Name: Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Öğrenin fare retinası düz montaj hazırlama ve iç retina nöronlarında yama kelepçe kaydı yapma yöntemini. Bu teknik sinaptik bağlantıları incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik yardım için Joung Jang ve Xin Guan'a teşekkür ederiz. Virginia Commonwealth Üniversitesi'nden Dr. Rory McQuiston'a ilk yama kelepçesi makinemizi kurduğu ve deneysel prosedürlerle ilgili tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Voltaj kelepçesi kaydı ile ilgili önerileri için Dr. Samuel Wu'ya teşekkür ederiz. Çalışma, NIH hibeleri EY013811, EY022228 ve bir vizyon temel hibe EY002520 tarafından desteklenmektedir. C-KC, Baylor Tıp Fakültesi'nde Alice R. McPherson Retina Araştırma Vakfı Kürsüsü Başkanıdır.

Etik onayı - kurumsal hayvan bakımı tarafından onaylanmış ve Baylor College of Medicine komitesini kullanmak gibi hayvan denekleri prosedürleri, kuralları ve araştırma hayvanlar için Sağlık kılavuzların National Institutes düzenlemelerine uygun olarak yapılmıştır. 1. Harici ve Dahili Çözümler <ol><li> retina diseksiyonu sırasında ve sonraki elektrofizyolojik kayıt harici bir çözüm olarak memeli Ringer çözeltisi kullanın. Kayıt günü (kalsiyum olmadan) 10x stok çözeltisinden, memeli Ringer çözeltisi hazırlayın ve carbogenation 15 dakika (% 95 O2 ve% 5 CO2) sonrasında CaCl2 damla damla ilave edin. Nihai 1x solüsyonu (mM cinsinden) şunları içerir: NaHCO 3, 0.8 Na 2 HPO 4, 0.1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl2, 1 MgSO 4 ile 10 D-glikoz 120 NaCl, 5 KCl, 25. </li><li> SAC salınımların karakterize etmek için iki dahili çözümleri kullanın. TestYetişkin fare RGCs üzerinde daha uzun süreli tüm hücre yama kelepçe kayıtları hazırlanan çözeltiler yararlılığı ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de 500 ul alikolar içinde belirlenmiş gruplar saklayın. <ol><li> Membran potansiyeli salınım kaydetmek için, (mM olarak) ihtiva eden bir potasyum bazlı içi çözelti kullanımı: 125 K-glukonat, 8 NaCI, 4 ATP mg, 0.5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES ve% 0.2 biocytin (ağırlık / h). KOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li><li> (100 CS-metansülfonat, 8 NaCI, 4 ATP mg, 0.5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES ve% 0.2 biocytin: eksitatör inhibe edici postsinaptik akımlar kaydetmek için, (mM olarak) ihtiva eden bir sezyum bir dahili solüsyon kullanmak ağırlık / hacim). CsOH ile 7.3 pH ayarlayın. </li></ol></li></ol> Kayıt Günü için 2. Hazırlık <ol><li> açık delikli bir nitroselüloz membran hazırlamak için, el ile körleşmiş 16 G şırınga iğnesi yapılmış özel bir zımba ile membran yumruk ve iki temiz bir cam levha arasına membran dümdüz. Bir toptan için, Retina montaj çapı merkezi delik 0.2 mm yapmak ve çapı 1-1,2 mm 4 büyük delikler tarafından onu çevreleyen. </li><li> elektrotlar içine iç çözümü yüklenmesi için özelleştirilmiş bir dolgu iplik yapmak için, ortada bir 10 ul pipet eritmek ve soğur ve sertleşir kadar yavaşça erimiş kısmı uzatmak. Hemen önce, kullanmak biraz daha uzun yama pipetler daha oluncaya kadar filamanın kesmek için temiz bir jilet kullanmak için. </li><li> bir iç filament ile borosilikat cam tüp programlanabilir çektirmenin yama pipetler çekin. Deney günü mikropipetler imalatı ve bunları hemen kullanın. NOT: Isı: kayıt BİLSEM&#39;ler için, şu çektirmenin ayarını kullanın 484; çekin: 0; hız: 25; gecikme süresi: 1; Basınç: 400 ve 462. borosilikat tüplerin OD ve kimliği bir rampa değeri sırasıyla 1.65 mm ve 1.0 mm vardır. pipetler direnç 10-14 MQ olduğunu. </li><li> Bir saat doku hasattan önce, Şeki iç çözümün bir tüp çözülme&gt; 30 dakika boyunca bir girdap üzerinde ng. </li></ol> 3. Retina Diseksiyon <ol><li> Hayvan bir ayak tutam yanıt kaybedene kadar oksijen izofluran% 4 ile hayvan anestezisi. servikal dislokasyon ile hayvan kurban. </li><li> uzakta düz sivri iris makası ile optik sinir başları 1-2 mm optik sinirlerin kapalı hem gözbebekleri kesin. </li><li> kan kaldırmak ve daha sonra carbogenated memeli Ringer solüsyonu sokmaktan temiz bir kağıt havlu üzerine gözbebekleri yuvarlayın. 