Drosophila Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve
October 6th, 2016
Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.
Bu protokolün genel amacı, genetik olarak tanımlanmış floresan işaretli klonları taşıyan drosophila göz-anten hayali disklerinin ve beyinlerinin nasıl inceleneceğini ve gen ekspresyonu değişikliklerini ve hücre istilasını görselleştirmek ve ölçmek için bunların nasıl işleneceğini göstermektir. Açıklanan prosedürler, genlerin ve epitel gelişiminin, homeostazın veya hastalığın rolü hakkında yeni bilgiler sağlamaya ve rekabetlerinin, telafi edici proliferasyonlarının veya klonlar arası birleşmelerinin altında yatan mekanizmaları incelemeye yardımcı olabilir. Çalışmanın temel avantajı, drosophila genetik mozaiklerinin derinlemesine nicel ve nitel analizi için uyarlanmış bir dizi protokol sunmamızdır.
Genel olarak, drosophila modeliyle yeni çalışan bireyler, göz-anten hayali diskini diğer hayali diskten tanıyamadıkları için zorlanırlar. Larva gövdesi içinde floresan işaretli klonları taşıyan göz-anten hayali diskin tanınmasını kolaylaştırmak için, ilk diseksiyonların floresan mikroskop altında yapılması önerilir. Bastırılabilir bir hücre markörü veya MARCM ile mozaik analizi, aksi takdirde fenotipik olarak vahşi tip bir bağlamda genetik olarak tanımlanmış klonal yamaların oluşturulmasını sağlar.
Gözsüz bir promotör tarafından tahrik edilen bir FLP, sarı bir gen ile işaretlenmiş bir durdurma kasetini çevreleyen iki FRT elemanı arasındaki rekombinasyonu katalize eder. DNA replikasyonundan sonra FLP, kardeş kromatitler üreten homolog kromozomlar arasında kardeş olmayan kromatitlerin değişimini katalize eder. Biri vahşi tip alel ve Gal80 baskılayıcısını, diğeri ise mutantı taşıyor.
Mitozda bunlar, biri homozigot mutant ve diğeri vahşi tip olmak üzere iki yavru hücre üretmek üzere ayrılır. Gal80 baskılayıcısının kaybı, mutantta GFP ekspresyonuna izin verirken, vahşi tip hücreler GFP negatif kalır. Deneye başlamak için, yiyeceğin yüzeyini kaplamak için PBS'yi sinek şişesine fışkırtarak mozaik larvaları hasat edin.
Daha sonra üst tabakayı bir spatula ile yumuşatın ve larva içeren yiyecek bulamacını bir petri kabına dökün. Larvaları yavaşça toplayın ve PBS ile doldurulmuş bir embriyo kabına aktarın. İmmün boyama için en az 20 larva ve tümör invazivliğinin ölçülmesi için 80 larva toplayın.
Kalan tüm yiyecekleri çıkarmak için larvaları PBS ile yıkayın. 8:16x büyütmede bir floresan stereo mikroskop kullanarak, vücutta rastgele GFP pozitif noktalar gösteren tüm leopar larvalarını tanımlayın ve atın. Kalan larvaları içeren tabağı PBS'de diseksiyona kadar buz üzerine yerleştirin.
Göz-anten hayali diskini stereo mikroskop altında incelemek için bir çift forseps kullanın ve larvaları başın arkasındaki vücut uzunluğunun yaklaşık 2 / 3'ü kadar nazikçe tutun. İkinci forseps çifti ile larva ağız kancalarını tutun ve vücuttan uzaklaştırın. Forseps kullanarak, ağız kancalarını üst üste binen kütikülden ve tükürük bezleri ve yağ gövdesi gibi yabancı dokulardan ayırın.
Alternatif olarak, ventral sinir kordonunu sağlam tutarak göz-anten diski beyin kompleksini hazırlamak için, vücudun ortasında bir larva kesmek için forseps kullanın. Arka yarıyı atın. Larva gövdesinin ön yarısını bir çift forsepsin uçlarıyla tutun, ardından ağız kancalarını ikinci çiftin ucuyla içe doğru iterek ve kütikülü ilk forseps çifti ile bunun üzerine yuvarlayarak larvayı ters çevirin.
Bağırsak, yağ gövdesi ve tükürük bezleri dahil olmak üzere tüm yabancı dokuları dikkatlice çıkarın. Ağız kancalarını kütikülden nazikçe çekin. Ventral sinir kordonundan kaslara ve epidermise uzanan aksonal çıkıntıları keserek ağız kancalarına bağlı göz-anten diski beyin kompleksini serbest bırakın.
Dokuyu aktarmak için, önce kalan vücut karkaslarını birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek bir P20 mikropipet ucunu kaplayın ve ardından diseke edilen dokuyu aktarmak için aynı ucu kullanın. Daha büyük göz-anten diski beyin komplekslerini aktarmak için, açıklığı büyütmek için P20 ucunu önceden kesin. Numuneleri, nütasyon sırasında oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 4 mikro litrelik %4 PFA fiksatifinde sabitleyin.
