Name: Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Öğrenin, E. coli tespiti için RNA-kesici DNAzim ve üreaz tabanlı renk değişimli turnusol testi yöntemini. Bu basit, hızlı platform nokta-bakım tanı için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma projesinin finansmanı, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) tarafından YL'ye verilen bir Keşif Hibesi aracılığıyla sağlanmıştır.

Reaktifler ve Tamponlar hazırlanması 1. <ol><li> 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), <ol><li> 2 L&#39;lik bir beher içinde, deiyonize damıtılmış 800 ml su ile 186.1 gr EDTA ekleyin (GKD 2 O). NaOH peletleri ile 8.0 çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. 1.0 L&#39;lik son bir hacme O GKD 2 ekleyin ve 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza bir otoklav cam şişe çözüm aktarın. </li></ol></li><li> 10 x Tris-borat EDTA (10x TBE) <ol><li> 4 L&#39;lik bir plastik kabı içinde, tüm bileşenler kadar bir karıştırma çubuğu kullanılarak 4 L Karışım bir son hacme 432 g Tris-bazı, 200 g borik asit, 0.5 M EDTA (pH 8.0) ve GKD 2 O 80 ml ​​ilave çözündürülür. 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza 1 L cam şişe çözüm aktarın. </li></ol></li><li> % 10 denatüre edici poliakrilamid Hazır <ol><li> F kadar çözeltisi ve GKD 2 A: (1 29), 4 L&#39;lik bir plastik kap olarak, 1681,7 g üre 400 ml 10x TBE, 40% akrilamid / bisakrilamid 1 L eklemeNominal hacmi üre çözünene kadar bir karıştırma çubuğu kullanılarak 4 L bir karışımıdır. 4 ° C &#39;de 1 L&#39;lik amber cam şişe ve saklamak için bir çözüm aktarın. </li></ol></li><li> Yükleme Tamponu 2x Jel (2x GLB) <ol><li> 200 ml&#39;lik bir cam kabın içinde, 44 g üre, 8 g sakroz, 10 mg bromofenol mavi, 10 mg iksilen siyanol FF,% 10 sodyum dodesil sülfat 400 ul ve 10 x TBE ve 4 ml. 40 ml&#39;lik bir son hacme O GKD 2 ekleyin ve bir manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırılarak 50 ° C&#39;de, hafif ısıtma ile bileşenleri çözülür. 4 ° C&#39;de Aktarım 1 mi, 1.5 ml mikrofüj tüplerine kısım saklayın. Not: Ön kullanımı herhangi bir katı yeniden çözünmesi için 90 ° C&#39;de kısa bir ısıtma gerektirir. </li></ol></li><li> 1 M Tris-hidroklorür (Tris-HCl) (pH 7.5) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, Tris-bazın 12.1 g ve GKD 2 O 70 ml ilave edilir ve katı madde çözülene kadar karıştırın. 1 M hidroklorik asit (HCI) ile pH&#39;ı 7.5&#39;e ayarlayın. 100 mi, otoklav ve taştan bir son hacme GKD 2 O eklemere 4 ° C&#39;de </li></ol></li><li> 5 M sodyum klorür (NaCI) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, GKD 2 O 150 ml NaCI 58.4 g çözülür GKD 2 O. ile 200 ml ses seviyesini ayarlamak 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> DNA, Seyreltme Tampon maddesi <ol><li> bir cam şişe içinde, 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 8.0 5 M NaCl mi ve 0.5 M EDTA, 0.4 mi (pH 8.0) içinde 2.0 ml karıştırılır. GKD 2 O, 4 ° C&#39;de otoklav ve mağaza ile 200 ml ses seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) (pH 7,4) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, GKD 2 O 80 ml ​​HEPES, 2.38 g çözülür 5 N NaOH kullanılarak 7.4 pH ayarlamak ve 100 ml lik bir son hacme GKD 2 O ekleyin. </li></ol></li><li> 1 M magnezyum klorür (MgCI2) <ol><li> Bir cam şişe içerisinde, MgCl2 -6H 2 O 2.03 g ekleme ve GKD 2 O ile 100 ml&#39;ye ses getirmek </li></ol></li><li> Reaksiyon Tamponu (RB) <ol><li&gt; 50 ml konik bir tüp içinde, 1 M HEPES (pH 7.4), 5 M NaCI, 1.5 mL, 1 M MgCl2, 0.75 mi, ve Tween-20 5 ul 50 ul ekle. 50 ml&#39;lik bir son hacme O GKD 2 ekleyin. çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre. </li></ol></li><li> Bağlama Tamponu (BB) <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde, bir son hacim için O GKD 2; 1 M Tris-HCI (pH 7.5), 500 ul, NaCI 8.8 g, MgCl2, 1 M, 50 ul, Tween 20 5 ul 50 ml. çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre. </li></ol></li><li> Substrat solüsyonu (SS) <ol><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde, NaCI 5.8 g, 1 M 3 mL MgCl2, 1.5 g üre ve GKD 2 O 40 ml ilave 10 mM HCI kullanılarak 5,0 çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. Çözelti tamponlu olduğundan, HCI kullanılarak pH ayarlamakdikkatle küçük HCI alikotları eklenmesi ile. 50 ml&#39;lik bir son hacme O GKD 2 ekleyin. </li><li> çözelti karıştırılır ve kullanılana kadar 4 ° C de, bir şırınga veren filtre (0.22 um) ve deposunu kullanan bir konik tüp içine filtre. </li></ol></li><li> Luria Bertani (LB) Broth <ol><li> Beher, GKD 2 O 1 L 20.0 g LB tozu çözmek 4 ° C&#39;de bir cam şişe, otoklav ve saklamak için aktarın. </li></ol></li><li> % 1.5 LB agar <ol><li> 250 ml&#39;lik bir şişe içinde, 1.5 g agar ve LB suyu 100 ml. 4 ° C&#39;de otoklav ve saklayın. </li></ol></li><li> agar Tabaklar <ol><li> Bir mikrodalga LB agar tekrar çözündürülmesi ve çözeltiye ~ 50 ° C soğutulur. Petri kaplarına solüsyonu dökün ~ 5 plakaları yapmak ve onları katılaşmaya sağlar. </li></ol></li></ol> 2. sentezi ve E. saflaştırma coli- duyarlı DNAzim EC1 <ol><li> Şablon aracılığı Enzimatik Ligasyonu ile EC1 sentezi <ol><li> comm arındırınticari olarak uygundur, sentezlenmiş oligonükleotidler BS1, DE1 ve T1,% 10, standart protokollere göre poliakrilamid jel elektroforezi (dPAGE) denatüre edici ile (Tablo 1 &#39;de verilen sekansları). </li><li> BS1, DE1 ve T1 100 uM stok hazırlayın. kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 1.5 ml mikrofüj tüpüne, enzim ile ilgili olarak (500 mM Tris-HCI (pH 7.6), 100 mM MgCl2 sağladığı GKD 2 O 38.5 ul, DE1 5 ul ve 10 x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu 5 ul 50 mM ditiotreitol (DTT), 1.0 mM spermidin). </li><li> adenosin trifosfat (ATP) (100 mM) 1 ul ekle. T4 polinükleotid kinaz 5 birim (10 U / ul) eklenir. reaksiyon karışımına dikkatli bir pipetleme karıştırın. </li><li> 30 dakika için 37 ° C &#39;de reaksiyon inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 90 ° C&#39;ye kadar ısıtılarak, reaksiyonun sönmesi. </li><li> GKD 2 O 118 ul, BS1 5 ul ve T1 5 ul ekleyin. 