bir

Bu deneyin genel amacı, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim sonrası endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçları incelemektir. Bu yöntem, T hücreleri ile endotel hücreler arasındaki doğrudan etkileşimin kan-beyin bariyeri bütünlüğünü ve geçirgenliğini nasıl etkilediği gibi nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, T hücresi ve endotel hücresi etkileşiminin hedeflenmiş modülasyonu üzerine bariyer fonksiyonunun otomatik ve gerçek zamanlı değerlendirmesine olanak tanımasıdır.

Bu tekniğin etkileri, otoimmün MSS bozukluklarının tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü bu yöntem, söz konusu hastalıkların patogenezinde kritik bir adım olan T hücresi aracılı kan-beyin bariyeri yıkımı hakkında bilgi sağlamaktadır. Bu yöntem, EAE sırasındaki deniz kan-beyin bariyeri özelliklerine odaklanmaktadır. Ancak yöntem, kırmızı veya insan kan-beyin bariyeri modellerinin yanı sıra diğer otoimmün MSS bozuklukları üzerine yapılan çalışmalara da uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, kombine primer endotel hücre kültürü ve T hücresi aktivasyonunun optimal zamanlamasıyla ilgili olası zorluklar nedeniyle güçlük çekebilirler. Bu yöntemi ilk olarak, multipl sklerozun bir hayvan modeli olan EAE sırasında farklı T hücresi aktivasyon seviyelerinin kan-beyin bariyeri özellikleri üzerindeki etkilerini araştırmak için geliştirdik. T hücresi ve endotel hücresi ko-kültürlerinin kurulması, kuyucuklar arasındaki ilk T hücresi varyasyonlarının sonuçların yanlış temsil edilmesine yol açabileceği nedeniyle öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Bu prosedüre başlamak için, MBMEC izolasyonundan sonraki beşinci günde, geçirgen insertleri insert başına 80 µL MBMEC kaplama çözeltisi ile ön kaplamadan geçirin. Bunları 37 °C'de ve %5 CO₂ ortamında üç saat boyunca inkübe edin. MBMEC kaplama çözeltisini insertlerden çıkardıktan sonra, her bir kuyucuğa 2 mL oda sıcaklığında PBS ekleyerek ve bir dakika sonra aspire ederek MBMEC'leri yıkayın ve ardından bu prosedürü bir kez daha tekrarlayın.

Ardından, kuyucuk başına 300 µL olacak şekilde %0,05 Trypsin EDTA ekleyin ve beş ila on dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, tripsinizasyonu durdurmak için her kuyucuğa iki mL MBMEC ortamı ekleyin. Daha sonra, toplanan hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve örneği 4 °C'de, 8 dakika boyunca 700 ×g hızında santrifüjleyin.

Sekiz dakika sonra, süpernatantı dökün ve hücreleri puromisin içermeyen bir mililitre MBMEC besiyerinde yeniden süspanse edin. Hücreleri saymak için, 90 mikrolitre %0,04 trypan blue ile karıştırın. 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ile, karışımın 10 mikrolitresini cam lamel ile hemositometre arasına pipetleyin.

Ardından, insert başına iki x 10⁴ hücre ekleyin. Her kuyucuğun alt bölmesine 810 µL MBMEC medyumu ekleyin ve insertlerin bulunduğu plakayı, TEER ölçümüne geçmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin. CD4 pozitif T hücrelerini stimüle etmek için, yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakayı, istenen nihai konsantrasyonda saflaştırılmış anti-fare CD3 antikoru ile 37 °C'de üç saat boyunca ön kaplamaya tabi tutun.

T hücrelerini izole ettikten sonra, önceden kaplanmış plakayı iki kez PBS ile yıkayın. Ardından, izole edilen T hücrelerine istenen son konsantrasyonda saflaştırılmış anti-CD28 antikoru ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra, T hücrelerini ekim yapın ve iki ila üç gün boyunca 37 °C'de bekletin.

TEER ölçümünü kurmak için, TEER cihazının 24 kuyucuklu modülünü laminer akışlı çekerlüğe yerleştirin. Kapakları çıkarın ve MBMEC içeren insertleri, penset kullanarak cihaza yerleştirin. Ardından, taze ortamdan 810 µL miktarını, insert ile modül kuyruğunun duvarı arasından dikkatlice ekleyerek modül kuyruklarının alt bölmesine pipetleyin.

Ardından, kapakları kapatın ve cihazı inkübatöre yerleştirin. Cihazı bilgisayara bağlayın. Sonra, cihaz kontrol ünitesini açın ve yazılımı başlatın.