23 G iğne ile limbus üzerinde bir delik ve mikro-makas ile limbusta boyunca keserek gözbebekleri ikiye bölmek. Ince forseps kullanılarak kornea ve lensi çıkarın. <ol><li> retina tam montaj için hafifçe ince forseps ile pigmente epitel kapalı tüm retina soyma ve optik sinir başı doğru kenarından dört 1.5-2 mm dik kesim yapmak. </li></ol></li><li> çanak içine bir delikli nitroselüloz membran daldırın ve hafifçe ile bitti retina sürükleyinGCL taraf yukarı. bir bütün montaj retina hazırlarken orta deliğe optik sinir başını yerleştirin. başka bir temiz kabına retina ile membran aktarın. Yavaşça bir Malta haçı gibi bakmak ve deliklerin üzerine dört kenarı koymak için iyi bir fırça ile retina dümdüz. <ol><li> retina kısmı bir seferde incelenecek olursa, pigment epitel bağlı kaldığı bir jilet ile 3-4 parçaya Aşama 3.3 ile üretilen her Göz yuvası kesti. carbogenated dış çözelti içinde ışıktan kullanılmayan parçalarını koruyun ve 12 saat içinde bunları kullanmak. </li></ol></li><li> Kuru filtre kağıt parçası ile nitroselüloz membran kurulayın ve forseps ile vitreus ve iç sınırlayıcı membran ve bir boya fırçası kaldırın. </li><li> tüm retina kenarları tamamen altta kapalı bir cam kapak kayma ile kayıt odasına aksamını aktarmadan önce zara bağlı olduğundan emin olun. Kapak kayma ve rehydrat vakum gres ile membran sabitleyinDış çözümü ile retina e. montaj altında herhangi bir hava kabarcıkları tuzak dikkatli olun. </li><li> dik bir mikroskop sahneye odasına ayarlayın. dakika başına ~ 3 ml bir oranda sıcak (34-35 ° C) carbogenated dış çözelti ile bölme serpmek. </li><li> diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve / veya Epifloresans altında GCL ve INL nöronlar görmek için 60x su daldırma lens kullanabilirsiniz sonra ilk 10x objektif mercek altında retina incelemek ve. tdTomato salgılayan BİLSEM&#39;lere görselleştirmek için, beyaz bir 554 nm&#39;lik bir uyarılma filtreli ve 581 nm&#39;lik bir emisyon filtresi ile birlikte LED ışık kaynağı kullanır. </li></ol> Düz montaj Retina 4. Tüm hücre yama Kelepçe Kayıt <ol><li> Özel bir dolgu filaman bir şırınga filtre ile iç çözelti filtre. </li><li> taze çekilmiş mikropipet içine filamanın yerleştirin ve çözüm&gt; için gümüş elektrot teli kapsayan kadar ucuna yakın iç çözüm dağıtmak5 mm. iterek veya tüp bağlı 10 mi plastik şırınga pistonu çekerek ayarlanabilir elektrodun içinde bu basınç ile bir emme kutuplu bir elektrot tutucu üzerine mikropipet sabitleyin. </li><li> objektif altında pipet bulun ve retina üzerinde ~ 100 um aşağı getirmek. akım-takipçi modu (I = 0) kapsamında, DC ayakta DC gerilim sinyali sıfıra ofset kullanın. O banyoda iken pipet aracılığıyla sabit genlik kare dalga akımları enjekte edilerek mevcut kelepçe (I Kelepçe) modu altında pipet direncini ölçün ve Raccess düğmeyi çevirerek farkı nötralize. Ohm kanunu ile pipet direnci hesaplamak için Raccess topuzu üzerinde okuma kullanın. </li><li> Yavaş yavaş 10 um Retina üzerinde elektroduna ~ getir. elektrot pozitif basınç uygulayın. o retina yaklaştıkça pipet yakın yansıma değişimini izleyin. Çabuk fakat nazikçe GCL içine pipet zorlamak ve pozitif pressu azaltmakhemen yeniden. </li><li> etiketli nöron doğru pipet