Name: bir İn Vitro Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Öğrenin, empedans spektroskopisi kullanarak T hücre-endotelyal hücre etkileşimlerinin kan-beyin bariyeri bütünlüğü üzerindeki etkilerini incelemeyi. Bu yöntem, nöroimmünolojide otoimmün MSS bozukluklarının patogenezi hakkında gerçek zamanlı bilgi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz TEER ölçümlerine ilişkin yararlı tartışmalar için Annika ENGBERS ve mükemmel teknik destek için Frank Kurth ve Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) minnettarız. Bu çalışma, HW ve LK, CRC TR128, için SFB1009 proje A03 A08 projeleri Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir; Z1 ve B01 LK ve LK HW ve (Münster Tıp Fakültesi) Klinik Araştırma Disiplinlerarası Merkezi hibe sayısı Kl2 / 2015/14 için.

hayvan bakımı Alman kurallarına göre tüm deneyler için, fareler yetiştirilmiş ve Münster University merkezi bir hayvan tesisine spesifik patojenden serbest durumlar altında tutulur. Bütün deneyler hayvan deneylerinin etik komitenin kurallarına göre yapılır ve Kuzey Ren-Vestfalya, Almanya (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217) yerel otoriteler tarafından kabul edildi. 1. MBMEC İzolasyon ve Kültürü Not: Daha önce şu değişiklikler detaylı 14&#39;de anlatıldığı gibi MBMECs izole: <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) 20 yetişkin C57BL / 6 fareler kurban ve kalp ve solunum arrest araştırarak onların ölümünü onaylayın. </li><li> % 70 etanol ile fare durulayın ve makas kullanarak başını kesmek; forseps ve makas kullanılarak kafa derisi çıkarın. foramen magnum başlayarak, kafatasının sol ve sağ tarafında kesiler olun. onun kuyruk tarafı ve tak gelen kafatası kaldırınforseps ile beyin dışarı e. </li><li> Laminer akış kaputu altında, sadece korteks tutarak, bir Petri kabındaki beyin yerleştirin ve beyin sapı, beyincik ve talamus kaldırmak için steril forseps kullanabilir. NOT: Bir mikroskop kullanımı, bu herhangi bir aşaması için gerekli değildir. </li><li> Steril Western lekeleme bir kağıt parçası üzerine korteksi yerleştirin ve meninks artık görünür olana kadar forseps ile yavaşça yuvarlayın. </li><li> (Protokol 14 Aşağıdaki) mekanik ve enzimatik sindirimden sonra, uzun, steril bir iğne ve 5 mi piston kullanılarak yoğunluk gradyanı endotel hücreleri toplamak. Endotel hücreleri eritrositler ile kırmızı halka üzerinde bir karanlık bir tabaka olarak görünür. Yeni 50 mi santrifüj tüpe bu katmanın devri 20-25 mi; DMEM ile tüp kontör. </li><li> Yıkama 14 iki tur sonra, puromisin içeren MBMEC ortamında (4 ug / ml), 6 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 24 oyuklu plaka altı kaplanmış oyuklarına üzerine onları tohum; bir dokuda onları terk37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 kültür inkübatörü üç gün (buradan itibaren &quot;kuluçka&quot; olarak adlandırılır). NOT: MBMEC kaplama çözeltisinin ayrıntılar için Malzemeler Tablosuna bakınız. </li><li> Puromisinin olmayan, taze MBMEC ortam, her sıra için, 1 ml ilave edilerek orta değiştirme; iki gün daha geri 37 ° C ve% 5 CO2 de tabak koydu. </li></ol> 2. Hasat MBMECs <ol><li> MBMEC izolasyondan sonra Beşinci günde MBMEC kaplama solüsyonu ile ön kaplama geçirgen eklerde: uç başına çözeltisi 80 ul ilave edin ve 3 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de bırakmak ve% 5. </li><li> Dikkatle kaplama çözüm pipet ve 30 dakika boyunca ekler hava kurumaya bırakın. orta yıkamak MBMECs kullanılarak plaka her oda sıcaklığında 2 ml (RT) PBS ilave et; bu adımı tekrarlayın. % 0.05 tripsin-EDTA (oyuk başına 300 ul) ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca inkübatör plaka bırakın. </li><li> durdurmak için her bir oyuğa MBMEC orta 2 ml ilave edilirtrypsinization. 15 ml santrifüj tüpüne hücreler toplandı aktarın ve 4 ° C &#39;de 8 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj. Süpernatantı atın ve Puromisinin olmadan MBMEC orta 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Hücreleri saymak; % 0.04 tripan mavi 90 ul (hücre 10x seyreltme) hücre süspansiyonu 10 ul karıştırın. Pipet cam kapak ve hücre sayım odasına (hemositometre) arasındaki bu karışımı 10 ul. odanın (N), dört çeyrek Tripan Mavisi içermeyen hücrelerin sayısı ve sayılan hücrelerin (N &quot;) &#39;nin ortalama sayısını belirlemek aşağıdaki gibidir: K&#39; = K / 4. </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak (10 6 hücre / ml), hücre konsantrasyonu hesaplanır: C = N x 10 4 hemasitometre boyutlarıyla verildi ve 10 adım 2.4 seyreltme faktörüdür 10 x 10 4,. </li><li> Tohum uç başına 260 ul&#39;lik bir hacim içinde 2 x 10 4 hücre. her bir alt bölmeye MBMEC ortamının 810 ul ekle. bölüm 4 ile devam etmek için hazır olana kadar inkübatör ekler ile plaka koyun. NOT: Üst ve alt bölüm için hacimleri insert spesifik ve tüm 24-kuyu