Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Bu yöntemin genel amacı, tanı ve tedavi izlemindeki kullanımlarını değerlendirmek için beyin omurilik sıvısındaki (BOS) birden fazla biyobelirteci hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde nicelendirmektir. Bu, daha önce ölçülmesi mümkün olmayan biyobelirteçlerin ölçülmesine olanak tanıyan yeni bir analizdir. Bunun tanı amaçlı olarak, farklı nörodejeneratif hastalıkların ayırt edilmesinde ve potansiyel olarak prognostik bilgi sağlamak için kullanılabileceğini düşünüyoruz.

Bu tekniğin temel avantajı; hızlı olacak şekilde tasarlanmış olması, numune hazırlama sürecinin basitliği, yüksek özgüllüğü ve klinik laboratuvara aktarımı için maliyet etkin olmasıdır. Bu yüksek kapasiteli testin, nörodejenerasyondaki yeni tedavilere yönelik gelecekteki klinik çalışmalarda kullanılabilmesi nedeniyle, tekniğin etkileri tedavi veya tanıya kadar uzanmaktadır. Bu metodoloji ayrıca diğer hastalıklara ve dokulara da uygulanabilir; örneğin böbrek rahatsızlıkları için idrar, kardiyomiyopati için plazma ve pluripotans için hücreler kullanılabilir.

Bu prosedüre başlamak için, üretici talimatlarına uygun olarak istenen sentetik peptidleri 1 mg/mL stok konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Stok konsantrasyondan peptidin 1/10'luk dilüsyonlarını hazırlayın ve her bir peptidden 1 000 pmol'u düşük bağlanma özelliğine sahip bir mikro santrifüj tüpünde birleştirin. Birleştirilen peptid örneğini bir SpeedVac konsantratörde kurutun.

İşlem tamamlandığında, örneği -20 °C'de saklayın. Ardından, düşük bağlanma özellikli mikrocentrifüj tüplerine 100 µL BOS alıkotu ekleyin. BOS örneklerini liyofilize edin.

Havuzlanmış peptit örneğinin bir alikotunu, mikrolitre başına 10 ve bir pikomol konsantrasyonlar elde etmek için sindirim tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, havuzlanmış peptit örneğini; sıfır, bir, iki, beş, 10 ve 15 pikomolar konsantrasyonlarda, dondurularak kurutulmuş 100 mikrolitrelik BOS alikotlarına ekleyin. Daha sonra, bir iç standart olarak görev yapması ve tripsinin sindirim verimliliğini kontrol etmesi için 20 nanogram bozulmamış ilgisiz protein ekleyin.

CSF alikotlarına, final hacim 20 microliters olacak şekilde sindirim tamponu ekleyin ve örnekleri vorteksleyin. Bunu takiben, 1.5 microliters dithiothreitol ekleyerek ve oda sıcaklığında bir saat boyunca çalkalayarak örnekleri standart protokole göre sindirin. Ardından, örneklere üç microliters iodoacetamide ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca çalkalayın.

Ardından, 165 µL çift distile su ekleyin. Numunelere, 50 mM amonyum bikarbonat tamponunda yeniden süspande edilmiş 0,1 µg/µL konsantrasyonunda, sekanslama dereceli modifiye tripsin solüsyonundan 10 µL ekleyin. Numuneleri 37 °C'deki bir su banyosunda gece boyunca inkübe edin.

Ardından, örnekleri dondurarak sindirimi durdurun. Buz üzerinde çözdürülen CSF sindirimlerini 10 dakika boyunca 16,000 ×g'de santrifüjleyin. İşlem tamamlandığında, her sindirimden 60 µL'yi 300 µL'lik cam insert şişeye aktarın.

C18 UPLC kolonu ile donatılmış bir LC-MS sistemi kullanarak, standart eğri noktasındaki en yüksek konsantrasyonu 10 dakikalık, %1'den %40'a asetonitril lineer gradyanı kullanarak enjekte edin. Çalışma tamamlandığında, elde edilen kromatogramı yazılımda açın ve tutulum süresini ve peptid başına en yoğun ilk iki geçişi kaydedin. Bu bilgilere dayanarak, peptidleri ölçmek için zamanlanmış kanalları içeren, daha önce oluşturulmuş çoklu reaksiyon izleme (MRM) yöntemini güncelleyin.

Hassasiyeti korumak için, her peptit için en az bir geçişle her kanalda pik başına nokta sayısını sekizden büyük ve kalma süresini (dwell time) 0,01 saniyeden büyük tutun. MS metot dosyasındaki metot olaylarından çözücü gecikmelerini (solvent delays) seçerek MRM metoduna çözücü gecikmelerini dahil edin. Kısa bir HPLC metodunda doğru piki doğru şekilde eşleştirmek kritiktir.

Bu işlem, standart eğri için kullanılan matristeki eklenmiş peptitler kullanılarak ve yöntem geliştirme sırasında çoklu geçişlerin gözlemlenerek gerçekleştirilebilir. Son olarak, doğruluğu sağlamak için veri açıklamasını manuel olarak gözden geçirin. Her bir peptidi ve oranı, uygun bir kararlı izotopla işaretlenmiş iç standarda göre analiz edin.

Yüksek kapasiteli BOS analizinden elde edilen önemli peptid markerların kromatogramı burada gösterilmiştir. Veriler, mutlak BOS konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılabilecek ve klinik örneklerdeki değişimler için istatistiksel olarak analiz edilebilecek, ilgili stabil izotopla işaretlenmiş iç standartlara göre standardize edilmiş oranları sunmaktadır. Bu BOS analizinde yer alan 74 peptidin kantifikasyonu, demans hastalarının BOS'unda 25 tanesinin anlamlı şekilde değiştiğini ortaya koymuş olup, demans markerları olan pro-oreksin ve YKL kitinaz-3 benzeri proteinin sonuçları burada sunulmuştur.

ApoE4, Alzheimer hastalığı için bilinen bir risk faktörüdür ve ApoE izoformlarının tespiti, E2 ve E4 izoformlarına özgü amino asit değişimlerine karşılık gelen peptidlerin saptanmasına dayanır. Her bir izoform kombinasyonu için beklenen pik deseni burada gösterilmiştir. Yöntem kurulduktan sonra, uygun şekilde uygulandığı takdirde analiz bir gün içinde tamamlanabilir. Bu yöntemin geliştirilmesinin ardından, yüksek analitik hassasiyet ve özgünlükle yeni bir biyobelirteç setinin ölçülmesi mümkün hale gelmiş olup bu durum, araştırmacıların nörodejeneratif hastalıkları yeni bir yaklaşımla değerlendirmesine olanak sağlayacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, duyarlılık ve özgüllük açısından bir MRM analizinin nasıl tasarlanacağı ve optimize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. DTE, termit, formik asit ve insan dokusu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür sırasında eldiven giymek gibi önlemlerin uygulanması gerektiğini unutmayın.