hareket ettirin. diğer nöronlar, kan damarları ve Muller hücreleri endfeet temastan kaçının. elektrot tıkanmasını önlemek için gerekirse daha pozitif basınç uygulayın. </li><li> Bir çukur görünür olana kadar bir etiketli nöron orta hat yakınında pipet yerleştirin. pozitif basınç serbest bırakın ve plazma zarı pipet üzerine geri sıçrama sağlar. </li><li> Bir Giga-ohm mühür oluşumunu yardım etmek pipet 20 120 pA negatif akımları uygulayın. pipet içine plazma zarı çekmek için gerekirse yumuşak bir emme uygulayın. hücre zarı yırtılmasına mühür oluşumundan sonra 5 dakika bekleyin. Bu dökülen iç çözüm süperfüzyomu tarafından temizlenmesini sağlar. hafif bir emme ile membran rüptürü. </li><li> membran rüptürü sonra ve mevcut kelepçe modunda iken, köprü dengesi üzerinde geçiş ve Raccess düğmesini kullanarak ayarlayın. NOT: Varsa SAC gibi küçük bir hücre için, sadece hafif ayarlama gereklidir. Alternonları bir arada, kayıt uyarıcı ve sırasıyla (0 mV civarında) (-75 mV civarında) klorür ters potansiyelleri hücreyi ve glutamat tutarak gerilim kelepçe modunda (V Kelepçe) inhibitör postsinaptik akımlar. Kontrol ve ara sıra retina ve / veya mikromanipülatör sürüklenme karşılamak için gerekirse pipet konumunu ayarlayın. </li><li> Taze (örn, CNKX, AP5, pikrotoksin, tubokurarin, vs.) ve kanal modülatörleri (ör flupirtin, dopamin, meklofenamik asit, vs.), sinaptik blokerler hazırlanması sırasında veya ilaç tedavisi öncesi, membran potansiyel ya da mevcut bir değişiklik kaydetmek için dondurulmuş stoktan deney günü. carbogenated Ringer solüsyonu ile uyuşturucu seyreltiniz. perfüzyon yoluyla bir toplu şekilde onları uygulayın. </li><li> Kayıttan sonra, yavaşça soma gelen pipet kaldırmak. Temiz bir çanak odasından derleme aktarın. Ayır ve delikli hol olmadan başka basık nitroselüloz zar üzerine retinaya yeniden takmakes fiksasyon sırasında retina düzgünlüğü sağlamak. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde daldırarak retina sabitleyin. nitroselüloz membran retina çıkarın ve 1x PBS ile yoğun durulayın. 4 ° C, 14% 0.4, Triton X-100 ile 1 x PBS içinde seyreltilmiş boya-konjüge streptavidin ile O / N boyama ile kaydedilen hücre morfolojisini ortaya koyuyor. antifade ortamda retina monte edin ve bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak kaydedilen hücreleri gözlemleyin. Not: uçucu ve toksik olan paraformaldehid içeren prosedürler, güvenlik için bir taslak odası içinde yapılmalıdır. </li></ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
<li>Gregg, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nyctalopin+expression+in+retinal+bipolar+cells+restores+visual+function+in+a+mouse+model+of+complete+X-linked+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness.</a> J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).</li>
<li>Hellmer, C. B., Ichinose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+light-evoked+postsynaptic+responses+in+neurons+in+dark-adapted%2C+mouse+retinal+slice+preparations+using+patch+clamp+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dendritic+branching+in+direction+selective+retinal+ganglion+cells+in+nob1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+membrane+potential+fluctuations+of+cholinergic+amacrine+cells+in+mice+lacking+ERG+b-waves%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+maintain+eye-specific+segregation+in+nob%2C+a+mutant+with+abnormally+patterned+retinal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity.</a> Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Retinal+Oscillation+Mechanism+in+an+Autosomal+Dominant+Photoreceptor+Degeneration+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model.</a> Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).</li>
