Aerobik Granül Çamur dan Yapısal Ekstrasellüler polimerik maddelerin çıkarımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, biyoköpüklerden, özellikle de aerobik granüler çamurdan yapısal hücre dışı polimerik maddelerin veya EPS'nin elde edilmesine yönelik bir ekstraksiyon metodolojisi göstermektir. Bu yöntem, granülasyon sürecinin anlaşılması ve EPS kompozisyonunun analiz edilmesi gibi granüler çamur alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, EPS'deki jel oluşturucu polimerlerin varlığının kısa sürede test edilebilmesidir. Granüler çamuru 4.000 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı boşaltın. Ekstraksiyon için pelet içindeki granülleri toplayın.

Manyetik karıştırıcı üzerinde, 1.000 mililitrelik cam beher içerisindeki 150 mililitre musluk suyunu 80 °C'ye kadar ön ısıtmaya tabi tutun. 250 mililitrelik kanatlı (baffled) bir erlene üç gram granül aktarın ve erleni demineralize su ile 50 mililitreye tamamlayın. %0,5 ağırlık/hacim sodyum karbonat konsantrasyonu elde etmek için erlene 0,67 gram sodyum karbonat dekahidrat ekleyin.

Karışımın bulunduğu erleni su banyosuna yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için erleni ve beher camını ayrı ayrı alüminyum folyo ile kapatın. Karışımı 400 RPM ve 80 °C'de 35 dakika boyunca karıştırın.

Karışımı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Karışımı içeren tüpü 4,000 ×g hızda ve dört °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı toplayın ve peleti atın.

Aerobik granüler çamurdan yapısal EPS elde etmek için diyaliz adımı isteğe bağlıdır. Ancak, protokolde açıklanan çeşitli avantajları bulunmaktadır. Süpernatantı, 3.500 dalton moleküler ağırlık kesme sınırına sahip bir diyaliz torbasına pipetleyin ve 1000ml ultra saf suya karşı 24 saat boyunca diyalize edin.

Diyaliz etkisini artırmak için diyaliz suyunu 12 saat sonra değiştirin. Diyaliz edilmiş ekstrakta 250ml'lik cam bir behere aktarın ve ekstraksiyonu oda sıcaklığında 100 rpm hızda yavaşça karıştırın. Asidik formda elde etmek için, nihai pH 2.2 05 olana kadar 1 molar hidroklorik asit eklerken pH değişimlerini bir pH elektrodu ile sürekli olarak izleyin.

pH 2,2'ye ayarlandıktan sonra, ekstrak bir 50ml santrifüj tüpüne aktarılır ve 4000 ×g'de, 4 °C'de yirmi dakika boyunca santrifüj edilir. Süpernatan atılır ve jel benzeri pelet toplanır. Jel benzeri pelet, asidik formdaki ale'dir.

Aljinatın sodyum formunu elde etmek için, pH 8.5 değerine ulaşılana kadar jeli bir cam bagetle el yardımıyla yavaşça karıştırırken, jelin içine 0.5 molar sodyum hidroksit yavaşça ekleyin. Bir pastör pipeti kullanarak, sodyum aljinat ekstraktını bir kalsiyum klorür çözeltisine yavaşça damlatın. Ekstrakt edilen EPS iyonik hidrojel jel oluşturma özelliklerine sahipse, damla şeklinde küresel boncuklar oluşacaktır.

Alternatif olarak, ekstrakte edilen EPS'nin iyonik hidrojel jel oluşturma özellikleri yoksa, ekstrakt kalsiyum klorür çözeltisi içinde dağılacaktır. Hidrojel boncukları ve kalsiyum klorür çözeltisini 30 dakika boyunca bekletin. Hidrojel boncuklarını kalsiyum klorür çözeltisinden çıkarmak için bir kaşık kullanın ve bunları bir EDTA çözeltisine aktarın.

Hidrojel boncukları 10ml EDTA çözeltisi içerisinde, dört santigrat derecede üç saat boyunca saklayın. Bu test, protokolde açıklanan stabilite testlerinden bir örneği göstermektedir. Boncukların bu koşullara dayanıp dayanamayacağını değerlendirmek için, saklama süresi boyunca boncuklarda gözle görülür bir parçalanma olup olmadığını izleyin.

Ekstraksiyon başarılı olduysa, alkali ekstraksiyon adımından sonra aerobik granüler çamur çözünecek ve ekstrakte edilen EPS asitlendirilip santrifüj edildikten sonra bir pelet elde edilecektir. Ekstrakte edilen EPS'ler yapısal EPS ise ve kalsiyum iyonları ile hidrojeller oluşturma yeteneğine sahipse, ekstrakte edilen EPS kalsiyum çözeltisine damlatıldığında jel boncuklar oluşacaktır. Bu jel oluşturma yeteneğine sahip olmayan EPS'ler ekstrakte edildiyse, EPS çözeltisi kalsiyum çözeltisi içinde dağılacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, aerobik granüler çamurdan yapısal EPS ekstraksiyonunu gerçekleştirebilmelisiniz. Ayrıca, elde edilen EPS'nin kalsiyum iyonları ile jel oluşturma yeteneğini test edebilmelisiniz. Aerobik granüler çamurdan elde edilen EPS üzerinde ekstraksiyon tekniğinin etkisini örneklendirmek için bu ekstraksiyon metodolojisini göstermeyi seçtik.

Bunun yanı sıra, hiçbir EPS ekstraksiyon tekniğinin evrensel olarak uygulanabilir olmadığını göstermek istedik.