2 mi, 90 ° C tepkime ısısın, ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar soğutulur. </li><li> Enzim, tedarikçi tarafından sağlanan 10 x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu 20 ul ekle (400 mM Tris-HCI (pH 7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). T4 DNA ligazı, 10 birim (5 U / ul) ilave edilir ve dikkatli bir şekilde pipetle karıştırılır. </li><li> 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 3 M sodyum asetat (NaOAc) (pH 5.2) 20 ul soğuk% 100 etanol 500 ul ekle. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika için -20 ° C dondurucu içinde bir tüp yerleştirmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de mikrofüj santrifüj. Dikkatle pipetleme süpernatant kaldırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,000 x g hızında tekrar soğuk% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. Bir kez daha süpernatant kaldırmak ve 10 dakika süre ile, vakum altında pelet kurutulur. </li><li> GKD 2 O 15 ul DNA tekrar ve daha sonra 2x GLB 15 ul ekleyin. </li><li> 90 ° C&#39;ye kadar kuvvetli bir şekilde karıştırın ve ıslak sertleştirilmesi için2 dak. Aşağıda tarif edildiği gibi,% 10 dPAGE tam uzunlukta DNA saflaştırılır. </li></ol></li><li> % 10 dPAGE Kurma <ol><li> Temiz iki cam levha (bir tam plaka ve bir çontuklu), iki 0.75 mm kalınlığında aralama ve 12 kuyu tarak. İki her iki tarafta spacers ve üstüne çentikli plaka ile düz bir yüzeye bir cam plaka yatıyordu. Birlikte tedarikçi tarafından sağlanan dört klipler kullanarak iki tabak Clip. </li><li> 150 ml&#39;lik bir plastik kabı içinde,% 10 dPAGE 40 ml, tetrametiletilendiamin 40 ul (TEMED) ve% 10 amonyum persülfat (APS), 400 ul dökün. bileşenleri karıştırın ve yavaş yavaş plakalar arasına çözüm dökün. </li><li> Tarak yerleştirin ve sonra jel üzerinde 10 dakika polimerize izin verir. Jel polimerize edildikten sonra, yavaş yavaş tarak kaldırmak ve GKD 2 O. ile kuyu yıkayın </li><li> jel elektroforezi aparat üzerine plakaları monte edin. aşırı ısınmayı önlemek için üretilen ısıyı dağıtmak için bir metal plaka kullanın. </li><li> Üst ve alt bölmelere üzerine 1x TBE dökünve kuyular iyi tampon batık emin olun. Bir pipet veya şırınga kullanarak 1x TBE ile kuyu yıkayın. </li><li> yükleme örnekleri önce 15 dakika için 35 mA&#39;da için cihaz ve önceden çalıştırılmış ayarlayın. </li></ol></li><li> % 10 dPAGE den Bağlanmış EC1 elüsyon <ol><li> Adım 2.2.6 ardından, alt boya (Bromophenol mavi) kadar 35 mA jel çalıştırmak cam plakanın alt ulaşır. Bu, yaklaşık 1.5 saat sürer. Gücü kapatın ve cihazdan plakaları çıkarın. </li><li> kağıt havlu birkaç yaprak tabak Lay ve dikkatle cam plakalar gelen aralayıcılar kaldırın. Dikkatli bir şekilde üst cam plaka kaldırmak ve plastik wrap ile jel sarın. </li><li> ikinci cam plakayı kaldırın ve tekrar plastik wrap ile karşılamak için jel çevirin. plastik wrap kırışıklıkları önlemek için özen gösterin. </li><li> 4 farklı DNA bantları (Tam bağlanan EC1, DE1, BS1 ve T1) üretecek UV gölgeleme (260 nm) kullanarak bağlandı ürünü gözünüzde canlandırın. </li><li&gt; Tüketim 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp steril bir jilet ve transferi ile üst bant (EC1). ince bir hamur haline dönene kadar steril bir pipet (200 ul uç boyutu) ile jel Crush. DNA elüsyon tamponu 550 ul ekle gömülü fluorofor korumak için alüminyum folyo ile tüp kapağı ve 15 dakika boyunca çalkalayın. </li><li> 5 dakika boyunca 20.000 xg&#39;de jel çözüm Santrifüj ve dikkatli bir 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp süpernatant 400 ul aktarın. pipetleme sırasında jel parçaları çekilmesi kaçının. </li><li> transfer süpernatan ile mikrofüj tüpe 40 3 M NaOAc (pH 5.2) içinde ul soğuk% 100 etanol içinde 1.0 ml. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika için -20 ° C dondurucu içinde bir tüp yerleştirmek. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de mikrofüj santrifüj. Dikkatle pipetleme süpernatant kaldırmak. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,000 x g hızında tekrar soğuk% 70 etanol ve santrifüj ile pelet yıkayın. Bir kez daha, kaldırmakSüpernatan 10 dakika için vakum altında pelet kurutulur. </li><li> 260 nm&#39;de UV absorbansı ölçerek EC1 konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 uM stok yapmak ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de örnek saklayın. </li></ol></li></ol> DNA üreazın 3. Konjugasyon <ol><li> Sukinimidil 4- (N-maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat (SMCC), hisse senedi hazırlanması <ol><li> DMSO 676 ul 1 mg SMCC çözülür. kullanılana kadar buz üzerinde girdap ve yer. </li></ol></li><li> Üreaz Stokta hazırlanması <ol><li> 1 x PBS (Mg + 2 veya Ca + 2), 1 ml 1 mg üreaz çözülür. Buz üzerinde kullanıma kadar yerleştirin. Not: Kristalize üreaz çözünmesi yavaştır ve yumuşak karıştırma denatürasyon önlemek için gereklidir. </li></ol></li><li> Üreaz-DNA sentezi (UrDNA) <ol><li> 2.5 mi mikrofüj tüpüne 100 uM LD1 10 ul ekle. GKD 2 O 140 ul 10x PBS 40 ul ve vorteks ekleyin. </li><li> SMCC s 80.5 ul ekleyintak, bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak DMSO, girdap ve kısaca santrifüj 159.5 ul. </li><li> 60 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. mikrofuge&#39;ye kapağın altında yoğuşmayı önlemek. </li><li> 1x PBS 200 ul 3 M NaOAc (pH 5.2), 60 ul soğuk% 100 etanol içinde 1.5 ml. Vorteks ile çözüm karıştırın ve 30 dakika boyunca -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin çözeltisi. Süpernatantı ve vakum altında pelet kurulayın. aşırı kurumayı önlemek. </li><li> Kurutulmuş pelet, üreaz stokunun 400 ul, 5 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Önceden yıkanmış 100K MWCO santrifüj filtre kolonuna ham konjügat 200 ul aktarın. 5 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de sütun santrifüjleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 14.000 x g&#39;de kolon ve santrifüj ham konjügat kalan 200 ul aktarın. sütunu kaldırmak ve yeni bir 2.0 ml mikrofuge&#39;de tüp ( &quot;toplama tüpüne&quot;) olarak baş aşağı yerleştirin. </li><li> Santrifüjuge 2 dakika süreyle 1000 xg&#39;de (ters sütun ile) toplama tüpü. toplama tüpünü çıkarın ve konjugatlarının ek kurtarma için membran yıkamak için santrifüj sütuna 1x PBS 30 ul ekleyin. </li><li> Bir kez daha sütunu ters ve geri toplama tüpünün içine koyun. 