biçimleri için işe yaramaz. </li></ol> 3. CD4 + T hücre izolasyonu ve Uyarım <ol><li> CD4 + T hücre Isolation <ol><li> CO 2 inhalasyon yoluyla (6-8 haftalık) bir yetişkin fare Kurban ve kalp ve solunum arrest ascertaining ederek ölüme onaylayın. </li><li> Temiz bir diseksiyon gemide sırtında fare yerleştirin ve% 70 etanol ile durulayın; dalak ve lenf nodları (inguinal, koltuk altı, brakiyal ve rahim ağzı) periton açıp kaldırmak için steril makas ve forseps kullanabilir; Son olarak, buz üzerinde 5 ml PBS içeren 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku aktarın. </li><li> Laminer akış Kaputun altında, üstünde bir 70 mikron hücre süzgecinden ile 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne doku ile PBS boşaltılarak doku transferi; homojenleştirmeksüzgecinden 1 ml pistonu ile bastırarak dokusudur. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj bunu 30 ml ekleyin. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 10 ml tekrar süspansiyon hücreleri. tüp FACS tampon diğer 20 ml ekleyin, 40 mikron hücre süzgecinden süspansiyon filtre. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de o santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve FACS tampon 500 ul hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Fare CD4 manyetik mikro boncuklar 20 ul ekle karıştırın ve 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de FACS tamponu ve santrifüj bunu 25 mL ekleyin. </li><li> Bu süre zarfında, mıknatıs bir LS ayırma sütunu yerleştirin ve FACS tamponu 3 ml ile durulayın. Süpernatant atılır ve FACS tamponu, 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> sütun hücreleri ekleyin. üç kez FACS tamponu 3 ml sütun yıkayın. mıknatıstan sütunu kaldırmak ve yeni bir 15 ml merkezkaç üzerine yerleştirinfugation tüp. FACS tampon 5 ml ekleyin 5 dakika 4 ° C için 500 xg&#39;de sütun piston ve santrifüj onu etiketli hücreleri yıkayın. </li><li> Süpernatant atılır ve T hücre ortamının 3 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Oyuk başına ortam 100 ul 2.4 ve tohum 1 x 10 5 hücre tarif edildiği gibi hücre sayımı. </li></ol></li><li> CD4 + T hücre uyarımı <ol><li> Poliklonal CD4 + T hücre uyarımı <ol><li> Ön kaplama, istenen nihai konsantrasyonda saflaştınlmış anti-fare CD3 antikoru PBS (klon 145-2C11), bir yuvarlak dipli 96 oyuklu plaka. Örneğin, 1 ug / ml&#39;de α-CD3 ile tam plaka ön kaplama için, PBS, girdap, 5 ml antikor 10 ul (stok konsantrasyon = 0.5 mg / ml) karıştırmak ve karışımın 50 ul iyi çok kanallı pipet ile her. </li><li> 3 saat inkübatörde plaka bırakın. T hücrelerinin izole edilmesi sonra PBS ile iki kez önceden kaplanmış plakayı yıkayın. (Klon saflaştırılmış anti-CD28 antikor ekleyinArzu edilen bir nihai konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri (kadar 37.51), örneğin, 1 ug / ml); iyice karıştırın. T hücrelerini Tohum ve iki ya da üç gün boyunca inkübatör onları bırakın. </li></ol></li><li> Dendritik hücreler (DC&#39;ler) ile antijene özgü CD4 + T hücresi uyarımı Not: DCler antijen sunan hücreler (APC&#39;ler) olarak kullanılması halinde, bu özel durumlar dışında, T hücresi izolasyon Protokolü izleyin: <ol><li> dalak homojenize önce, 0.5 mg / ml PBS içinde kollajenaz tip Ia 1 ml enjekte ve 15 mi santrifüj tüpe aktarın. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C sıcaklıkta su banyosu içinde inkübe edin. PBS ile yıkandıktan sonra, FACS tampon pelet tekrar süspansiyon ve 20 fare CD11c, manyetik mikro boncuklar ul yerine CD4 mikro ekleyin. </li><li> MS ayrımı kolonu ve uygun hacimlerde: FACS tampon 1 ml kolon durulama; FACS tampon 1 ml ve tekrar süspansiyon Hücreler, FACS tamponu üç kez 1 ml sütun yıkayın. </li><li> ilanDCler (örneğin, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) aa 35-55 20 de ug / ml) için tercih edilen bir D antijen, iyice karıştırın ve tohum 5 x 10 4 hücre T hücre kültür ortamında 100 ul başına 96 yuvarlak Alt- iyi. </li><li> Protokol T hücre izolasyonu tarif edildiği gibi, sonunda 96 yuvarlak dipli-oyuk başına T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleyin. </li></ol></li><li> B hücreleri antijen-spesifik CD4 + T hücresi uyarımı NOT: B hücreleri APC &#39;olarak kullanılması halinde, bu istisnalar, T hücre izolasyonu için Protokolü izleyin: <ol><li> Olan B hücreleri (B hücreleri, özellikle MOG 35-55 tanır, örneğin, IgH MOG (Th) fareler) antijen spesifik transgenik farelerden dalak kullanın. </li><li> (TCR MOG (2B2) fareler arasında, örneğin) antijen-spesifik T hücreleri kullanır. Fare CD19 manyetik mikro boncuklar yerine CD4 mikro 20 ul ekleyin. </li><li> B cel için tercih edilen antijen ekleLS (örneğin, 20 ug / ml&#39;de MOG 35-55), 96-yuvarlak dipli oyuklu her B hücre kültür ortamında 100 ul 5 x 10 4 hücrelerini karıştırın ve tohum. </li><li> Her T hücre kültür ortamında 100 ul 1 x 10 5 T hücrelerini ekleme 96 yuvarlak dipli çukurlu T hücresi izolasyon Protokolü hazırlanır. