bir İn Vitro Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Bu deneyin genel amacı, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçları incelemektir. Bu yöntem, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki doğrudan etkileşimin kan-beyin bariyeri bütünlüğünü ve geçirgenliğini nasıl etkilediği gibi nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin ana avantajı, T hücresi ve endotel hücre etkileşiminin hedeflenen modülasyonu üzerine bariyer fonksiyonunun otomatik, gerçek zamanlı değerlendirmesini mümkün kılmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, otoimmün CNS bozukluklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü bu tür hastalıkların patogenezinde çok önemli bir adım olan T hücresi aracılı kan-beyin bariyeri yıkımı hakkında bilgi sağlar. Bu yöntem, EAE sırasında deniz kan-beyin bariyeri özelliklerine odaklanır. Ancak, kırmızı veya insan kan-beyin bariyeri modellerinin yanı sıra diğer otoimmün CNS bozukluklarının çalışmalarına da uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, kombine primer endotel hücre kültürünün optimal zamanlaması ve T hücre aktivasyonu ile ilgili olası zorluklar nedeniyle mücadele edebilir. Bu yöntemi ilk olarak, multipl sklerozun bir hayvan modeli olan EAE sırasında farklı T hücresi aktivasyon seviyelerinin kan-beyin bariyeri özellikleri üzerindeki etkilerini araştırmak için yola çıktığımızda geliştirdik. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü T hücresi ve endotel hücresi ko-kültürlerinin kurulmasının öğrenilmesi zordur, çünkü oyuklar arasındaki T'deki ilk varyasyonların sonuçların daha sonra yanlış beyanlarına ihtiyacı olabilir.

Bu prosedüre başlamak için, MBMEC izolasyonundan sonraki beşinci günde, geçirgen kesici uçları, kesici uç başına 80 mikrolitre MBMEC kaplama solüsyonu ile önceden kaplayın. Onları üç saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. MBMEC kaplama çözeltisini eklerden çıkardıktan sonra, her bir oyuğa iki mililitre oda sıcaklığında PBS ekleyerek ve bir dakika sonra aspire ederek MBMEC'leri yıkayın ve ardından bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.

Daha sonra, oyuk başına 300 mikrolitrede% 0.05 Tripsin EDTA ekleyin ve beş ila on dakika inkübe edin. Daha sonra, tripsinizasyonu durdurmak için her bir oyuğa iki mililitre MBMEC ortamı ekleyin. Daha sonra, toplanan hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 700 kez g'de santrifüjleyin.

Sekiz dakika sonra, süpernatanı atın ve hücreleri puromisin içermeyen bir mililitre MBMEC ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri saymak için 90 mikrolitre% 0.04 tripan mavisi karıştırın. 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ile, cam kapak ile hemositometre arasına 10 mikrolitre karışım pipetleyin.

Ardından, ekleme başına 10 ila dördüncü hücreye iki kez veda edin. Her bir kuyucuğun alt bölmesine 810 mikrolitre MBMEC ortamı ekleyin ve TEER ölçümüne devam etmeye hazır olana kadar plakayı eklerle birlikte inkübatöre yerleştirin. CD4 pozitif T hücrelerini uyarmak için, 37 santigrat derecede üç saat boyunca istenen bir son konsantrasyonda saflaştırılmış anti-fare CD3 antikoru ile yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakayı önceden kaplayın.

T hücrelerini izole ettikten sonra, önceden kaplanmış plakayı PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, izole edilmiş T hücrelerine istenen son konsantrasyonda saflaştırılmış anti-CD28 antikoru ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, T hücrelerini bırakın ve iki ila üç gün boyunca 37 santigrat derecede bırakın.

TEER ölçümünü ayarlamak için, TEER cihazının 24 kuyulu modülünü laminer akış başlığına yerleştirin. Kapakları çıkarın ve forseps kullanarak MBMEC'li ekleri cihaza yerleştirin. Daha sonra, 810 mikrolitre taze ortamı modül kuyularının alt bölmesine pipetleyin, ek parça ile modül kuyusunun duvarı arasına dikkatlice ekleyin.

Bundan sonra, kapakları kapatın ve cihazı inkübatöre yerleştirin. Enstrümanı bilgisayara bağlayın. Ardından, cihaz denetleyicisini açın ve yazılımı açın.