2 dakika süreyle 1000 xg&#39;de (ters sütun ile) toplama tüpü santrifüj. Çıkarın ve sütun atmayın. </li><li> kullanılana kadar 4 ° C &#39;de UrDNA saklayın. </li></ol></li></ol> Manyetik boncuklar üzerine EC1 ve UrDNA 4. Montaj <ol><li> gibi manyetik boncuk (MB) stok karıştırın ve 1.5 ml mikrofüj tüpe MB süspansiyon 100 ul aktarın. MB izole bir manyetik raf tutucu mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin. </li><li> pipetle ile süpernatantı ve tüp tampon (BB) bağlayıcı 150 ul ekleyin. tutucudan tüpü çıkarın ve dikkatlice homojen bir çözüm MB tekrar süspansiyon tüp dokunun. t süspansiyon sıçramasını önlemektüp ya da kap op. Böyle bir durumda, kısaca geri süspansiyona kalıntı dönmeye bir tezgah üstü santrifüj kullanın. </li><li> Adımı yineleyin 4.2 iki kez daha. </li><li> Bu süspansiyona 10 uM EC1 10 ul ekle. Dikkatle tüp dokunarak karıştırın. </li><li> Hafif 30 dakika boyunca çalkalayarak çözelti inkübe edin. MB çökmesini önlemek için tüpü her 2-3 dakikada bir dokunun. </li><li> MB izole ve pipetleme süpernatant kaldırmak için geri manyetik raf mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin. (Adım 4.2 de tarif edildiği gibi) BB 150 ul MB üç kez yıkayın. </li><li> Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, BB 150 ul bir toplam MB askıya. Bu çözeltiye, UrDNA 15 ul ilave edin ve 2 dakika boyunca 45 ° C&#39;ye kadar çözelti ısıtılır. Solüsyon oda sıcaklığına kadar soğutulur ve 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> MB izole ve pipetleme süpernatant kaldırmak için geri manyetik raf mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin. </li><li> Reaksiyon tampon maddesi (RB), 100 ul ekle. t kaldırO manyetik raf tüp mikrofuge&#39;ye ve dikkatle MB tekrar süspansiyon. </li><li> adım 4.9 tekrarlayarak MB üç kez yıkayın. NOT: yıkanmış süpernatant hızla Melezleşmemiş UrDNA hala mevcut olup olmadığını bir yanlış pozitif sinyal neden olabilir, hangi belirlemek için test edilebilir. Test yıkama çözeltisine kırmızı 50 mM üre 10 ul ve% 0.04 fenol 10 ul ekleyerek yapılabilir. yıkama çözeltisi bir renk değişimine neden olmaz kadar MB yıkamak devam edin. 100 ul süspansiyon kullanilana kadar 4 ° C&#39;de saklanır. </li></ol> Bakteriyel hücreler 20 5. hazırlanması <ol><li> Kültürleme E. Stoklar gelen coli <ol><li> Plaka E. E. coli K12, bir alev altında veya biyolojik bir güvenlik kabini, bir gliserol stokundan LB agar kaplan üzerine (MG1655). </li><li> Steril bir pipet ucu kullanarak, yavaşça LB agar delinmesiyle önlemek için gliserol stok ve hafifçe çizgi bir agar plaka yüzeyi dokunun. </li><li> Kesikli invertPlaka ve 14 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3 haftalık bir süre için 4 ° C sıcaklıkta Parafilm ile plaka ve mağaza kapatın. </li></ol></li><li> Kültürleme E. Hücre Sayımı için coli <ol><li> steril 14 ml kültür tüpünde, LB suyu 2 ml dağıtın. </li><li> Steril bir pipet ucu kullanarak, adım 5.1 hazırlanan çizgili agar plakasından tek bir koloni almak ve kültür tüpüne aktarın. </li><li> 37 ° C &#39;de kültür inkübe ve 14 saat boyunca 230 rpm&#39;de çalkalanır. </li><li> Seri olarak 10-misli aralıklarla bakteri kültürü seyreltin. </li><li> Her bir seyreltilmiş numune için eşit, ayrı LB agar plakaları üzerinde beş 100 ul alikotları plaka. plakalar ters çevirin ve 14 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her bir seyreltme ortalama hücre konsantrasyonu elde etmek üzere her numune hücreleri sayın. NOT: 10 7 hücreleri genellikle E. için bir referans turnusol testi kurmak için kullanılan E. Bu seviyeye kadar coli E. coli hızlı bir renk chan tetikleyebilirge. Sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi Ancak, düzgün idam turnusol testi gibi düşük 500 hücreleri tespit edebilir. </li></ol></li><li> E. hazırlama Test coli hücreleri <ol><li> arzu edilen bir hücre süspansiyonu için, transfer 1.5 ml mikrofüj tüpüne kültürlendi, 1 mL stok. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Hücre topağı, reaksiyon tampon maddesi 10 ul ilave edin ve tekrar süspansiyon hücreleri. 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu sonikasyon. 5 dakika için bir buz kutusu hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 5 dakika daha hücre süspansiyonu sonikasyon. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de hücre süspansiyonu santrifüj. Test için supernatant (10 ul) kullanır. </li></ol></li></ol> 6. Litmus Testi <ol><li> 1.5 ml mikrofüj tüpüne, mikrofüj tüpüne reaksiyon tampon maddesi (RB) 100 ul ilave edildi ve vorteks yoluyla tüp ön yıkama vetampon atarak. </li><li> Aktarım yıkanmış mikrofüj tüpe monte EC1 (protokol 4) 15 ul. </li><li> Bir manyetik rafa mikrofuge&#39;ye tüp yerleştirerek manyetik boncuk yıkayın. pipetleme süpernatantı. , Raftan mikrofuge&#39;ye tüpünü çıkarın RB 100 ul ekleyin ve dikkatlice manyetik boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> adım 6.3 yineleyerek MB iki kez yıkayın. </li><li> , Manyetik rafa geri mikrofuge&#39;ye tüpü yerleştirin süpernatant kaldırmak ve 10 ul E. ekleyin E. coli örnek adım 5.3 hazırlanan. </li><li> yavaşça mikrofuge&#39;de tüp dokunarak dikkatlice örnek ve manyetik boncuk karıştırın. </li><li> 1 saat boyunca oda sıcaklığında reaksiyon inkübe edin. </li><li> Reaksiyona, GKD 2 O 90 ul ekleyin ve bir manyetik raf üzerine mikrofuge&#39;ye tüp yerleştirin. </li><li> Sonra manyetik ayırma yaklaşık 3 dakika, dikkatle 0.5 ml mikrofuge&#39;de tüp süpernatant 85 ul aktarın. yavaş yavaş süpernatant geri çekinherhangi bir manyetik boncuk toplama kaçının. </li><li> Yukarıdaki mikrofüj tüpe% 0,04 fenol kırmızısı 15 ul ve alt-tabaka çözeltisi 100 ul ilave edin. </li><li> renk değişikliği kaydetmek için belirli zaman aralıklarında bir fotoğraf çekmek. Not: pH değişikliği bir mikroelektrot içeren bir pH metre kullanılarak izlenebilir. Başlangıç ​​pH yaklaşık 5,2-5,5 olmalıdır (çözüm sarı renkte). Aksi takdirde, çözelti, 1 mM asetat tampon pH 5.0) ilavesiyle ayarlanabilir. </li></ol>

