Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

Bu deneyin genel amacı, bakteriyel tespit için basitleştirilmiş ve modifiye edilmiş bir turnusol testini göstermektir. Bu yöntem, E.coli ile aktive olan bir RNA-kesici DNA enziminin, E.coli'ye yanıt olarak renk değişimi oluşturmak için üreaz tabanlı bir sinyal iletim platformuyla nasıl eşleştirilebileceğini açıklamaktadır. Bu tekniğin iki temel avantajı, testin basitliği ve diğer analit duyarlı RNA-kesici DNA enzimlerine uygulanabilirliğidir.

Prosedürü, McMaster Üniversitesi'ndeki Dr. Yingfu Li'nin laboratuvarından lisansüstü öğrenciler Seperh Manchehry ve Dingran Chang uygulamalı olarak gösterecekler. Reaktifleri ve tamponları metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 1 mg SMCC'yi 676 µL DMSO içinde çözerek bir süksinimidil 4-siklohekzan-1-karboksilat (SMCC) stok çözeltisi hazırlayın. Vorteksleyin ve kullanıma kadar buz üzerinde bekletin.

Bir miligram üreazı bir mililitre 1x PBS içinde çözün ve kullanıma kadar buz üzerinde bekletin. Üreaz DNA'sını veya UrDNA'yı sentezlemek için, 2,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre 100 mikromolar LD1 ekleyin. Ardından, 140 mikrolitre çift distile su ve 40 mikrolitre 10x PBS ekleyip vorteksleyin.

Ardından, 80.5 µL SMCC stok ve 159.5 µL DMSO ekleyin. Daha sonra, tekrar vorteksleyin ve kısa bir süre santrifüj etmek için bir benchtop santrifüj kullanın. Reaksiyonu bir inkübatörde veya ısıtıcı blokta 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından tüpe 200 µL 1x PBS, 60 µL 3 M sodyum asetat ve 1,5 mL soğuk %100 etanol ekleyin. Vorteksleyerek karıştırın ve reaksiyonu -20 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Çözeltiyi 20.000 ×g'de ve 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, süpernatanla uzaklaştırın ve peleti vakum altında kurutun. Kurutulmuş pelete 400 µL üreaz stok çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 5 saat boyunca inkübe edin. 200 µL ham konjugatı, önceden yıkanmış 100,000 moleküler ağırlık kesim limitli bir santrifüj filtre kolonuna aktarın.

Kolonu 14,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Kalan 200 µL ham konjugatı kolona aktarın ve 14,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, kolonu çıkarın ve yeni bir 2 mL'lik mikrosantrifüj toplama tüpüne ters şekilde yerleştirin.

Ters çevrilmiş kolonu ve tüpü 1,000 ×g hızda iki dakika boyunca santrifüjleyin. Toplama tüpünü çıkardıktan sonra, konjugatların ek geri kazanımı için membranı yıkamak amacıyla santrifüj kolonuna 30 µL 1x PBS ekleyin. Kolonu tekrar ters çevirip toplama tüpüne geri yerleştirin.

Kolonu 1,000 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüj edin. Kolonu çıkarın ve bertaraf edin. UrDNA'yı kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.

E.coli ile aktive olan bir RNA-kesici DNAzim (EC1) ve UrDNA'yı manyetik boncuklar üzerine monte etmek için, manyetik boncuk stokunu iyice karıştırın ve 100 µL boncuk süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, boncukları izole etmek için tüpü bir manyetik raf tutucuya yerleştirin. Süpernatantı pipetleme yoluyla uzaklaştırın ve tüpe 150 µL bağlanma tamponu (BB) ekleyin.

Tüpü tutucudan çıkarın ve boncukları homojen bir çözelti haline getirmek için tüpe dikkatlice vurun. Boncuklar BB süspansiyonunda olacak şekilde BB yıkama işlemini iki kez daha tekrarladıktan sonra, 10 µM EC1'den 10 µL ekleyin. Tüpe vurarak dikkatlice karıştırın.

Çözeltiyi 30 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Boncukların agregasyonunu önlemek için tüpe her iki ila üç dakikada bir hafifçe vurun. Ardından, boncukları izole etmek için mikrosantrifüj tüpünü tekrar manyetik rafa yerleştirin ve süpernatanı pipetleme yoluyla uzaklaştırın.