Açılır pencerede, Yeni Ölçüm'ü seçin"TER'i göster'i işaretleyin ve Ccl'yi göster" kutularını işaretleyin. Ardından, başlat tuşuna basın. İlk ölçümü tamamladıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için Sonuçlar sekmesinde "tüm kuyuları kontrol et" seçeneğini seçin.

Ardından dosyayı kaydedin. Daha sonra, Ccl stabil olduğunda ve santimetre kare başına bir mikrofaraddan daha düşük olduğunda ve TEER maksimum seviyesine ulaştığında MBMEC'leri T hücreleri ile birlikte kültürlemek için zaman noktasını seçin. Mutlak TEER ve Ccl değerlerini dikkatlice inceleyin ve MBMEC'lerin yeterince birleşik tek tabaka geliştirmediği kuyuları, bu tür kuyuların işaretini kaldırarak hariç tutun.

Kuyulara sağ tıklayarak ve yeni ortalama kuyuya kuyu ekle'yi seçerek kuyuların geri kalanını gruplandırın"Açılır pencerede adlandırın ve gruplandırılacak tüm bireysel kuyular için aynısını yapın. Ardından, hepsinin ko-kültürden önce aynı başlangıç koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyuları kontrol edin. Deneme sekmesinde duraklat tuşuna basın.

Aleti kesin ve inkübatörden çıkarın. Ardından, laminer akış başlığındaki kapakları çıkarın. Daha sonra, ortamın bir kısmını üst kuyu bölmesindeki ek parçadan çıkarın.

150 mikrolitre ortamı dikkatlice pipetleyerek MBMEC'lere T hücreleri ekleyin. Ardından, cihazı yeniden bağlayın ve ölçüme devam et düğmesine basın. 24 saat sonra, deney sekmesinde durdur düğmesine basın ve dosyayı kaydedin.

Burada, MBMEC izolasyonundan beş gün sonra PECAM-1 ve Cldn-5'in immünofloresan boyamasındaki iğ şeklindeki morfoloji gösterilmektedir. Burada, T hücrelerinin eklenmesinden önce tek tek kuyucukların gruplandırılmasından önceki ve sonraki TEER ve Ccl değerleri verilmiştir. Bu kuyudaki MBMEC'ler diğer kuyulardaki kadar yüksek TEER geliştirmediği için deney için mavi eğri kullanılmamıştır.

Bu deneyde, 35 ila 55 spesifik CD4 pozitif T hücresi, beş gün boyunca antijene özgü bir şekilde uyarıldı. Naif T hücreleri ve proinflamatuar sitokinler, interferon gama ve TNF-alfa sırasıyla negatif ve pozitif kontrol olarak görev yaptı. Burada, T hücreleri aynı miktarda anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları tarafından uyarıldı ve üç gün boyunca kültürlenenler, sadece iki gün boyunca kültürlenen T hücrelerine kıyasla bariyer bozulması için daha büyük bir eğilim gösterdi.

Buradaki sonuçlar, uyarılmış T hücrelerinin süpernatantlarının değil, MBMEC'lerde önemli bir hasara neden olduğunu göstermektedir, bu da T hücreleri ile MBMEC'ler arasındaki doğrudan temasın bariyer bozulması için kritik olduğunu göstermektedir. Öte yandan, T hücre kültürüne granzim b inhibitörü iki eklemek, MBMEC bütünlüğünü büyük ölçüde geri kazandırdı ve sitolitik molekülün MBMEC hasarına ve ardından TEER'de azalmaya neden olan önemli bir oyuncu olduğuna işaret etti. Bu prosedürü denerken, T hücrelerinin ve endotel hücrelerinin ko-kültürünü ayarlamak için doğru zaman noktasını seçmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, immünofloresan mikroskobu, akış sitometrisi ve olasılık denemeleri gibi başka makaleler de kullanılabilir. Bu etkileşim, sıkı bağlantı molekülü ekspresyon geçirgenliğini ve T hücresi transmigrasyonunun derecesini nasıl etkiler? Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nöroimmünoloji alanındaki araştırmacıların farelerde CNS'nin otoimmün bozukluklarını keşfetmeleri için bir yol açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, kan-beyin bariyeri bütünlüğü ve geçirgenliği açısından aktive edilmiş T hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki doğrudan etkilerin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.