Floresan Boyalar ile Antikor Etiketleme Manyetik Protein A ve Protein G Boncuk kullanma

Bu yöntemin genel amacı, manyetik protein A veya G boncukları kullanarak saflaştırılmış örneklerden veya doğrudan hücre ortamından antikorları floresan boyalarla işaretlemektir. Bu yöntem, hücre ortamındaki az miktardaki antikorların bile işaretleme kimyasını optimize etmek için kullanılabilir. Bu da antikorların sonraki uygulamalarda daha etkili kullanılmasına olanak tanır.

Bu tekniğin temel avantajları, antikorların saflaştırma gerektirmemesi, amin veya tiyol kimyasının kullanılabilmesi ve yöntemin otomatik veya manuel olarak uygulanabilmesidir. İşleme, boncukları hafifçe çalkalayarak homojen bir şekilde yeniden süspande ederek başlayın. Ardından, 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 50 µL boncuk ekleyin.

Ardından, tüpü manyetik bir standa yerleştirin. 10 saniye sonra, saklama tamponunu dikkatlice 250 µL antikor bağlama tamponu ile değiştirin ve boncukları iyice karıştırın. Bir 10 saniye daha bekledikten sonra, bağlama tamponunu dikkatlice 1 mL ilgili antikor ile değiştirin.

Ve örneği oda sıcaklığında 60 dakika boyunca karıştırın. İnkübasyonun sonunda, tüpleri tekrar mıknatısa yerleştirin ve boncuklar tüpün kenarlarına toplandığında süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, boncuk ve antikor karışımını, her yıkama için 250 µL antikor bağlama yıkama tamponu kullanarak 10 saniyelik iki yıkama ile durulayın.

Antikorları amin kimyası kullanarak işaretlemek için, ikinci yıkamadan sonra yıkama tamponunu 100 microliters amin konjugasyon tamponu ile değiştirin ve her 100 micrograms antikor başına 2.5 microliters taze hazırlanmış amin-reaktif boya ekleyin. İşaretleme sırasında boncukların süspansiyon halinde kalmasını sağlamak için örneği oda sıcaklığında 60 dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, tüpü 10 saniye boyunca tekrar mıknatısa yerleştirin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Boncukları, az önce gösterildiği gibi, antikor bağlayıcı yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, yıkama tamponunu 50 µL elüsyon tamponu ile değiştirin ve boncukları beş dakika boyunca karıştırın. Tüpü 10 saniye boyunca mıknatısa geri yerleştirin ve elüe edilen antikoru, beş µL nötralizasyon tamponu içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Az önce gösterildiği gibi, elüe edilen örnekleri toplayarak antikoru bir kez daha elüe edin. Ardından, antikor-boya konjugatının absorbansını 280 nanometre değerinde ve boya için lambda max değerinde ölçün. Antikorları tiyol kimyası kullanarak etiketlemek için, ikinci yıkamadan sonra yıkama tamponunu 250 µL tiyol konjugasyon tamponu ile değiştirin ve boncukları nazikçe pipetleyerek karıştırın.

10 saniye sonra, boncukları iki kez antikor bağlayıcı yıkama tamponu ile yıkayın. Ardından, yıkama tamponunu 100 µL tiyol konjugasyon tamponu ile değiştirin ve DTT'yi 2,5 mM nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Boncukları 60 dakika daha karıştırın.

Ardından, boncukları 10 saniye boyunca tekrar mıknatısa yerleştirin ve tamponu dökün. Sonra, boncuklara hafifçe karıştırarak 250 µL tiyol-konjugasyon tamponu ekleyin. 10 saniye sonra, boncukları antikor-bağlama yıkama tamponu ile iki kez yıkayın ve ikinci yıkamanın yerine 100 µL taze tiyol-konjugasyon tamponu ekleyin.

Şimdi, antikorun her 100 mikrogramı için 2,5 µL taze hazırlanmış tiyol-reaktif boya ekleyin ve boncukları oda sıcaklığında 60 dakika boyunca karıştırın. İnkübasyonun sonunda, tüpü 10 saniye boyunca tekrar mıknatısa yerleştirin. Ardından, süpernatantı nazikçe karıştırarak 250 µL taze tiyol-konjugasyon tamponu ile değiştirin.

10 saniye sonra, boncukları iki kez yıkayın. Ardından, yıkama tamponunu 50 µL elüsyon tamponu ile değiştirin ve az önce gösterildiği gibi konjuge antikoru iki kez elüe edin. Daha sonra, antikor-boya konjugatının absorbansını 280 nm'de ve boyanın lambda max değerinde ölçün.

Antikorlar ile Protein G arasındaki güçlü afinite, mıknatısın boncuklara olan kuvvetli çekimi ve boncuk saflaştırması öncesinde yöntemin optimize edilmesi, basit saflaştırmaya kıyasla floresan çift etiketleme sonrası üç farklı fare antikor izotipinin verimli geri kazanımıyla kanıtlandığı üzere, etiketleme reaksiyonu sırasında nominal bir antikor kaybıyla sonuçlanmaktadır. Bu geri kazanım, manyetik G Proteini boncuklarının düşük non-spesifik bağlanma özelliklerinin, yüksek derecede saflaştırılmış floresan çift etiketli ağır ve hafif zincirlerin varlığıyla sonuçlandığı Coomassie jellerinde de belirgindir. Manyetik Protein A boncukları ile boncuk üzerinde etiketleme, birden fazla floresan boya ile de uyumludur ve yüksek geri kazanım ile iyi boya-antikor oranları sağlamaktadır.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülürse iki ila üç saat içinde tamamlanabilir; bu da çok sayıda örneğin manuel olarak işlenmesine veya daha yüksek verim için otomatik bir platformun kullanılmasına olanak tanır. Bu prosedür uygulanırken, manyetik boncukların her zaman süspansiyon halinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Numune için uygun manyetik boncuk hacmini seçin. Ve ilgilenilen antikor için floresan boya miktarını optimize edin. Bu prosedürün ardından, işaretli antikorların işlevselliği ELISA, FACS veya hücre tabanlı assayler gibi ilgili biyolojik assayler kullanılarak test edilmelidir.

Bu videoyu izledikten sonra, manyetik Protein A veya G boncuklarını kullanarak saflaştırılmış ve saflaştırılmamış antikorların floresan etiketlerle veya biyotin ya da sitotoksik ilaçlar gibi diğer küçük moleküllerle nasıl etiketleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.