<li>Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neural+oscillator+in+the+degenerating+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina.</a> J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+spontaneous+ganglion+cell+spike+activity+in+animal+models+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa.</a> J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Stasheff, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+sustained+spontaneous+hyperactivity+and+temporary+preservation+of+OFF+responses+in+ganglion+cells+of+the+retinal+degeneration+%28rd1%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).</li>
<li>Trenholm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillatory+activity+arising+within+the+electrically+coupled+AII+amacrine-ON+cone+bipolar+cell+network+is+driven+by+voltage-gated+Na%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels.</a> J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).</li>
<li>Chen, C. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+changes+in+displaced+cholinergic+amacrine+cells+lacking+Gbeta5%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+physiological+properties+of+cat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells.</a> J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unconventional+Glutamatergic+Circuit+in+the+Retina+Formed+by+vGluT3+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells.</a> Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).</li>
<li>Hoggarth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+wiring+of+distinct+amacrine+cells+in+the+directionally+selective+retinal+circuit+permits+independent+coding+of+direction+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size.</a> Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).</li>
<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Birçok laboratuvar hazırlık 15-18 montaj düz GCL nöronlardan kaydettik, ama bizim prosedürler INL nöronlardan kayıt izin verir. Biz burada başarılı rutin kayıtlar için kritik olan birkaç adım vurgulamak. retina tazelik ve düzlük bir kayıt pipet ile nüfuz için önemlidir. Bu bağlamda, delme nitroselüloz zara retinanın sağlam bağlanma çok önemlidir ve zamanında tekrar nemlendirme (Aşama 3.4-3.6) ve ardından çözelti geçici emme ile elde edilir. Bu kısa dönemde, genellikle az 30 sn, vi...

Merkezi sinir sisteminin kolay erişilebilir bir parçası olan retina, onlarca yıldır sinirbilim çalışmalarında yararlı bir model olmuştur. Nöronların genetik olarak işaretlenmesi, retinadaki sinaptik bağlantıların ayrıntılı karakterizasyonuna izin vermiştir. Retinal nöronların işlevini ve morfolojisini incelemek için birçok metodoloji mevcut olduğundan, yama klemp kayıt tekniği, retinada dikey olarak iletilen sinyalleri mevcut anlayışımızda etkili olmuştur. Bu sinyaller, fotoreseptörlerdeki foton absorpsiyonundan kaynaklanır ve retinal ganglion hücrelerinin (RGC'ler) sivrilmesi yoluyla beyin görme merkezlerine gönderilir. Şimdiye kadar biriken büyük bir bilgi birikimine rağmen, vaskülarize memeli retinasındaki nöral çeşitlilik çözülmemiş durumda ve normal görüşe hizmet eden retina devrelerinin tam olarak değerlendirilmesini engelliyor. Bunun nedeni kısmen, çoğu kaydın daha proksimal retinal nöronlara1-3 erişim için yanal devre bütünlüğünü takas etmek için retina dilimleri üzerinde gerçekleştirilmiş olmasıdır. Retinanın görsel sinyalleri nasıl hesapladığına dair kapsamlı bir resim elde etmek için, nöronların, büyük ve küçük yanal bağlantıların daha iyi korunabileceği düz yuvalarda kaydedilmesi arzu edilir.