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Kurma ve TEER Ölçümü Sahne <ol><li> Laminer akış kaputun altında TEER aletinin 24 kuyu modülünü yerleştirin. forseps kullanarak enstrüman MBMECs ile kapakları ve yer ekler çıkarın. </li><li> Modül kuyu alt bölmesine taze ortam 810 ul pipet: uç ve de modülün duvarı arasında dikkatli bir şekilde ekleyin. </li><li> kapaklarını kapatın ve inkübatör aleti koyun. kendi bilgisayarına aleti bağlayın; Gösterge denetleyicisi açmak ve yazılımı açın. </li><li> Pop-up pencerede &#39;yeni ölçüm&#39; seçeneğini seçin. Check &#39;şov TEER&#39; ve &#39;gösteri CCI&#39; kutuları; tuşuna basın &#39;start&#39;. İlk ölçüm tamamladıktan sonra, tüm TEER ve Ccl değerlerini görmek için &#39;sonuçları&#39; sekmesinde &#39;tüm kuyuları kontrol&#39; seçeneğini seçin. </li><li> &#39;Dosyanızın adı&#39;&gt; Farklı kaydet&gt; Dosya: Dosyayı kaydedin. NOT: TEER ve Ccl sürekli olarak, otomatik bir şekilde ölçülür olarak, üç ila beş günlük bir süre boyunca değerlerini izler. hücre canlılığı, optimal olmadığı sürece TEER artış eksikliği ile gösterildiği gibi orta değiştirme gerekli değildir. </li><li> Ccl istikrarlı ve daha düşük 1 mF / cm 2 ve TEER maksimum seviyeye ulaştığında T hücreleri ile MBMECs kültür eş zamanlı noktasını seçin. </li><li> Dikkatle mutlak TEER ve Ccl değerlerini incelemek ve MBMECs bu tür kuyular işaretini kaldırarak konfluan yeterli mono tabakaları gelişmemiş olan kuyular hariç. </li><li> Grup kuyuların kalanı: Bir kuyu üzerinde sağ tıklayın ve &#39;yeni ortalama kuyu iyi eklemek&#39; seçeneğini seçin. namPop-up pencerede e; tüm bireysel kuyuları gruplandırılmış olması için de aynı şeyi. </li><li> hepsi ko-kültür önce aynı başlangıç ​​koşullarına sahip olduğunu doğrulamak için tüm ortalama kuyu kontrol edin. Bazı önemli ölçüde farklı mutlak TEER değerlere sahip veya TEER eğimli veya standart hatalar çok büyükse, gruplama kokan. NOT: Kuyular optimal gruplama içinde ve deney grupları arasında hem TEER değerlerinde minimum varyasyon sağlar. </li><li> &#39;Deney&#39; sekmesinde, basının &#39;pause&#39;, enstrüman ayırın ve inkübatör dışına götürün. Laminer akış kaputun altında kapaklarını çıkarın. </li><li> Hazırlanan önceden aktive arzu edildiği gibi, veya belirli sitokinler, antikorlar ya da diğer maddeler olmadan ve / veya naif T hücreleri: hazırlanmış T saflaştırılmıştır mix NA / LE sıçan anti-fare IFN-γ antikoru (klon XGM1.2): Örnek hücreler, TEER aygıtının oyuk başına 20 ug / ml&#39;de. NOT: Bu Granzim B inhibitörü olarak maddeler kullanıldığında, bunlar, birT hücresi stimülasyon başında olan T hücre kültürüne dded: örneğin, Granzim B inhibitörü II (Calbiochem) DMSO içinde 10 mM&#39;lik bir son konsantrasyonda izole edilmiş T hücreleri ile karıştırılır. Daha fazla bilgi için malzemeler ve donatım bakın. </li><li> Ovülden orta (üst kuyu bölmesi) bazı kaldırın: (Bu MBMEC tek tabaka rahatsız olabilir gibi tüm orta kaçınılmalıdır kaldırma), örneğin dikkatlice 150 ul dışarı pipetle. </li><li> Dikkatli bir şekilde 2 x 10 5 hücre / parçasını içeren ortam 150 ul pipetleme MBMECs T hücrelerinin ekleyin. NOT: Önceden aktive T hücreleri hasat, yalnızca, Tripan Mavi-serbest hücreleri patlatma saymak. </li><li> kapaklarını kapatın ve tekrar inkübatör cihazı yerleştirin. enstrüman ve basın &#39;özgeçmiş ölçümü&#39; yeniden bağlayın. ve &#39;deney&#39; sekmesinde 24 saat, basın &#39;dur&#39; sonra dosyayı (Dosya&gt; Kaydet) kaydedin. </li></ol> 5. Veri Aktarma ve İstatistiksel Analiz <ol><li>Dosya&gt; Dışa Aktar&#39;ı seçerek sonuçları ihracat. </li><li> Pop-up pencere &quot;ayarları&quot; sekmesinde, &quot;alan sınırlayıcı&quot; seçeneğinde &quot;ondalık ayracı&quot; seçeneğinde &quot;.dot&quot; ve &quot;sekme&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;İhracat sonuçları&quot; sekmesinde, dosya adı tüm kuyuları ihraç edilecek kontrol ve &quot;verileri seçmek&quot; seçeneğindeki &quot;teer&quot; ve &quot;Ccl&quot; onay kutularını. </li><li> Basın &quot;ihracat verileri,&quot; aktarılan dosyayı açın ve bir elektronik tabloya veri kopyalama. </li><li> ko-kültür önceki son zaman noktasında Set TEER ve Ccl değerleri% 100 ve diğer tüm için buna göre değerleri değiştirmek: (Her çalışma (ölçüm için verilen TEER ve Ccl değerleri ile, her tekrarında sıralama kriteri:)) ihraç veri normalleştirmek &#39;% 100&#39; vadede göreceli çalışır. </li><li> ayrı ayrı kuyuların kullanılarak ve her tedavi grubu için ortalama standart hata gösteren bir grafik oluşturmak için bir seçim yazılımı normalleştirilmiş verileri kopyalama. </li><li> Pseçim istatistiksel yazılımı kullanarak, çoklu karşılaştırmalar için bir Bonferroni düzeltmesi İki yönlü ANOVA istatistik testi erform. </li></ol>