Ardından, boncukları üç kez yıkamak için 150 µL BB kullanın. Yıkama işlemi tamamlandığında, boncukları toplam 150 µL BB içinde süspande edin. Bu çözeltiye 15 µL UrDNA ekleyin ve örneği 45 °C'de iki dakika boyunca ısıtın, ardından çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve iki saat boyunca inkübe edin. Boncukları izole etmek için mikrofüj tüpünü manyetik rafa geri yerleştirin ve süpernatantı pipetleme yoluyla uzaklaştırın.

100 µL reaksiyon tamponu (RB) ekleyin, ardından tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları dikkatlice yeniden süspande edin. E.coli hücrelerini metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 100 µL RB ekleyip vorteksleyerek 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünü ön yıkamadan geçirin. Ardından, tamponu dökün. Yıkanmış tüpe 15 µL birleştirilmiş EC1 ekleyin, ardından tüpü manyetik rafa yerleştirin ve süpernatantı aspire edin.

Tüpü raftan çıkarın, 100 µL RB ekleyin ve manyetik boncukları dikkatlice yeniden süspanse edin. Boncukları RB ile iki kez daha yıkadıktan ve RB'yi uzaklaştırdıktan sonra, tüpe 10 µL E.coli örneği ekleyin ve tüpe hafifçe vurarak içeriği nazikçe karıştırın. Ardından, reaksiyonu oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun ardından 90 µL çift distile su ekleyin ve tüpü manyetik rafa yerleştirin. Yaklaşık üç dakikalık manyetik ayırmanın ardından, süpernatantın 85 µL'sini dikkatlice 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Çözeltiyi, manyetik boncuklardan herhangi birini almadan dikkatlice pipetlemek çok önemlidir.

Bu boncuklar üreaz ile yüklenmiştir ve yalancı pozitif sinyal oluşturacaktır. 15 µL %0,04 Phenol red ve 100 µL substrat çözeltisi ekleyin. Ardından, renk değişimini kaydetmek için belirli zaman aralıklarında fotoğraflar çekin.

Litmus testinin başlangıç rengi, 5.5'in altındaki bir çözelti pH değerini yansıtacak şekilde sarı olmalıdır. Gerektiğinde, litmus testinin başlangıç pH değeri, pH beş değerindeki bir millimolar sodyum asetat tamponu gibi zayıf bir tamponla ayarlanabilir. Bu şekil, DNAzim olarak E.coli ile aktive edilen RNA-kesici DNAzim EC1'in ve pH indikatörü olarak Fenol kırmızısının kullanıldığı bakteriyel litmus testi sonuçlarını göstermektedir.

E.coli yokluğunda renk değişiminin gerçekleşmemesiyle gösterildiği üzere, EC1 yüksek düzeyde spesifiktir ve diğer bakterilere karşı minimal aktivite sergiler. Renk değişiminin yoğunluğu, hem DNAzyme aktivasyon adımında kullanılan E.coli hücre sayısına hem de üre hidrolizi adımı için tanınan süreye bağlıdır. Daha fazla E.coli hücresi daha güçlü bir renk değişimi ile sonuçlanır ve üre hidrolizi için ayrılan sürenin uzaması, daha az sayıda hücrenin tespit edilmesine olanak tanır.

Bu grafik, el tipi bir pH metre kullanılarak izlenen pH değişimini göstermektedir. 10⁷ E.coli hücresinin varlığı, 10 dakika içinde pH değerinde üç birimlik kademeli bir artışla sonuçlanmıştır. Buna karşılık, aynı koşullarda E.coli yokluğu, tespit edilebilir bir pH değişimine neden olmamıştır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde iki saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, üreazın çok aktif olduğunu ve yetersiz yıkamanın veya kontaminasyonun yanlış pozitife yol açacağını unutmamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, çevresel su kalitesinin test edilmesi gibi daha ilgili koşullarda E.coli testi yapmak için bu yöntem uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, E.coli testi için basit bir turnusol testinden nasıl yararlanılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir. Bu testin, son derece tehlikeli olan patojenik E.coli'yi tespit etmek için kullanılabileceğini unutmayın. Patojenik bakteriler için herhangi bir test gerçekleştirmeden önce biyogüvenlik eğitimi almanız gerekmektedir.