ciddi bir yan etki veya ölüm gözlenmemelidir.

Bu prosedürü takiben, kontrol ve hipoksik primer tümörlerden ve bunlara karşılık gelen metastazlardan elde edilen dokular ve hücreler, hipoksiye bağlı metastaz mekanizmalarını tanımlamak için küresel gen ekspresyonu profillemesi de dahil olmak üzere daha fazla analize tabi tutulabilir. Bu teknik, tümör hipoksisinin hastalık yayılımı üzerindeki etkilerini doğrudan test etmek için kanser metastazı alanındaki araştırmacılar için kullanılabilir. Burada Ewing sarkomuna odaklanmış olsak da, benzer bir yaklaşım diğer tümörlere de uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, tümör hipoksisinin bir hayvan modelinin nasıl oluşturulacağını ve ortaya çıkan metastazların hem in vivo hem de ex vivo olarak nasıl izleneceğini çok iyi anlamış olmalısınız.