I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl ve L. Klotz'un açıklayacak hiçbir şeyi yok. H.-J. Galla, otomatik hücre monitörü üreticisi nanoAnalytics GmbH'nin bilimsel danışmanıdır.

tarif edilen protokol birkaç adım başarılı deney için gereklidir. Başlangıç ​​MBMEC izolasyonu ve kültürü sırasında, çalışma mantar sporları, bakteri veya hücre kültürünün bulaşmasını önlemek için, mümkün olduğu kadar, steril koşullar altında gerçekleştirilir çok önemlidir. EC saf bir kültür elde etmek için, bir EC hayatta kalmasını sağlayan, ilk üç gün puromisin içeren ortam, ancak diğer hücre türleri (özellikle perisitler) 41,42 kullanılması tavsiye edilir. özel dikkat gösterilmesi gereken bir diğer önemli ...

3 -, kan-beyin bariyeri, merkezi sinir sistemi (MSS) 1 sistemik dolaşıma ayırır. Bu hücrelerin serbest dolaşımını ve suda çözünen moleküllerin difüzyon engeller ve patojenler ve potansiyel olarak zararlı maddelerden koruyan beyin fiziksel bir engel oluşturur. bariyer fonksiyonuna ek olarak, BBB nöronal doku düzgün işleyişini sağlayan beyin parankimi, oksijen ve besin iletimini sağlar. BBB fonksiyonel özellikleri son derece son derece uzmanlaşmış EC ana yapı elemanı olmak üzere, hücresel ve hücresel olmayan bileşenleri tarafından düzenlenir. BBB EC sıkı birleşme (TJ) kompleksleri, fenestrasyonlar eksikliği, aşırı düşük pinocytic aktivitesi ve kalıcı olarak aktif taşıma mekanizmaları varlığı ile karakterize edilir. endotel, astrositik uç ayak ve = ilişkili par katıştırma Diğer BBB bileşenleri AK bazal membran, perisitlerenchymal bazal membran da bbb 2,4 geliştirilmesi, bakım ve işlevine katkıda - 6 ve birlikte nöronlar ve mikroglia ile merkezi sinir sistemi 7 doğru çalışmasını sağlayan nörovasküler birimi (NVU) meydana - 9. Bu gibi nörodejeneratif, enflamatuar veya bulaşıcı hastalıklar gibi nörolojik hastalıklar, çeşitli, BBB fonksiyonu 2,5,10 ele almaktadır. TJ kompleksleri ve moleküler taşıma mekanizmaları düzensizliği BBB geçirgenliği, lökosit ekstravazasyonu, enflamasyon ve nöronal hasarı sebep olur. Böyle patofizyolojik koşullarda BBB özelliklerini incelemek amacıyla, çeşitli in vitro BBB modelleri 9,11,12 kurulmuştur. Birlikte bariyer bütünlüğünün, geçirgenlik yanı sıra taşıma mekanizmaları değişiklikleri değerli bilgiler sağlamıştır. Bu modeller, insan, fare, sıçan, domuz veya b endotel hücrelerini kullanırKoyun kökenli 13-18; 25 - primer endotel hücreleri ya da hücre hatları, in vivo 19 daha yakından BBB taklit etmek için perisitler ve / veya astrositler ile tekli kültür olarak ya da birlikte kültürlenir. Son yıllarda, endotel elektrik direnci (TEER) ölçümü endotel bariyer özelliklerinin 26,27 değerlendirmek için yaygın olarak kabul gören bir araç haline gelmiştir. TEER hücre tek tabaka boyunca iyon akı empedansı yansıtan ve onun azalma tehlikeye endotel bariyer bütünlüğünün ve dolayısıyla artan geçirgenliği hassas bir ölçümünü sağlar. 30 - Çeşitli TEER ölçüm sistemleri Epitelyal Voltohmmeter (EVOM), elektrik Hücre alt-tabaka empedansını algılayarak, (ECIS) ve gerçek zamanlı hücre analizi 15,28 dahil olmak üzere geliştirilmiştir. TEER bitişik EC arasındaki iyon akımının (paraselüler yol) direnç gösterir ve doğru orantılıdırbariyer bütünlüğü. Empedans spektroskopisi 27,31 yılında, karmaşık toplam empedansı (Z) CCL ölçerek bariyer bütünlüğünün hakkında ek bilgi sağlar, hangi ölçülür. CCL hücre zarı (transsellüler yol) üzerinden kapasitif akımı ile de ilgilidir: hücre katmanı zarın her iki tarafında ücretleri ayırma eşdeğer elektrik devresinde bir kapasitör gibi davranır ve ters bariyer fonksiyonunun orantılıdır. geçirgen ekler üzerinde yetiştirilen zaman, EC, uygun çoğalırlar ve mikro gözenekli membran yayıldı. Bu (kendisi bir kondansatör gibi davranır) ve minimal seviyeye ulaşana kadar kapasitans bir azalmaya yol açar ucun arka kapasitif akımını direnç gösterir. Bu TJ kurulması takip eder komşu EC arasındaki boşluk kapalı olduğu mühür kompleksleri. Bu parasellüler yoldan iyon akı kısıtlar ve onun plato ulaşana kadar TEER arttırır. inflamatuar koşullar altında, ancak, endothelial bariyer tehlikeye: TJ bozulur olsun kompleksleri ve ekin kapasitif bileşeni tekrar yükseldiğinde Ccl arttıkça TEER azalır. Bizim TEER ölçümü otomatik hücre izleme 32 sistemi kullanır: Bu empedans spektroskopisi prensibini takip eder ve önceki uygulamalarını uzanır. Burada, bağışıklık hücreleri ile beyin endotel etkileşimi de dahil olmak üzere bariyer özellikleri çalışma, sağlayan in vitro BBB modeli tarif; özellikle aktive edilmiş T hücreleri. 37 - Bu patofizyolojik koşullar, çoklu skleroz ve hayvan modeli, deneysel otoimmün ensefalomiyelit 33 olarak merkezi sinir sisteminin bağışıklık hastalıklarının gözlenmektedir. Burada, çok önemli bir adımdır BBB boyunca ensefalitojenik, miyelin özgü T hücrelerinin göçü olup. Bu beyin parankimi içine perivasküler alanda ve giriş onların reaktivasyonuna tarafından takip edilir, diğer bağışıklık hücrelerini işe ve bana neredeACİL enflamasyon ve daha sonra demiyelinasyon 1,35,38. Bununla birlikte, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimin moleküler mekanizması, BBB temel bileşenler, iyi anlaşılmamıştır. Bizim protokol bu boşluğu doldurmak ve aktive T hücreleri ile bunların doğrudan temas ve karmaşık etkileşimi üzerine endotel hücreleri (yani, bariyer bütünlüğü ve geçirgenlik) üzerinde sonuçları yeni bir bakış açısı kazandırmayı amaçlamaktadır. Burada açıklanan protokol mikro-gözenekli membran ile geçirgen eklerde üzerinde tek-katman olarak yetiştirilen primer fare beyni mikrovasküler endotel hücreleri, kullanır. Endotel hücreleri, ortak-kültürlenir poliklonal veya antijen spesifik şekilde ya da ön-aktive edilebilir, CD4 + T hücreleri ile. Ön-aktifleştirilmiş, ancak saf T hücreleri ile MBMECs Co-kültür TEER bir azalmaya ve MBMEC fonksiyon bozukluğu ve engelleyici bir bozulma nicel ölçümünü sağlar CCl bir artışa da neden olur. tekniknon-invaziv: built-in yerine AT tek tabaka büyük olumsuz yönde etkilenmemesi çubuk elektrotlar, kullanır; hücre belirteçleri kullanılmadan bariyer fonksiyonunu izlemek için de kullanılabilir. Bu otomatik bir şekilde sürekli ölçümler yapar ve aynı anda zamanla iki bariyer parametreleri (TEER ve Ccl) bağımsız bir değerlendirmesini sağlar. Yöntem ayrıca, farklı T hücresi aktivasyonunun seviyeleri ve EC ile T hücrelerinin etkilerini ayırt kadar hassastır. Bu fonksiyonel analizlerin geniş bir kullanılabilir: inflamatuar süreçlere de karışırlar farklı sitokinler ve / veya kemokin MBMECs ve T hücrelerinin ko-kültür ilave edilebilir; EC ya da T-hücresi, her iki yanında, hücre yapışma moleküllerinin karşı bloke edici antikorlar kullanılabilir; ve T hücre aktivasyon işaretleme maddelerinin veya sitolitik özellikleri inhibitörleri, T-hücresi priming veya EC ile ko-kültür sırasında ilave edilebilir. Tahlil, aynı zamanda, T-hücresi göçü için kullanışlıdırdeneyler, bu T hücrelerinin ilave edilmesinden önce, MBMEC tek tabaka bütünlüğünün bir kalite kontrol olarak hizmet edebilmektedir. Bütün bu yöntemini AK tek tabaka bütünlüğünü aktive T hücrelerinin etkisi odaklanarak, in vitro BBB incelemek için çok yönlü ve güvenilir bir araçtır. Bu, kendi kendine reaktif ensefalitojenik T hücreleri BBB çapraz ve enflamasyon ve nöronal zarara neden MS ve hayvan modeli EAE gibi oto-bağışıklık hastalıklarının patojenezinde BBB bozulma mekanizmalarının anlaşılması için özel bir önem taşımaktadır.