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
<li>Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensors%3A+sense+and+sensibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biosensors: sense and sensibility.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).</li>
<li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li>
<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+catalytic+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+nucleic+acid+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional nucleic acid sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi bir turnusol test etmek için bir bakteri duyarlı DNAzıme RNA bölünme etkinliğinin etki yaptı, üreaz ve manyetik ayırma kullanımı ile mümkün olmaktadır. Bakteriyel tespiti için modifiye test edeceği gösteri rağmen E ile yapılan E. coli bağımlı RNA-yaran DNAzim, 5,19,20 tasarım genellikle herhangi RNA-yaran DNAzıme için uzatılabilir. Yeni hedefler için rasgele dizi havuzlarından yeni RNA-yarma DNAzımler izole etmek farklı analitler ve çeşitli ...

Bakteriyel patojenler global morbidite ve mortalitenin en önemli nedenlerinden biridir. Hastane kaynaklı enfeksiyonlardan, gıda kaynaklı patojenlerden ve çevredeki bakteriyel kontaminantlardan kaynaklanan salgınlar, halk sağlığı ve güvenliği için ciddi ve devam eden tehditler oluşturmaktadır. Bu salgınları önlemek için, çeşitli ortamlarda zamanında patojen tespitine izin veren etkili araçlara ihtiyaç vardır. Taşınabilir ve uygun maliyetli olan basit ama yine de etkili testler, özellikle salgınlara duyarlı olan ancak pahalı test tesislerini karşılayamayan bölgelerde büyük ölçüde rağbet görmektedir. 1-3 Bakterileri tespit etmek için çok sayıda yöntem olmasına rağmen, bunların çoğu uzun test süreleri, pahalı aletler ve karmaşık test prosedürleri gerektirdiğinden tarama veya yerinde test araçları olarak uygun değildir. 
Kolorimetrik testler, renk değişiklikleri çıplak gözle kolayca tespit edilebildiği için özellikle bakım noktası veya saha uygulamaları için çekicidir. pH için turnusol testi basit, hızlı ve etkilidir. Çok eski bir teknoloji olmasına rağmen, basitliği ve etkinliği nedeniyle günümüzde hala yaygın olarak kullanılmaktadır. Şaşırtıcı bir şekilde, bu basit test, yakın zamanda bu testi E. coli testi için modifiye etmeye yönelik bir yaklaşım geliştirmeden önce, diğer analitlerin tespitini sağlamak için hiçbir zaman değiştirilmemişti. 4
E. coli için genişletilmiş turnusol testi üç ek bileşen kullanır: bir E. coli ile aktive edilmiş RNA parçalayan DNA (EC1), 5 üreaz ve manyetik boncuklar. DNAzimler, katalitik aktiviteye sahip sentetik tek sarmallı DNA moleküllerini ifade eder. 6 İn vitro seçim kullanılarak rastgele dizi DNA havuzlarından izole edilebilirler. 7,8 Oldukça kararlıdırlar ve yüksek verimli otomatik DNA sentezi kullanılarak uygun maliyetli bir şekilde üretilebilirler. 9 Bu nedenlerden dolayı, DNAzimler, özellikle RNA'yı parçalayan DNAzymler, biyo-algılama uygulamaları için geniş çapta incelenmiştir. Metal iyonlarını,12-16 küçük molekülleri,17,18 bakteriyel patojenleri5,19-21 ve kanser hücrelerini tespit etmek için 6,10,11 RNA parçalayan DNAzim sensörleri geliştirilmiştir. 22 Hedefle indüklenen RNA parçalayan DNAzimlerin büyük mevcudiyeti göz önüne alındığında, bir DNAzyme kullanan herhangi bir test, çok çeşitli analitleri tespit etmek için potansiyel olarak genişletilebilir.
Üreaz, üreyi amonyağa hidrolize etme kabiliyeti nedeniyle seçilmiştir,23,24 bu da pH artışına neden olur. Üreaz ayrıca oldukça verimli, stabildir ve diğer biyomoleküllere konjugasyon için uygundur. Bu nedenle, bir RNA-bölünme DNAziminin üreaz ile eşleniğinin, diğer hedeflerin tespiti için turnusol testinin kullanılmasına izin vereceğini varsaydık. 5
RNA parçalayan DNAzyme'in etkisi, DNAzime-üreaz konjugatı ile hareketsiz hale getirilen manyetik boncukların kullanılması yoluyla üreaz aracılı pH artışına iletilir. İncelenen DNAzyme'in aktivitesi sıkı bir şekilde E. coli'ye bağlı olduğundan, bu bakterinin test çözeltisindeki varlığı, manyetik boncuklardan çözeltiye üreaz salınmasına neden olacak, bu daha sonra alınır ve pH'a duyarlı bir boya içeren bir raportör çözeltide üreyi hidrolize etmek için kullanılır. Bu prosedürün nihai sonucu, boya veya pH kağıdı tarafından uygun bir şekilde rapor edilebilen bir renk değişikliğidir.