Fotoreseptörlerden bipolar hücrelere sinaptik iletim, depolarize bipolar hücreler4-6'daki kusurlu bir metabotropik glutamat reseptörü 6 (mGluR6) sinyal yolu nedeniyle veya sadece dejenere retinalardaki fotoreseptör kaybının bir sonucu olarakkesildiğinde 7-10, birçok RGC salınım aktiviteleri sergiler. Bu salınımlar birden fazla kaynaktan kaynaklanır, ancak AII amakrin hücreleri (AII-AC'ler) ve depolarize edici koni bipolar hücreler (DCBC'ler) arasındaki boşluk bağlantı eşleşmesini içeren en fazla ilgiyi görmüştür ve bu nedenle en iyi anlaşılmıştır1,7,11. Yukarıda bahsedilen AII-AC/DCBC ağının farmakolojik ablukası altında devam eden ve deafferentasyonlu retinaları olan RhoΔCTA ve Nob farelerinde OFF tipi SAC'lerin salınımını sağlayan başka bir kaynak bulduk7,8,12. Burada, INL nöron kaydı için retinal düz montajlar hazırlama protokolümüzü detaylandırıyoruz. Bu yaklaşım, kontrast arttırıcı optiklerle donatılmış bir floresan mikroskop altında tanımlanabilen floresan protein (tdTomato) ekspresyonu ile kolinerjik retinal nöronları işaretlemek için ticari fare hatlarını (Jax stok no. 006410 ve 007905) kullanır. Bu yaklaşımla elde edilen bazı deneysel sonuçlar daha önce bildirilmiştir4,5,7,13.

<table><tbody><tr>DIC <td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td>Mikromanipülatörlere <td>sahip sabit kademeli floresan mikroskop</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Yama kelepçesi amplifikatörü</td><td>A-M Sistemi</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>AD dönüştürücü</td><td>Ulusal Enstrüman</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>Isıtıcı kontrol cihazı</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Satır İçi ısıtıcı</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltik pompa</td><td>Rainin</td><td>Dynamax</td><td></td></tr><tr><td>pipet çektirme</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Filamentli cam tüp</td><td>King Hassas Cam</td><td>Özelleştirilmiş</td><td></td></tr><tr><td>Stimülatör</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biyosit</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</alt></td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glukonat</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-glukonat</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-metansülfonat</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>Rainin</td><td></td><td></td>17013002</tr><tr><td>10 & mu; l pipet ucu</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

deafferentated fare retina bir düz montaj hazırlık patlaması amacrine hücreleri yama kelepçe kaydı

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

Memeli retina birden nöronal tip oluşan tabakalı bir dokudur. onun karmaşık sinaptik ağ içinde nasıl işlendiğini görsel sinyaller anlamak için, elektrofizyolojik kayıtlar sık ​​sık bireysel nöronlar arasındaki bağlantıları incelemek için kullanılır. Biz fare retina GCL (ganglion hücre tabakası) ve INL hem de genetik olarak işaretlenmiş nöronların yama kelepçe kayıt (iç nükleer tabaka) için düz montaj hazırlık optimize ettik. dikey ve yanal hem de bağlantıları eski yapılandırmasında korunur, çünkü düz bağlar kayıt INL nöronlar incelenecek büyük yanal bileşenleri ile retina devreleri izin dilimleri üzerinde tercih edilmektedir. Biz kolinerjik dolup taşan amacrine hücreleri (keseler) olarak retina ayna ortaklı nöronların cevapları karşılaştırmak için bu yordamı kullandık.

Içi ve bir deafferentated fare retina kapalı tip BİLSEM&#39;lerin Örnek kayıtları, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. GCL ve INL hem de kolinerjik hücre güvenilir tdTomato floresan ile tanımlanmış ve DIC altında bütün hücre yama kelepçe kayıt için hedef olabilir (Şekil 1 A) onların membran potansiyelleri (üst izleri) ve (alt izleri, Şekil 1B) o sürücü sinaptik akımların salınımını ortaya çıkarmak için. Inhibitör ve eksitatör sinaptik akımla...