<table><tbody><tr><td>cellZscope</td><td>nanoAnalytics GmbH</td><td>www.nanoanalytics.com şunları</td><td>içerir: 24 kuyulu Hücre Modülü, Kontrolör, cellZscope yazılımı v2.2.2&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>www.thermoscientific.com</td><td>SORVALL RC 6+; rotor F21S-8x50y; MBMEC izolasyon</td></tr><tr><td>akış sitometresi</td> için <td>Beckman Coulter</td><td>www.beckmancoulter.com</td><td>T hücresi transmigrasyonunun analizi için</td></tr><tr><td>FlowJo7.6.5 yazılımı</td><td>T hücresi transmigrasyonunun analizi için</td><td>Tree Star</td><td>www.flowjo.com</td></tr><tr><td>Oak Ridge santrifüj tüpleri, PC</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>3118-0050</td><td>50 ml; MBMEC izolasyonu için</td></tr><tr><td>Transwell membran ekleri - gözenek boyutu 0.4 ve mikro; Ana</td><td>okuma olarak TEER ölçümü için</td>m <td>Corning</td><td>3470</td></tr><tr><td>Transwell membran ekleri - gözenek boyutu 3 ve mikro; m</td><td>Corning</td><td>3472</td>, <td>T hücresi transmigrasyon testinden önce kalite kontrol olarak TEER ölçümü için</td></tr><tr><td>24 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Greiner</td><td>650 180</td><td>düz tabanlı; MBMEC kültürü için</td></tr><tr><td>96 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>yuvarlak tabanlı; bağışıklık hücre kültürü için</td></tr><tr><td>QuadroMACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>T hücresi ve B hücresi izolasyonu için; destekler Dendritik hücre izolasyonu için MACS LS</td></tr><tr><td>sütunları OctoMACS Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>; MACS MS sütunlarını destekler</td></tr><tr><td>Hücre sayımı için</td><td>Neubauer sayma odası</td><td>Marienfeld</td><td>MF-0640010</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci, 70 & Bağışıklık</td><td>hücresi izolasyonu için</td>m <td>Corning</td><td>352350</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci, 40 & Bağışıklık</td> hücresi <td>izolasyonu için m Corning</td><td>352340</td><td>Bağışıklık hücresi izolasyonu için</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>T</td></tr><tr>hücresi ve B hücresi izolasyonu için<td>MACS LS ayırma sütunları</td><td>T hücresi ve B hücresi izolasyonu için</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td></tr><tr><td>Dendritik hücre izolasyonu için</td><td>MACS MS ayırma sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td></tr><tr><td>Fare CD4 Mikro Boncuklar</td><td></td><td>CD4 + </td>için Miltenyi Biotec <td>130-049-201</td> T hücre izolasyonu için</tr><tr><td>Fare CD19 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-201</td><td>B hücresi izolasyonu için</td></tr><tr><td>Fare CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td>Dendritik hücre izolasyonu için</td></tr><tr><td>İnsan plasentasından kollajen tip IV</td><td>MBMEC kaplama çözeltisi için</td><td>Sigma</td><td>C5533</td></tr><tr><td>Fibronektin </td><td>MBMEC kaplama çözeltisi için</td>sığır plazması <td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td></tr><tr><td>MBMEC</td>izolasyonu için<td>Kollajenaz 2 (CSL2)</td> <td>Worthington</td><td>LS004176</td></tr><tr><td>Kollajenaz/Dispas (C/D)</td><td>MBMEC izolasyonu için</td> <td>Roche</td><td>11097113001</td></tr><tr><td>MBMEC izolasyonu için</td><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td>MBMEC izolasyonu için <td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>MBMEC izolasyonu için</td> <td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>Amresco</td><td>0332-100G</td></tr><tr><td>MBMEC izolasyonu için</td><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>P1644-1L</td></tr><tr><td>MBMEC izolasyonu ve MBMEC kültür ortamı için</td><td>DMEM (+ GlutaMAX)</td> <td>Gibco</td><td>31966-021</td></tr><tr><td>MBMEC izolasyonu ve MBMEC kültür ortamı için</td><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu </td><td>MBMEC ve bağışıklık hücresi izolasyonu için</td>salin (PBS) <td>Sigma</td><td>D8537</td></tr><tr><td>MBMEC kültür ortamı için</td><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td></tr><tr><td>İnsan Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF)</td><td>MBMEC kültür ortamı için</td> <td>PeproTech</td><td>100-18B</td></tr><tr>MBMEC kültür ortamı için<td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P8833;</td><td>sadece ilk üç gün için</td></tr><tr><td>% 0.05 Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>MBMEC'lerin hasadı için</td>25300-054</tr><tr><td>Dendritik hücre izolasyonu için</td><td>Kollajenaz Tip IA</td><td>Sigma</td><td>C9891</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi çözeltisi, hücre</td> <td>sayımı için</td>%0.4 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>İmmün hücre izolasyonu için</td><td>Sigma</td><td>E5134</td></tr><tr><td>IMDM + %1 L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>21980-032</td><td>T hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>X-VIVO için 15</td><td>Lonza</td><td>BE04-418Q</td><td>ışıktan koruyun; B hücre kültürü ortamı</td></tr> <tr><td>ve beta; - merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td>için B hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100x Glutamax)</td> <td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>B hücre kültürü ortamı için</td></tr><tr><td>fare MOG35&mdash; Antijene</td><td>özgü T hücresi aktivasyonu için</td>55 </alt>peptit <td>Biotrend</td><td>BP0328</td></tr><tr><td>saflaştırılmış anti-fare CD3 Ab</td><td>BioLegend</td><td>100302</td><td>klonu 145-2C11; poliklonal T hücresi aktivasyonu için</td></tr><tr><td>saflaştırılmış NA/LE anti-fare CD28 Ab</td><td>BD Pharmingen</td><td>553294</td><td>klonu 37.51; poliklonal T hücresi aktivasyonu için</td></tr><tr><td>Rekombinant Murin IFN-&gama;</td><td>T hücresi transmigrasyon testleri için</td> <td>PeproTech</td><td>315-05</td></tr><tr><td>Rekombinant Murin TNF-&alfa;</td><td>T hücresi transmigrasyon testleri için</td> <td>PeproTech</td><td>315-01A</td></tr>, <tr><td>NA/LE saflaştırılmış anti-fare IFN-&gama; antikor</td><td>BD Biosciences</td><td>554408</td><td>klonu XMG1.2; önerilen son konsantrasyon: 20 & g/ml</td></tr><tr><td>Granzyme B İnhibitörü II</td><td>Calbiochem</td><td>368055</td><td>önerilen son konsantrasyon: 10 &mikro; M</td></tr><tr><td>PE anti-fare CD4 antikoru</td><td>Biolegend</td><td>116005</td><td>klonu RM4-4; T hücresi transmigrasyonunun analizi için</td></tr></tbody></table>