Daha sonra sabitleyiciyi çıkarın ve numuneleri PBST ile 10 dakika boyunca nütasyon ile üç kez yıkayın. Daha sonra, PBST'yi 500 mikro litre DAPI boyama solüsyonu ile değiştirin ve karanlıkta 15 dakika nutat edin. Dokuyu PBST ile 10 dakika boyunca bir kez yıkayın.
Diseksiyonu tamamlamak için, dokuyu PBS dolu bir cam tabağa geri aktarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. İki çift forseps kullanarak, optik sapları keserek invazivliğin ölçülmesi için kullanılacak beyinleri göz-anten disklerinden ayırır. Göz anten disklerini ağız kancalarından keserek serbest bırakın.
Abdüktif bir lam üzerine bir damla montaj ortamı yerleştirin ve forseps kullanarak sıvıyı ince bir tabaka halinde dağıtın. İnvazivliği ölçmek için, her genotip için en az 80 sabit sağlam beyni tek bir slayta yerleştirin. Dokuyu istediğiniz gibi düzeltin ve konumlandırın.
Bir lamel kenarına hafifçe dokundurun ve kabarcık oluşturmasını önlemek için forseps yardımıyla yavaşça indirin. Kenarlardaki fazla montaj ortamını emmek için bir laboratuvar mendili kullanın. Doku artık konfokal görüntüleme kullanılarak incelenebilir.
Puanlamanın tarafsız olması için tarafsız bir taraftan slaytları anonimleştirmesini isteyin. Ve slaytların en az iki araştırmacı tarafından bağımsız olarak değerlendirilmesini sağlayın. Genotipleri ancak puanlama tamamlandıktan sonra açıklayın.
Bir GFP filtre seti ile donatılmış bir floresan stereo mikroskop altında malignite derecesini değerlendirin. Çifte sayımı önlemek için daha önce görüntülenmiş olan beyinleri bir işaretleyici etiketleyerek etiketleyin. Floresan konfokal görüntüler, DAPI ile boyanmış malign RAS V12 karalama mutant GFP işaretli klonal tümörler taşıyan larvalardan diseke edilen beyinleri göstermektedir.
Paneller, dört farklı tümör invazivliği derecesini temsil eder. Yansız kantitasyon, JNK sinyalizasyonunun inhibisyonunun ve RAS V12'nin karalanmış bir klonunun tümör invazivliğini baskıladığını ortaya koydu. Kontrol göz-anten disklerinde, JNK'ye duyarlı TRE-DsRED raporlayıcı, antenden göz kısmına uzanan yalnızca dar bir hücre şeridini etiketler.
Buna karşılık, GFP pozitif malign klonal tümörlerde TRE-DsRED aktivitesi belirgin şekilde artmıştır. 8. günde, tümör hücreleri göz-anten disklerini aştı ve ventral sinir kordonuna yayıldı. İstilacı tümör hücreleri ayrıca çevre dokuya kıyasla artmış JNK aktivasyonu gösterdi.
JNK'yi bloke etmek, tümör klonlarında TRE-DsRED aktivitesini belirgin bir şekilde azaltırken, lazer yoğunluğunun arttırılması, klonlara komşu epitel hücrelerinde bir artış ortaya çıkardı. Ek olarak, bir hemolektin delta DsRED raportörü, kontrol göz-anten epitelinin girintilerinde bulunan birkaç hemosit kümesinin aksine, göz-anten ve beyin dokusunda biriken hemositlerin malign tümörlerden oluştuğunu gösterdi. JNK'nin inhibisyonu üzerine, ilişkili bağışıklık hücrelerinin sayısı önemli ölçüde azaldı.
Artmış tümör invazivliği, JNK aktivitesi ve hemosit infiltrasyonuna, diseke mozaik göz-anten disklerinden izole edilen toplam RNA kullanılarak QRTPCR ile belirlenen MMP1 mNRA'nın önemli ölçüde yukarı regülasyonu eşlik etti. Bir kez ustalaştıktan sonra, 60'tan fazla göz diski çifti ve beyin 30 dakika içinde incelenebilir. Bu prosedürü denerken, istenen genotiplerden yeterli sayıda larva üretmeyi unutmamak önemlidir.
RNA izolasyonu için tasarlanan numuneleri RNS'siz tutmak için diseksiyon sırasında hızlı ama hassas olun. Diseksiyon prosedürünü takiben, western blot, farklı genotipler arasındaki protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmek için immün boyamaya alternatif olarak kullanılabilir. Genetik mozaiklerin oluşturulması ve açıklanan prosedürlerle analiz edilmesi, aksi takdirde ölümcül mutasyonlar ve onkogen şirket mekanizmaları üzerine araştırma yapılmasını sağlar ve Bu videoyu izledikten sonra, göz-anten diskinin ve beyinlerin mozaik dokularının üçüncü instar larvalarından nasıl diseke edileceğini ve bunların immün boyama, transgenik ve port aktivitesinin görselleştirilmesi için nasıl işleneceğini iyi anlamalısınız, RNA ekstraksiyonu ve invazivliğin ölçülmesi.
