Çok florlu Safra Asitler ve kullanma

Bu prosedürün genel amacı, canlı hayvanlarda safra asidi transportunu incelemek için safra kesesindeki konsantrasyonlarının MRI ile ölçülmesini sağlamak amacıyla, safra asitlerini doğal olarak oluşan, radyoaktif olmayan flor ile işaretlemektir. Bu yaklaşım, safra asidi malabsorpsiyonu nedeniyle tedavi edilmesi gereken kronik ishal hastalarının belirlenmesi potansiyeline sahiptir. Bu yöntemin temel avantajları, iyonize radyasyona maruz kalma gerektirmemesi ve hem klinik araştırma hem de uygulama için yüksek translasyonal potansiyele sahip olmasıdır.

Bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz, Amerika Birleşik Devletleri'nde bozulmuş bağırsak safra asidi transportunu tespit etmek için pratik klinik testlerin bulunmadığını fark ettiğimizde oluştu. Bir mililitrelik şırıngayı uygun hacimdeki flor işaretli safra asidi stok çözeltisiyle doldurarak başlayın ve 20 gauge, 1,5 inçlik, kavisli, ucu yuvarlak gastrik gavage iğnesi takın. Ardından, başparmak ve işaret parmağınızı kullanarak fareyi ensesindeki gevşek deriden sıkıca kavrayın ve kalan parmaklarınızla alt sırt ve kuyruk bölgesindeki deriyi tutun.

Hayvanı dik tutarak, gavage iğnesini ağzın yan tarafı ve tavanı boyunca yemek borusundanle mideye doğru ilerletin. Uygun deneysel bitiş noktasında, pubis ile xiphoid kemiği arasında orta hat boyunca bir abdominal cilt insizyonu yapın ve ardından diyaframa zarar vermeden abdominal organları açığa çıkarmak için periton astarı boyunca ilgili bir insizyon gerçekleştirin. Ardından, üst abdominal boşluğu açığa çıkarmak için beş inçlik bir klemple xiphoid çıkıntısını kaldırın.

Safra kesesini açığa çıkarmak için forseps ve küt uçlu bir alet kullanarak karaciğeri diseke edin ve kenara çekin. Ardından, ana safra kanalına dört inçlik bir klempleme yapın ve safra kesesinin üst kutbunu diyaframa bağlayan ligamenti keserek safra kesesinin karnın sağ tarafına hareket ettirilmesini sağlayın. Karaciğerin laserasyonunu veya safra kesesinin yanlışlıkla boşalmasını önlemek için laparotomiden hemen sonra ana safra kanalını klemplemeye dikkat edin.

Kan tahliyesinden sonra, toplanan kanı santrifüjleme için 1,5 mililitrelik heparinli bir tüpe aktarın. Plazmayı dört birim asetonitril ile çöktürün ve kan örneğini tekrar santrifüjleyin. Ardından süpernatantı sıvı kromatografisi ve kütle spektroskopi ile analiz edin.

Safra kesesini serbest bırakmak için çevredeki dokuyu künt diseksiyonla ayırın ve ardından klembin altındaki ortak safra kanalını kesin. Toplanan safra kesesini tartın, ardından dokuyu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve karaciğeri çıkarın. Dokuları ekstrakte etmek için %75 acetonitrile ve %25 su ekleyin; yaklaşık 100 miligram karaciğeri ve safra kesesinin tamamını buz üzerinde, bireysel boyutlu 21'lik cam doku homogenizatörlerinde homogenize edin.

Numuneleri 1,5 mililitrelik bir Eppendorf tüpüne aktarın ve santrifüjleyin. Ardından ekstraktları uygun şekilde seyreltin ve sıvı kromatografisi ile kütle spektrometrisi kullanarak safra asidi içeriklerini belirleyin. Uygun deneysel bitiş noktasında, anestezi altındaki farenin sol iç uyluk bölgesinin iç kısmını temizleyin ve 24 gauge, 0,75 inçlik bir iğne kateteri uyluk üzerinden deri altına, abdominal kaviteye yerleştirin.