bir<em&gt; İn vitro</em&gt; empedans spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin model: t hücre-endotelyal hücre etkileşim Üzerine bir odak

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Kan-beyin bariyerinin (BBB) parçalanması, multipl skleroz (MS) ve hayvan modeli deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) gibi otoimmün hastalıkların gelişiminde kritik bir adımdır. Bu süreç, aktive edilmiş T hücrelerinin, BBB'nin ana bileşenleri olan beyin endotel hücreleri (EC'ler) boyunca transgrasyonu ile karakterize edilir. Bununla birlikte, bu tür T hücreleri ile etkileşim üzerine beyin EC fonksiyonu üzerindeki sonuçlar büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, zaman içinde T hücreleri ile etkileşim sırasında birincil fare beyni mikrovasküler EC (MBMEC) fonksiyonunun ve bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesine izin veren bir testi açıklıyoruz. Test, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ve hücre tabakası kapasitansındaki (Ccl) değişiklikleri ölçerek EC tek tabaka bütünlüğünü ve geçirgenliğini incelemek için güçlü bir araç olan empedans hücre spektroskopisini kullanır. EC'lerle doğrudan temas halinde, uyarılmış ancak naif olmayan T hücreleri, TEER'de bir azalma ve Ccl'de bir artış ile görselleştirildiği gibi, EC tek katmanlı disfonksiyonu indükleyebilir. Test, EC tek tabaka bütünlüğündeki değişiklikleri sürekli ve otomatik bir şekilde kaydeder. Farklı uyaran güçleri ile T hücresi aktivasyon seviyeleri arasında ayrım yapacak kadar hassastır ve antikorlar, farmakolojik reaktifler ve sitokinler gibi çok çeşitli maddeler kullanılarak T hücresi-EC etkileşiminin hedefli bir modülasyonunun sonuçlarının araştırılmasını sağlar. Bu teknik aynı zamanda in vitro T hücresi transmigrasyon testlerinde EC bütünlüğü için bir kalite kontrol olarak da kullanılabilir. Bu uygulamalar, onu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında BBB özelliklerini incelemek için çok yönlü bir araç haline getirir.