<table><tbody><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit (NaOH) peletleri</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>Tris bazlı</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>%40 akrilamid/bisakrilamid (29:1) çözeltisi</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop Kanada inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Bioshop Kanada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Ksilenesyanol FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>%10 sodyum dodesil sülfat</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik Asit (HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Bioshop Canada inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (II) hekzahidrat</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop Kanada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin Trifospapat (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat trihidrat (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Ticari Alkoller</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>%10 Amonyum persülfat (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>Süksinimidil 4- ( N -maleimidometil) sikloheksan-1-karboksilat (SMCC)</td> <td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>CALEDON LABORATUVARLARI</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Üreaz</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td> <td>ThermoFisher BİLİMSEL</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>% 0.04 Fenol kırmızısı</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 polinükleotid kinaz reaksiyon tamponu</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA ligaz reaksiyon tamponu</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz (5 U/&# 956; l)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Et Suyu</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinükleotid kinaz (10 U/&#956; l)</td> <td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td> E. coli K12 (MG1655)</td> <td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>Cam plakalar</td><td>CBS scientific</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0,75 mm kalınlığında ara parçalar</td><td>CBS scientific</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu tarak</td><td>CBS scientific</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>UV Lambası</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre (NanoVue)</td><td>GE Healthcare</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Metal plaka</td><td>CBS Bilimsel</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks</td><td>VWR Uluslararası</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez cihazı</td><td>CBS bilimsel</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>VWR Uluslararası</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO santrifüj filtreler</td><td>EMD Millipore UFC510024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Boncuk (BioMag)</td> <td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Ayırma Rafı</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi (0.22 &# 956; m)</td> <td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14 ml kültür tüpü</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonik temizleyici</td><td>Branson</td><td>N/A</td> Fotoğraf Makinesi <td></td></tr><tr><td>(Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konik tüp</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