İntraperitoneal kateteri yerinde bırakarak iğneyi çıkarın. Fareyi MRI tarayıcı hayvan yatağına transfer edin ve sıcaklık kontrollü bir termal ped takın. Kateteri 72 inçlik steril bir tübe ve tübü, işlem boyunca anestezinin sürdürülmesi için steril 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlayın.

Tarayıcı yakınında metal bulunmadığını onayladıktan sonra, radyo frekans sinyallerini iletmek ve almak için flor ve proton çift ayarlı lineer hacimsel MRI bobini kullanın. Ardından, sistemi kalibre etmek ve hayvanın konumunu doğrulamak için üç kesitli kafa derisi görüntüleri elde etmek amacıyla hızlı düşük açılı çekim (fast low angle shot) sekansı uygulayın. Deneyi başlatmak için, numunenin enine görünümünde relaksasyon ve iyileştirme ile hızlı kazanım (rapid acquisition with relaxation and enhancement) sekansını kullanarak çok kesitli proton manyetik rezonans görüntüleri almak üzere trafik ışığı düğmesine tıklayın.

Son olarak, aynı bölgede ikinci bir hızlı düşük açılı çekim dizisi kullanarak flor görüntülerini elde etmek için spektrometre kontrol aracı penceresindeki GOP düğmesine tıklayın. Bu yöntemle, safra kesesinde, karaciğer veya plazmada gözlemlenen seviyelerden bin kat daha yüksek olan ve safra asitlerinin fizyolojik seviyeleriyle tutarsız olan, çok florlu safra asidinin (MFBA) yüksek seçicilikteki konsantrasyonu ölçülebilir. Safra asidi enterohepatik dolaşımının fizyolojik kinetiği için beklendiği üzere, MFBA'nın pik safra kesesi konsantrasyonları oral dozlamadan dört ila yedi saat sonra belirginleşmektedir.

Nitekim, MFBA oral gavajından iki buçuk ila dört saat sonra, ana safra kanalına benzediği görülen bölgeden gelen flor sinyalleri ve safra kesesinden gelen daha güçlü bir sinyal gözlemlenir. Yedi ila sekiz buçuk saat itibarıyla, ana safra kanalı sinyali artık tespit edilemez ve safra kesesi flor sinyali, bitişikteki MFBA fantomundan gelen sinyalle aynı yoğunluğa ulaşır. Safra asitlerinin intestinal alımının azaldığı apikal sodyum bağımlı safra asidi taşıyıcısı eksik farelerde, kontrollü vahşi tip hayvanlara kıyasla MFBA konsantrasyonunda yaklaşık 22 kat azalma meydana gelir.

Nitekim, vahşi tip farelerin safra keselerinde güçlü bir flor sinyali tespit edilirken, apikal sodyuma bağımlı safra asidi taşıyıcısı eksik olan hayvanlarda buna karşılık gelen bir flor sinyali yoktur; bu durum, hem MFBA'ların fizyolojik safra asitleriyle benzer şekilde işlendiğini hem de MFBA MRI'ın safra asitlerinin bozulmuş intestinal emilimini tespit etmek için kullanılabileceğini doğrulamaktadır. Uzmanlaşıldığında ve uygun şekilde uygulandığında; laparotomi, kan alma ile safra kesesi ve karaciğer insizyonu 20 dakika içinde tamamlanabilir. MRI sırasında sinyal alımı bir buçuk ila iki saat sürecektir.

Geliştirilmesi ve ticarileştirilmesinin ardından bu tekniğin, hem küçük hayvanlarda hem de insanlarda fizyoloji ve hastalıklarda intestinal safra asidi transportunun rolünün araştırılmasına zemin hazırlama potansiyeli bulunmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, küçük hayvanlara yabancı işaretli safra asitlerinin nasıl uygulanacağı ve bunların karaciğer ile safra kesesindeki alımının MRI veya organ insizyonu ile nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.