Şekil 1, T hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan in vitro BBB modelinin genel bir bakış sağlar. Deney üç ana adımdan oluşur. İlk adım beyin korteks primer MBMECs izolasyonu ve beş gün boyunca onların kültürüdür. Onlar hücre kültürü plakasına izdiham ulaştığınızda, MBMECs tripsinize ve sonra TEER enstrüman yerleştirilir geçirgen ekler, üzerine reseeded edilir. TEER ve MBMECs CCL sürekli olarak ölçülür ve üç ila beş günlük ...

Burada, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçlara odaklanarak, empedans hücre spektroskopisini kullanan kan-beyin bariyerinin in vitro bir murin modelini açıklıyoruz.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Bu deneyin genel amacı, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim sonrası endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçları incelemektir. Bu yöntem, T hücreleri ile endotel hücreler arasındaki doğrudan etkileşimin kan-beyin bariyeri bütünlüğünü ve geçirgenliğini nasıl etkilediği gibi nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Bu tekniğin temel avantajı, T hücresi ve endotel hücresi etkileşiminin hedeflenmiş modülasyonu üzerine bariyer fonksiyonunun otomatik ve gerçek zamanlı değerlendirmesine olanak tanımasıdır.Bu tekniğin etkileri, otoimmün MSS bozukluklarının tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü bu yöntem, söz konusu hastalıkların patogenezinde kritik bir adım olan T hücresi aracılı kan-beyin bariyeri yıkımı hakkında bilgi sağlamaktadır. Bu yöntem, EAE sırasındaki deniz kan-beyin bariyeri özelliklerine odaklanmaktadır. Ancak yöntem, kırmızı veya insan kan-beyin bariyeri modellerinin yanı sıra diğer otoimmün MSS bozuklukları üzerine yapılan çalışmalara da uygulanabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, kombine primer endotel hücre kültürü ve T hücresi aktivasyonunun optimal zamanlamasıyla ilgili olası zorluklar nedeniyle güçlük

an-vitro-model-blood-brain-barrier-using-impedance-spectroscopy-focus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, in vitro olarak fare beyni mikrovasküler endotel hücrelerinde transendotelyal elektrik direncini (TEER) değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. Yüksek bir TEER değeri, sağlam endotel hücre bağlantılarını gösterirken, aktive edilmiş T hücrelerinin eklenmesi, bağlantı bariyerinin bozulmasını yansıtan TEER değerini düşürür.

Transendotelyal Elektrik Direncinin İn Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modelinde Değerlendirilmesi

Bu video, kan-beyin bariyerini (BBB) geçen patojenleri incelemek için bir in vitro modeli göstermektedir. Sıkı bağlantıları ifade eden mikrovasküler endotel hücreleri, üst odacıkta bir endotel tabakası oluştururken, nöronlar, astrositler ve mikroglia, gözenekli bir zarla ayrılmış alt odacıktaki beyin parankimini temsil eder. BBB modelindeki virüs enfeksiyonu, kandan beyne geçen patojeni taklit eder. Nörotropik bir virüs ortaya çıktıktan sonra, transsitoz yoluyla BBB'yi geçer, sinir hücrelerini...

Kan-Beyin Bariyerinin Patojen Geçişini ve Beyin Hücresi Enfeksiyonunu İncelemek için İn Vitro Bir Model

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Bu çalışmanın amacı, singeneik fare endotelial hücreler ve astrositlerin ortak-kültür içeren bir in vitro modelinin BBB tekrarlanabilirliğini doğrulamak için oldu. Endotel hücre tek yüksek Teer ve düşük LY geçirgenliği sundu. Belirli TJ proteinlerin ekspresyonu, enflamasyon ve taşıyıcı ve reseptörlerin işlevselliğine fonksiyonel tepkileri değerlendirildi.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

Burada, lenfositlerin merkezi sinir sistemine in vitro göçünü araştırmayı sağlayan bir insan kan-beyin bariyeri modelini açıklıyoruz.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Bu rapor, kan-beyin bariyeri modellerinin oluşturulması için μSiM platformunda montaj, hücre kültürü ve tahliller için protokoller sağlar.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Bu protokol, beyin kan bariyerinin güvenilir ve verimli bir in vitro modelini tanımlar. Yöntem, fare serebral vasküler endotel hücreleri bEnd.3'ü kullanır ve transmembran elektrik direncini ölçer.

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

Burada empedans tabanlı biyosensörleri kullanma tekniğini gösteriyoruz: beyin endotel bariyer gücünü ölçmek için ECIS ve cellZscope. Beyin endotelinin in vitro modeline çeşitli uyaranlar eklemenin hazırlanmasını ve tekniğini detaylandırıyoruz. Bulguları ölçüyor, kaydediyor ve temsili bir analiz yapıyoruz.

Kanser Hücreleri ve Sitokinlere Yanıt Olarak İki Empedans Tabanlı Biyosensör ile Beyin Endotel Bariyer Bütünlüğündeki Değişikliklerin Ölçülmesi

Öğrenin, empedans spektroskopisi kullanarak T hücre-endotelyal hücre etkileşimlerinin kan-beyin bariyeri bütünlüğü üzerindeki etkilerini incelemeyi. Bu yöntem, nöroimmünolojide otoimmün MSS bozukluklarının patogenezi hakkında gerçek zamanlı bilgi sağlar.

bir İn Vitro Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak (Video) | JoVE Journal

bir

Daha fazla video keşfet