turnusol testi kullanarak bakterilerin kolorimetrik tespiti

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

Bakım noktası veya saha uygulamaları için belirli patojenleri tespit etmek için kullanılabilecek basit ama yine de etkili yöntemlere yönelik artan talepler var. Bu tür yöntemlerin kullanıcı dostu olması ve hem uzmanlar hem de profesyonel olmayanlar tarafından kolayca yorumlanabilecek güvenilir sonuçlar üretmesi gerekir. pH için turnusol testi, bir test numunesinin pH'ını basit bir renk değişikliği yoluyla bildirdiği için basit, hızlı ve etkilidir. Bakteri tespiti için turnusol testinden yararlanmak için bir yaklaşım geliştirdik. Yöntem, iki işlevi yerine getirmek için bakteriye özgü bir RNA parçalayan DNAzyme'den yararlanır: ilgilenilen bir bakteriyi tanımak ve üreaz aktivitesini kontrol etmek için bir mekanizma sağlamak. Bir DNAzime-üreaz konjugatı ile hareketsiz hale getirilmiş manyetik boncukların kullanılmasıyla, bir test numunesindeki bakteri varlığı, boncuklardan çözeltiye üreaz salınımına iletilir. Serbest bırakılan üreaz, üreyi amonyağa hidrolize etmek için bir test çözeltisine aktarılır ve bu da klasik turnusol testi kullanılarak görselleştirilebilen bir pH artışına neden olur.

Bakteriyel test edeceği prensibi Şekil 1 &#39;de açıklanmıştır Test üç temel malzeme kullanır. Belirli bir bakteri, üreaz ve manyetik boncuklar ile aktive olan bir RNA klivaj DNAzim. DNAzim ilgi konusu bir bakterinin yüksek düzeyde spesifik tespit elde etmek için moleküler tanıma elemanı olarak kullanılır. Üreaz ve manyetik boncuk DNAzıme RNA klivaj aktivitesinin sinyal transdüksiyonunu elde etmek için kullanılır. Bu üreaz-DNAzim konjugatlarının ihtiva manyetik boncuk ol...