PFA'nın yanı sıra fenol-kloroform ve DAPI'nin oldukça toksik olduğunu ve bu ajanlarla çalışırken her zaman koruyucu eldiven ve giysi giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, Drosophila göz-antenal imajinal diskleri ve beyinleri, gen ekspresyonu değişikliklerini ve tümör istilacılığını görselleştirmek ve kantitatif olarak belirlemek için nasıl ayrıştırılacağını gösterir. Genetik olarak tanımlanmış floresan işaretli klonları analiz etmek için kapsamlı bir protokol seti sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Genetik
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Drosophila, genetik mozaiklerin incelenmesi için bir model organizma olarak kullanılır.
- Göz-antenal imajinal disk, epitelyal gelişimi anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Floresan işaretler, spesifik klonların tanımlanmasına yardımcı olur.
- Gen rekabeti ve proliferasyonun anlaşılması, hastalık mekanizmalarına ilişkin bilgiler için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Drosophila dokularının ayrıştırılması için protokol sağlamak.
- Klonal tümörlerde gen ekspresyonu değişikliklerini görselleştirmek.
- Tümör istilacılığını ve hücresel etkileşimleri kantitatif ve kalitatif olarak belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Göz-antenal diskleri ve beyinleri elde etmek için üçüncü instar larvaların ayrıştırılması.
- İlk ayrıştırmalar için floresan mikroskopi kullanımı.
- Bastırılabilir bir hücre işaretçisi ile mozaik analizi (MARCM).
- Genetik mozaiklerin nicel ve nitel analizi.
Ana Sonuçlar
- Floresan işaretli klonal tümörlerin başarılı üretimi.
- Drosophila modelinde gen ekspresyonu değişikliklerinin görselleştirilmesi.
- Hücre istilacılığı ve rekabet mekanizmalarına ilişkin bilgiler.
- Epitelyal homeostaz ve hastalık hakkında gelişmiş anlayış.
Sonuçlar
- Protokollar, Drosophila'da genetik etkileşimlerin detaylı analizini sağlar.
- Floresan işaretler, klonal dinamiklerin çalışmasını kolaylaştırır.
- Bulgular, gelişimsel biyoloji ve hastalık mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The Drosophila imaginal disc tumor model provides a genetically tractable system for mechanistic de-risking of oncogenic pathways and tumor-stroma interactions in a whole-organism context. By enabling visualization and quantification of gene expression changes and cellular invasiveness in defined genetic mosaics, the approach supports target validation and phenotypic screening in early discovery. It offers a disease-relevant system for assessing mechanistic drivers of tumor progression with predictive confidence for downstream translational efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing gene expression changes in fluorescently marked clonal tumors.
- Scientific Value: Supports functional target validation through MARCM-generated mosaics that isolate mutant clones in wild-type tissue.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by quantifying tumor invasiveness and associated stromal responses such as hemocyte infiltration and MMP1 upregulation.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Provides a standardized dissection and fixation workflow for preparing eye-antennal discs and brains for immunostaining and transgenic reporter visualization.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of invasiveness through blinded scoring of blinded slides by multiple researchers, reducing cognitive bias.
- Operational Value: Supports RNA isolation from dissected tissues for gene expression profiling via qRT-PCR or genome-wide approaches.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links genetic manipulations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system modeling epithelial tumor progression.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by connecting JNK signaling inhibition to reduced tumor invasiveness and immune cell recruitment.
- Translational Value: Offers a platform for testing genetic or pharmacological modifiers of tumor-stroma interactions in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a scalable system for hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic readouts that inform lead identification and preclinical prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through visualization of transgenic reporters and antibody staining in defined genetic mosaics.
- Screening: Enables assay readiness via standardized tissue recovery, fixation, and staining protocols compatible with multiple transgenic lines and antibodies.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as invasiveness scores and gene expression levels that allow comparative analysis across genotypes.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by modeling tumor invasiveness and stromal engagement in a whole-organism context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying genetic interactions, oncogene cooperation, and tumor progression mechanisms across multiple larval stages and genotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tumor-stroma and genotype-phenotype relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dissection, fixation, and blinded quantification procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of oncogenic potency and microenvironmental engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on tumor aggressiveness and molecular markers of progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, fluorescent microscopy, and genetic mosaic techniques such as MARCM.
- Dependent on instrumentation including fluorescent and confocal microscopes, microtomes for slide preparation, and RNA isolation tools.
- Necessitates cross-team standardization for tissue dissection, staining, and scoring to ensure consistency across users and experiments.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different larval stages, genotypes, or transgenic reporters.
- Includes practical limitations such as the need for large larval numbers (≥80 for invasiveness quantification) and careful handling to avoid RNA degradation during dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Genetic Crosses and Collection of Third Instar Larvae
3:10
Dissection of Larvae
4:52
Fixing and Staining of Tissues
5:58
Tissue Mounting and Quantification of Tumor Invasiveness
7:10
Results: Visualization, Tumor Quantification, and Gene Expression
9:04
Conclusion
