Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Bu prosedürün genel amacı, bir transpozon sistemi kullanarak murin amniyotik sıvı hücrelerini izole etmek ve yeniden programlamaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı kolay bir şekilde gerçekleştirilebilmesidir. Terapötik bir ortamda, insan hastalığı fetüslerinden alınan hücreler, doğumdan önce hastaya özgü tedavinin başka bir yolunu hazırlamak için ilaç testi veya doku mühendisliği için ilgilenilen hücrelere farklılaştırılabilir.

Bu yöntem, programlamanın temel sorularını yanıtlamaya yardımcı olabilir. Transpozon sistemi farklı hücre tiplerinde etkilidir. Viral vektörlere göre klinik yaklaşım için daha uygundur ve oksino içermeyen IPS hücrelerinin üretimine izin verir.

İzolasyona başlamak için, barajın karın duvarını yüzde 70 etanol kullanarak temizleyin. Makas kullanarak, karın boşluğuna erişmek için karın duvarının uzunluğunu keserek orta hat laparotomisi yapın. Uterusu ortaya çıkarmak için forseps kullanın ve ardından makas kullanarak eksize edin.

Uterusu steril 1xPBS ile doldurulmuş 100 milimetrelik bir tabağa aktarın ve buz üzerinde tutun. Çanağı 10X büyütmede bir stereomikroskop altına yerleştirin ve rahim duvarını makasla çıkarırken fetal zarlara zarar vermemeye dikkat ederek uterusu forseps ile tutun. Fetüsleri steril 1XPBS ile doldurulmuş 100 milimetrelik bir tabağa toplayın ve buzun üzerine yerleştirin.

Bir fetüsün plasentasını ince uçlu forseps ile kavrayın ve 100 milimetrelik temiz bir tabağa taşıyın. Burada, yumurta sarısı çuvalını dikkatlice çıkarın. Forseps kullanarak ve bir insülin şırıngası kullanarak amnyonu bozun, 30 mikrolitre amniyotik sıvı toplayın.

Sıvıyı 15 mililitrelik konik bir şişeye aktarın. Bu işlemi her fetüs için tekrarlayın ve sıvıyı her seferinde aynı şişeye toplayın. Daha sonra, her fetüsü yüzde bir fetal sığır serumu ile takviye edilmiş steril 1XPBS ile yıkayın ve bunu amniyotik sıvı ile birlikte 15 mililitrelik konik tüpe toplayın.

Tüpü beş dakika boyunca 145 kez G'de santrifüjleyin ve ardından bir laminer akış başlığı altında süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş hücreleri iki mililitre amniyotik sıvı kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Miyomisin-C ile muamele edilmiş fare embriyonik fibroblastları veya MEF içeren sıfır noktalı yüzde bir jelatin kaplı altı oyuklu bir plaka alın ve ardından plakaya iki mililitre hücre ekin.

Hücreleri 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte yetiştirin ve ortamı her gün değiştirin. Hücreler transfeksiyon için hazır olana kadar yedi gün boyunca kültüre devam edin. Transfeksiyona başlamak için, bir nokta beş millimiter mikrosantrifüj tüpünde, bir mikrogram transpozon plazmitini sıfır nokta beş mikrogram transpozaz ekspresyon plazmidi ve sıfır nokta beş mikrogram ters tetrasiklin transaktivatör plazmidi ile karıştırın.

D-man kullanarak 100 mikrolitreye seyreltin. DNA'yı içeren mikrosantrifüj tüpüne sekiz mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Bu karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Fare AF hücreleri ile altı oyuklu plakayı alarak, kuyucuk başına 100 mikrolitre transfeksiyon ajanı DNA karışımını damla damla ekleyin ve kuyucuk başına iki mililitrelik bir son hacimle hafifçe döndürerek dağıtın. Hücreleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede yüzde beş karbondioksitte bırakın. Ertesi gün, kültür ortamını çıkarın ve daha sonra Yamanaka faktörlerinin ekspresyonunu indüklemek için her bir hücre kuyusunu, mililitre doksisiklin başına bir nokta beş mikrogram ile desteklenmiş iki mililitre taze iPS AF ortamı ile besleyin.

Hücreleri günlük olarak bu noktadan itibaren geçiş yapmadan taze dox içeren ortamla besleyin. Herhangi bir mCherry ekspresyonu aramak için ilk doksisilsin tedavisinden sonraki 24 saat içinde hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve bu noktadan itibaren koloni oluşumu için günlük olarak gözlemleyin. Koloni oluşumu gözlemlendiğinde, tek kolonileri 50 mikrolitre hücre kültürü ortamına alın.

Daha sonra, bunları mitomisin c ile muamele edilmiş MEF ile 96 oyuklu bir doku kültürü plakasının ayrı kuyucuklarına sırayla aktarın. Ertesi gün, her bir oyuğa 50 mikrolitre tripsin ekleyin ve kolonileri tek hücrelere ayırmak için 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, kolonileri daha fazla ayrıştırmak için sıvıyı yukarı ve aşağı pipetleyin.

50 mikrolitre tripsin hücre karışımını inaktive edilmiş MEF içeren yeni bir kuyucuğa aktarın ve ardından hücreleri inkübatöre geri koyun. Hücreler yüzde 60 ila 70 birleşmeye ulaştığında, bunları 24 oyuklu bir plakanın yeni bir kuyusuna bölün ve ardından oda sıcaklığında inkübasyona devam edin. Bu hücreler yüzde 60 ila 70 birleşmeye ulaştığında, hücreleri bir ila iki oyuğa çevirin, biri doksisiklin içeren ve diğeri doksisiklin yokluğunda kolonilerin de büyüyeceğini doğrulamak için.

Yüzde beş karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inaktive edilmiş MEF üzerinde IPS AF kolonilerini ve doksisiklin bağımsız ortamını korumaya devam edin. Hücreler boyama, görüntüleme ve RNA ekstraksiyonu için hazır olana kadar ortamı günlük olarak değiştirin. Burada, stabil doksisiklin bağımsız indüklenmiş plöripotent fare amniyotik GFP pozitif hücreleri, başarılı yeniden programlamayı doğrulamak için gereken plöripotent belirteçlerini eksprese eder.

Kontrol olarak R1 ES hücrelerini kullanan RTPCR analizi, doksisiklin varlığında veya yokluğunda indüklenen plöripotens belirteçlerinin ekspresyonunu gösterdi. Temizlik geni olan beta iki mikroglobulinin ekspresyonu da her üç hücre tipinde de gözlenmiştir. İndüklenmiş plöropotent hücreler enjekte edilen farelerden izole edilen teratomlar immün boyalıydı.

Kitlelerde alfa fetal protein, alfa düz kas aktini ve beta üç tübülinin saptanması, ektoderm, mezoderm ve endoderm olmak üzere üç germ tabakasına da hücre farklılaşmasını doğrular. Ayrıca, in vitro embriyoid cisimciklerinin ve in vivo teratom hücrelerinin RTPCR analizi, mezoderm, endoderm ve ektoderm için germ tabakasına özgü belirteç genlerinin ekspresyonunu doğrular. Bu videoyu izledikten sonra, murin amniyotik sıvı hücrelerinin nasıl izole edileceğini ve yeniden programlanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu, rutin teşhislerden veya sezaryen ameliyatlarından elde edilen bir örnekten insan amniyotik sıvı hücrelerine de uygulanabilen basit ve güvenli bir prosedürdür.