Açılır pencerede, "New Measurement" (Yeni Ölçüm), "Check show TER" (TER gösterimini kontrol et) ve "show Ccl" (Ccl göster) kutucuklarını seçin. Ardından başlat düğmesine basın. İlk ölçüm tamamlandıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için Results (Sonuçlar) sekmesinden "check all wells" (tüm kuyucukları kontrol et) seçeneğini belirleyin.

Ardından, dosyayı kaydedin. Sonraki adımda, Ccl değerinin stabil olduğu, 1 µF/cm²'den düşük olduğu ve TEER değerinin maksimum seviyeye ulaştığı zamanda, MBMEC'lerin T hücreleri ile birlikte kültürlemesi (ko-kültür) için zaman noktasını seçin. Mutlak TEER ve Ccl değerlerini dikkatlice inceleyin ve MBMEC'lerin yeterince konfluen tek tabakalar oluşturmadığı kuyucukların işaretini kaldırarak bu kuyucukları hariç tutun.

Kuyucukların üzerine sağ tıklayıp "yeni ortalama kuyucuğa kuyucuk ekle" seçeneğini belirleyerek geri kalan kuyucukları gruplandırın. Açılır pencerede buna bir isim verin ve gruplandırılacak tüm bireysel kuyucuklar için aynı işlemi tekrarlayın. Ardından, ko-kültür öncesinde hepsinin aynı başlangıç koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyucukları kontrol edin. Deney sekmesinde duraklat düğmesine basın.

Cihazın bağlantısını kesin ve inkübatörden çıkarın. Ardından, kapakları laminer akış kabininde çıkarın. Sonrasında, üst kuyu bölmesindeki insertten bir miktar ortamı alın.

150 µL besiyerini dikkatlice pipetleyerek T hücrelerini MBMEC'lere ekleyin. Ardından, cihazı tekrar bağlayın ve ölçüme devam et düğmesine basın. 24 saat sonra, deney sekmesindeki durdur düğmesine basın ve dosyayı kaydedin.

Burada, MBMEC izolasyonundan beş gün sonra PECAM-1 ve Cldn-5 immünofloresan boyamasındaki iğ şeklinde morfoloji gösterilmektedir. T hücreleri eklenmeden önce, tekil kuyucukların gruplandırılmasından önceki ve sonraki TEER ve Ccl değerleri burada yer almaktadır. Bu kuyucuktaki MBMEC'ler diğer kuyucuklar kadar yüksek bir TEER geliştirmediği için mavi eğri deneyde kullanılmamıştır.

Bu deneyde, 35 ila 55 adet spesifik CD4 pozitif T hücresi, beş gün boyunca antijene özgü bir şekilde stimüle edilmiştir. Naif T hücreleri ve proenflamatuar sitokinler olan interferon gama ve TNF-alfa, sırasıyla negatif ve pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Burada T hücreleri aynı miktarda anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile stimüle edilmiş olup, üç gün boyunca kültüre edilen hücreler, yalnızca iki gün kültüre edilen T hücrelerine kıyasla bariyer bozulmasına karşı daha yüksek bir eğilim göstermiştir.

Buradaki sonuçlar, süpernatantlarının değil, uyarılmış T hücrelerinin MBMEC'lerde önemli bir hasara yol açtığını göstermekte olup, T hücreleri ile MBMEC'ler arasındaki doğrudan temasın bariyer bozulması için kritik olduğunu belirtmektedir. Öte yandan, T hücresi kültürüne granzyme b inhibitörü iki eklenmesi, MBMEC bütünlüğünü daha büyük oranda geri kazandırmış ve sitolitik molekülün MBMEC hasarına ve ardından TEER değerindeki düşüşe neden olan önemli bir faktör olduğuna işaret etmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu deney uygun şekilde gerçekleştirilirse 12 günde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, T hücreleri ve endotelyal hücrelerin ko-kültürünü kurmak için doğru zaman noktasının seçilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Bu prosedürü takiben, immünofloresan mikroskobi, akış sitometrisi ve olasılık analizleri gibi diğer deneyler uygulanabilir. Bu etkileşimin sıkı bağlantı molekül ekspresyon geçirgenliğini ve T hücresi transmigrasyon düzeyini nasıl etkilediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla bu yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nöroimmünoloji alanındaki araştırmacıların farelerde MSS'nin otoimmün bozukluklarını keşfetmelerine olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, aktive edilmiş T hücreleri ile endotel hücreleri arasındaki doğrudan etkilerin kan-beyin bariyeri bütünlüğü ve geçirgenliği açısından nasıl değerlendirileceği konusunda kapsamlı bir fikre sahip olmalısınız.