RNA parçalayan DNAzime, üreaz ve manyetik boncuklardan yararlanan modifiye bir turnusol testi kullanarak E. coli'nin kolorimetrik tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel tespit için basitleştirilmiş ve modifiye edilmiş bir turnusol testini göstermektir. Bu yöntem, E.coli ile aktive olan bir RNA-kesici DNA enziminin, E.coli'ye yanıt olarak renk değişimi oluşturmak için üreaz tabanlı bir sinyal iletim platformuyla nasıl eşleştirilebileceğini açıklamaktadır. Bu tekniğin iki temel avantajı, testin basitliği ve diğer analit duyarlı RNA-kesici DNA enzimlerine uygulanabilirliğidir.Prosedürü, McMaster Üniversitesi'ndeki Dr. Yingfu Li'nin laboratuvarından lisansüstü öğrenciler Seperh Manchehry ve Dingran Chang uygulamalı olarak gösterecekler. Reaktifleri ve tamponları metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 1 mg SMCC'yi 676 µL DMSO içinde çözerek bir süksinimidil 4-siklohekzan-1-karboksilat (SMCC) stok çözeltisi hazırlayın. Vorteksleyin ve kullanıma kadar buz üzerinde bekletin.Bir miligram üreazı bir mililitre 1x PBS içinde çözün ve kullanıma kadar buz üzerinde bekletin. Üreaz DNA'sını veya UrDNA'yı sentezlemek için, 2,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre 100 mikromolar LD1 ekleyin. Ardından, 140 mikrolitre çift distile su ve 40 mikrolitre 10x PBS ekleyip vorteksleyin.Ardından, 80.5 µL SMCC stok ve 159.5 µL DMSO ekleyin. Daha sonra, tekrar vorteksleyin ve kısa bir süre santrifüj etmek için bir benchtop santrifüj kullanın. Reaksiyonu bir inkübatörde veya ısıtıcı blokta 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından tüpe 200 µL 1x PBS, 60 µL 3 M sodyum asetat ve 1,5 mL soğuk %100 etanol ekleyin. Vorteksleyerek karıştırın ve reaksiyonu -20 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Çözeltiyi 20.000 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, süpernatanla uzaklaştırın ve peleti vakum altında kurutun. Kurutulmuş pelete 400 µL üreaz stok çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 saat boyunca inkübe edin. 200 µL ham konjugatı, önceden yıkanmış 100,000 moleküler ağırlık kesim limitli bir santrifüj filtre kolonuna aktarın.Kolonu 14,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Kalan 200 µL ham konjugatı kolona aktarın ve 14,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, kolonu çıkarın ve yeni bir 2 mL'lik mikrosantrifüj toplama tüpüne ters şekilde yerleştirin.Ters çevrilmiş kolonu ve tüpü 1,000 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin. Toplama tüpünü çıkardıktan sonra, konjugatların ek geri kazanımı için membranı yıkamak amacıyla santrifüj kolonuna 30 µL 1x PBS ekleyin. Kolonu tekrar ters çevirip toplama tüpüne geri yerleştirin.Kolonu 1,000 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüj edin. Kolonu çıkarın ve bertaraf edin. UrDNA'yı kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.E.coli ile aktive olan bir RNA-kesici DNAzim (EC1) ve UrDNA'yı manyetik boncuklar üzerine monte etmek için, manyetik boncuk stokunu iyice karıştırın ve 100 µL boncuk süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, boncukları izole etmek için tüpü bir manyetik raf tutucuya yerleştirin. Süpernatantı pipetleme yoluyla uzaklaştırın ve tüpe 150 µL bağlanma tamponu (BB) ekleyin.Tüpü tutucudan çıkarın ve boncukları homojen bir çözelti haline getirmek için tüpe dikkatlice vurun. Boncuklar BB süspansiyonunda olacak şekilde BB yıkama işlemini iki kez daha tekrarladıktan sonra, 10 µM EC1'den 10 µL ekleyin. Tüpe vurarak dikkatlice karıştırın.Çözeltiyi 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Boncukların agregasyonunu önlemek için tüpe her iki ila üç dakikada bir hafifçe vurun. Ardından, boncukları izole etmek için mikrosantrifüj tüpünü tekrar manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı pipetleme yoluyla uzaklaştırın.Ardından, boncukları üç kez yıkamak için 150 µL BB kullanın. Yıkama işlemi tamamlandığında, boncukları toplam 150 µL BB içinde süspande edin. Bu çözeltiye 15 µL UrDNA ekleyin ve örneği 45 °C'de iki dakika boyunca ısıtın, ardından çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve iki saat boyunca inkübe edin. Boncukları izole etmek için mikrofüj tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin ve süpernatantı pipetleme yoluyla uzaklaştırın.100 µL reaksiyon tamponu (RB) ekleyin, ardından tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları dikkatlice yeniden süspande edin. E.coli hücrelerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 100 µL RB ekleyip vorteksleyerek 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü ön yıkamadan geçirin. Ardından, tamponu dökün. Yıkanmış tüpe 15 µL birleştirilmiş EC1 ekleyin, ardından tüpü manyetik rafa yerleştirin ve süpernatantı aspire edin.Tüpü raftan çıkarın, 100 µL RB ekleyin ve manyetik boncukları dikkatlice yeniden süspanse edin. Boncukları RB ile iki kez daha yıkadıktan ve RB'yi uzaklaştırdıktan sonra, tüpe 10 µL E.coli örneği ekleyin ve tüpe hafifçe vurarak içeriği nazikçe karıştırın. Ardından, reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.İnkübasyonun ardından 90 µL çift distile su ekleyin ve tüpü manyetik rafa yerleştirin. Yaklaşık üç dakikalık manyetik ayırmanın ardından, süpernatantın 85 µL'sini dikkatlice 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çözeltiyi, manyetik boncuklardan herhangi birini almadan dikkatlice pipetlemek çok önemlidir.Bu boncuklar üreaz ile yüklenmiştir ve yalancı pozitif sinyal oluşturacaktır. 15 µL %0,04 Phenol red ve 100 µL substrat çözeltisi ekleyin. Ardından, renk değişimini kaydetmek için belirli zaman aralıklarında fotoğraflar çekin.Litmus testinin başlangıç rengi, 5.5'in altındaki bir çözelti pH değerini yansıtacak şekilde sarı olmalıdır. Gerektiğinde, litmus testinin başlangıç pH değeri, pH beş değerindeki bir millimolar sodyum asetat tamponu gibi zayıf bir tamponla ayarlanabilir. Bu şekil, DNAzim olarak E.coli ile aktive edilen RNA-kesici DNAzim EC1'in ve pH indikatörü olarak Fenol kırmızısının kullanıldığı bakteriyel litmus testi sonuçlarını göstermektedir.E.coli yokluğunda renk değişiminin gerçekleşmemesiyle gösterildiği üzere, EC1 yüksek düzeyde spesifiktir ve diğer bakterilere karşı minimal aktivite sergiler. Renk değişiminin yoğunluğu, hem DNAzyme aktivasyon adımında kullanılan E.coli hücre sayısına hem de üre hidrolizi adımı için tanınan süreye bağlıdır. Daha fazla E.coli hücresi daha güçlü bir renk değişimi ile sonuçlanır ve üre hidrolizi için ayrılan sürenin uzaması, daha az sayıda hücrenin tespit edilmesine olanak tanır.Bu grafik, el tipi bir pH metre kullanılarak izlenen pH değişimini göstermektedir. 10⁷ E.coli hücresinin varlığı, 10 dakika içinde pH değerinde üç birimlik kademeli bir artışla sonuçlanmıştır. Buna karşılık, aynı koşullarda E.coli yokluğu, tespit edilebilir bir pH değişimine neden olmamıştır.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, üreazın çok aktif olduğunu ve yetersiz yıkamanın veya kontaminasyonun yanlış pozitife yol açacağını unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, çevresel su kalitesinin test edilmesi gibi daha ilgili koşullarda E.coli testi yapmak için bu yöntem uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, E.coli testi için basit bir turnusol testinden nasıl yararlanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir. Bu testin, son derece tehlikeli olan patojenik E.coli'yi tespit etmek için kullanılabileceğini unutmayın. Patojenik bakteriler için herhangi bir test gerçekleştirmeden önce biyogüvenlik eğitimi almanız gerekmektedir.

