Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Bu yöntemin genel amacı, beyin omurilik sıvısında veya BOS'ta çoklu biyobelirteçleri hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde kantitize etmek, tanı ve tedavi izlemeye yönelik kullanımlarını değerlendirmektir. Bu, daha önce ölçülmesi mümkün olmayan biyobelirteçleri ölçmemizi sağlayan yeni bir testtir. Ve bunun tanı amaçlı kullanılabileceğini ve ayrıca farklı nörodejeneratif hastalıklar arasında ayrım yapabileceğini ve potansiyel olarak prognostik bilgi verebileceğini düşünüyoruz.

Bu tekniğin ana avantajı, hızlı, numune hazırlamada basit, son derece spesifik ve klinik laboratuvara çeviri için uygun maliyetli olacak şekilde tasarlanmış olmasıdır. Bu yüksek verimli test, nörodejenerasyonda yeni tedaviler için gelecekteki klinik çalışmalarda kullanılabileceğinden, bu tekniğin etkileri tedavi veya tanıya kadar uzanır. Bu metodoloji, böbrek bozuklukları için idrar, kardiyomiyopati için plazma ve pluripotentlik hücreleri gibi diğer hastalıklara ve dokulara da uygulanabilir.

Bu prosedüre başlamak için, istenen sentetik peptitleri, üreticinin talimatlarına göre mililitre başına bir miligram stok konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. Stok konsantrasyonundan peptidin 10'da bir seyreltmesini hazırlayın ve her peptidin 1.000 pikomolünü düşük bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Havuzlanmış peptit örneğini bir SpeedVac yoğunlaştırıcıda kurutun.

Bittiğinde, numuneyi eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, 100 mikrolitre BOS'u düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine alın. BOS numunelerini dondurarak kurutun.

Mikrolitre başına 10 ve bir pikomol konsantrasyonları elde etmek için havuzlanmış peptit örneğinin bir alikotunu sindirim tamponunda yeniden süspanse edin. Şimdi, havuzlanmış peptit örneğini sıfır, bir, iki, beş, 10 ve 15 pikolar konsantrasyonlarda dondurularak kurutulmuş 100 mikrolitrelik BOS alikotlarına dökün. Daha sonra, dahili bir standart olarak hareket etmek ve tripsinin sindirim verimliliğini kontrol etmek için 20 nanogram bozulmamış ilgisiz protein ekleyin.

BOS alikotlarına 20 mikrolitrelik bir son hacme sindirim tamponu ekleyin ve numuneleri girdaplayın. Bunu takiben, 1.5 mikrolitre ditiotreitol ekleyerek ve oda sıcaklığında bir saat çalkalayarak numuneleri standart protokole göre sindirin. Bunu takiben, numunelere üç mikrolitre iyodoasetamid ekleyin ve karanlıkta 45 dakika oda sıcaklığında çalkalayın.

Ardından 165 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Numunelere 50 milimolar amonyum bikarbonat tamponu içinde yeniden süspanse edilmiş, mikrolitre başına 0.1 mikrogram, sıralama dereceli modifiye tripsin çözeltisinden 10 mikrolitre ekleyin. Numuneleri gece boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin.

Ardından, numuneleri dondurarak sindirimi durdurun. Buz çözüldükten sonra, BOS buz üzerinde sindirilir, 10 dakika boyunca 16.000 kez g'de santrifüjleyin. Bittiğinde, her bir sindirimden 60 mikrolitreyi 300 mikrolitrelik bir cam parçaya aktarın.

Bir C18 UPLC kolonu ile donatılmış bir LC-MS sistemi kullanarak, 10 dakikalık, bir ila %40'lık bir asetonitril doğrusal gradyan kullanarak standart eğri noktasından en yüksek konsantrasyonu enjekte edin. Çalışma tamamlandıktan sonra, elde edilen kromatogramı yazılımda açın ve alıkonma süresini ve peptit başına en yoğun iki geçişi not edin. Bu bilgilere dayanarak, peptitleri ölçmek için önceden oluşturulmuş bir çoklu reaksiyon izlemeyi veya zamanlanmış kanallarla MRM yöntemini güncelleyin.

Hassasiyeti korumak için, her bir peptit için en az bir geçiş için her kanalı tepe başına nokta sekizden büyük tutun ve bekleme süresi 0.01 saniyeden fazla tutun. MS yöntem dosyasındaki yöntem olaylarında çözücü gecikmelerini seçerek çözücü gecikmelerini MRM yöntemine dahil edin. Kısa bir HPLC yönteminde doğru tepe noktasını doğru bir şekilde eşleştirmek çok önemlidir.

Bu, standart bir eğri için kullanılan matristeki çivili peptitler kullanılarak ve yöntem geliştirme sırasında çoklu geçişleri gözlemleyerek yapılabilir. Son olarak, doğruluğu sağlamak için veri ek açıklamasını manuel olarak gözden geçirin. Her peptidi ve oranı uygun bir kararlı izotop etiketli dahili standarda göre analiz edin.

Yüksek verimli BOS testinden elde edilen önemli peptit belirteçlerinin bir kromatogramı burada gösterilmektedir. Veriler, mutlak BOS konsantrasyonlarını belirlemek ve klinik numunelerdeki değişiklikler için istatistiksel olarak analiz etmek için kullanılabilen ilgili kararlı izotop etiketli dahili standarda standartlaştırılmış oranlar verir. Bu BOS testine dahil edilen 74 peptidin kantitasyonu, demans hastalarının BOS'unda 25'inin önemli ölçüde değiştiğini ve demans belirteçleri pro-oreksin ve YKL kitinaz-3 benzeri proteinden elde edilen sonuçların burada gösterildiğini ortaya koymuştur.

ApoE4, Alzheimer hastalığı için bilinen bir risk faktörüdür ve ApoE izoformlarının tespiti, E2 ve E4 izoformları için amino asit değişiklikleri için karşılık gelen peptitlerin tespitine dayanır. Her bir izoform kombinasyonu için beklenen tepe modeli burada gösterilmiştir. Yöntem kurulduktan sonra, uygun şekilde yapılırsa test bir günde yapılabilir. Bu yöntemin geliştirilmesinden sonra, yüksek analitik duyarlılık ve özgüllüğe sahip yeni bir biyobelirteç setini ölçmek mümkün oldu ve bu, araştırmacıların nörodejeneratif hastalıkları yeni bir şekilde değerlendirmesini mümkün kılacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, duyarlılık ve özgüllük için bir MRM testinin nasıl tasarlanacağını ve optimize edileceğini iyi anlamış olmalısınız. DTE, termit, formik asit ve insan dokusu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlem sırasında eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.