colorimetric-detection-of-bacteria-using-litmus-test

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Öncelikli bakteriyel patojenlerin tespiti için basit bir yöntem, genetiği muhabiri faj kullanmaktır. Kendi özel konak türe özgü Bu muhabir faj, konak hücreleri için bioluminescent sinyal yanıt hızla uyum sağlama yeteneğine sahiptir. Burada, biz tespiti için muhabir faj kullanımını...

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Biz hızlı bakteri bulunması ve belirlenmesi için bir elektrokimyasal sensör test yöntem açıklanmaktadır. Tahlil, ribozomal RNA (rRNA) türe özgü dizileri için DNA oligonükleotid probları yakalama fonksiyonuna sahip bir sensör dizisi içerir. Yakalama prob ve yaban turpu peroksidaz bağlı DNA oligonükleotid dedektör prob ile hedef rRNA Sandwich melezleme ölçülebilir bir amperometrik akım üretir.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Bu videoda, laktat dehidrojenaz enzimi kullanılarak hücre lizatlarında laktat ölçümü için bir kolorimetrik test açıklanmaktadır. Bu enzim, NAD'nin tetrazolyum boyalarla reaksiyona giren NADH'ye dönüştürülmesiyle birlikte laktatı piruvata dönüştürür ve laktatı kantitatlamak için spektrofotometrik olarak ölçülebilen renkli bir ürün verir.

Test Numunelerinde Laktat Miktarının Belirlenmesi için Kolorimetrik Test

Bu video, bir DNAzime'i aktive eden bir E. coli biyobelirteçini içeren, RNA bağlantısının bölünmesine ve bir DNAzime-üreaz konjugatının ayrılmasına yol açan bir kolorimetrik E. coli algılama yöntemini göstermektedir. Sonraki bir kolorimetrik test, amonyak kaynaklı pH değişiklikleri yoluyla E. coli biyobelirtecini tespit eder.

Modifiye Turnusol Testi Kullanılarak Bakteriyel Bir Biyobelirteçin Kolorimetrik Tespiti

Bu video, farklı kümelere boyanmış karboksilatlı manyetik polistiren mikroküreler kullanan çoğullanmış kantitatif bakteri tespitini göstermektedir. Prosedür, boncuk-bakteri komplekslerinin oluşumunu, manyetik ayırmayı ve akış tabanlı analizi kapsar ve aynı reaksiyon kuyusunda birden fazla bakterinin hassas ve aynı anda miktar tayinini sağlar.

Boya Etiketli Manyetik Mikroküreler Kullanılarak Çoklanmış Kantitatif Bakteri Tespiti

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Ökaryotlar için görülenden farklı olarak, esas olarak, küçük boyutu olarak bakterilerde ayrıntılı membran depolarizasyon ve iyon konsantrasyonu değişiklikleri, ölçüm zor geleneksel yöntemler yapan çok az çalışma vardır. Burada, biz floresan teknikleri kullanılarak anlamlı Gram-pozitif bir patojen Streptococcus pneumoniae tür olayları izlemek için detay protokolleri.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Büyük hacimli tarımsal sularda gıda kaynaklı patojenlerin entegre konsantrasyon, zenginleştirme ve son nokta kolorimetrik tespitini içeren bir protokol burada sunulmaktadır.  Su, seçici veya seçici olmayan ortamlarla zenginleştirilmiş Modifiye Moore Swablarından (MMS) süzülür ve algılama, bakteriyel-gösterge kolorimetrik substratlarla gömülü kağıt bazlı analitik cihazlar (μPAD) kullanılarak gerçekleştirilir.

Kolorimetrik Algılama Paper-based<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Ve<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Tarım Su geniş hacimli

Burada, bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel motiliteyi tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemin temel avantajları, değerlendirilmesi kolay ve daha doğru olması ve özel ekipman gerektirmemesidir.

Bir renk reaksiyonuna dayalı bakteriyel hareketliliğin görselleştirilmesi

Öğrenin, E. coli tespiti için RNA-kesici DNAzim ve üreaz tabanlı renk değişimli turnusol testi yöntemini. Bu basit, hızlı platform nokta-bakım tanı için uyarlanabilir.

Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

Daha fazla video keşfet