Bu protokol, düz monte hazırlık retina nöronlar üzerinde tüm hücre yama kelepçe kayıt yapmak gösterilmiştir.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Bu prosedürün genel amacı, düz montajlı fare retina preparasyonundaki iç retina nöronlarından tüm hücre yamalı kenetleme (whole-cell patch clamp) kaydı gerçekleştirmektir. Bu yöntem, nöronların çeşitliliği, normal ve patolojik koşullar altındaki sinaptik bağlantıları gibi retinal nörobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hem dikey hem de lateral bağlantıların korunmasıyla geniş lateral bileşenlere sahip retina devrelerinin incelenmesine olanak tanımasıdır.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler zorlanacaktır çünkü retina, büyük bir dikkat ve sabırla işlenmesi gereken ince ve hassas bir dokudur. Ancak, bu yöntemde uzmanlaşmanın en iyi yolu pratik yapmaktır. Bu prosedüre başlamak için, herhangi bir kanı temizlemek amacıyla fare göz kürelerini temiz bir kağıt havluyla yuvarlayın.Ardından, bunları karbogenli memeli Ringer solüsyonuna daldırın. Sonra, 23 gauge bir iğne ile limbus üzerinde bir delik açın ve mikro makasla limbus boyunca keserek göz kürelerini ikiye bölün. Ardından, ince pensler kullanarak korneayı ve lensi çıkarın.Retina bütün montajı (whole-mount) için, tüm retinayı ince pensle pigmente epitelyumdan nazikçe soyun ve kenardan optik sinir başına doğru 1,5 ila iki milimetrelik dört ortogonal kesi yapın. Ardından, delikli bir nitrocellulose membranı kabın içine daldırın ve retinayı, GCL tarafı yukarı bakacak şekilde membran üzerine nazikçe çekin. Bütün montaj retina hazırlarken, optik sinir başını merkezdeki deliğe yerleştirin.Ardından, retinayı içeren membranı başka bir temiz kaba aktarın. Retinayı ince bir resim fırçasıyla nazikçe Malta haçı şeklinde düzeltin ve dört kenarının tamamını deliklerin üzerine yerleştirin. Nitro selüloz membranı kuru bir filtre kağıdı parçasıyla kurulayın; vitreus ve iç sınırlayıcı membranı pens ve resim fırçası yardımıyla uzaklaştırın.Düzeneği, alt kısmında sızdırmaz bir cam lam olan kayıt haznesine aktarmadan önce tüm retinal kenarların membrana tamamen yapışmış olduğundan emin olun. Membranı vakum gresi ile lama sabitleyin ve retinayı dış solüsyon ile yeniden hidrate edin. Düzenek altında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin.Ardından, hazneyi dik bir mikroskobun tablasına yerleştirin. Hazneye, dakikada yaklaşık üç mililitre hızla 34 °C sıcaklıkta karbogene doyurulmuş dış çözelti verin. Retinayı önce 10x objektif lens altında inceleyin.Ardından, GCL ve INL nöronlarını DIC ve epifloresan ayarlarında görmek için 60x su daldırma objektifi kullanın. tdTomato eksprese eden SAC'leri görüntülemek için, 554 nanometrelik bir eksitasyon filtresi ve 581 nanometrelik bir emisyon filtresi ile birlikte beyaz bir LED ışık kaynağı kullanın. Bu prosedürde, iç solüsyonu bir şırınga filtresi aracılığıyla özel geri dolum filamentine filtreleyin.Ardından, filamenti yeni çekilmiş bir mikropipete yerleştirin ve iç solüsyonu, solüsyon gümüş elektrot telini beş milimetreden fazla kaplayana kadar uç kısmının yakınına boşaltın. Sonrasında, mikropipeti, bağlı olan 10 milliliter plastik şırınganın pistonu itilip çekilerek elektrot içindeki basıncın ayarlanabildiği bir vakumlu çekişe sahip elektrot tutucusuna sabitleyin. Daha sonra, pipeti objektifin altına konumlandırın ve retinanın yaklaşık 100 micrometers üzerine kadar indirin.Mevcut takipçi modunda, sabit DC voltaj sinyalini sıfırlamak için DC ofsetini kullanın. Pipet banyodayken, pipet üzerinden sabit genlikli kare dalga akımları enjekte ederek akım kenetleme modunda pipet direncini ölçün. Raccess düğmesini çevirerek farkı nötralize edin ve pipet direncini hesaplamak için üzerindeki okumayı kullanın.Bundan sonra, elektrodu yavaşça retinanın yaklaşık 10 µm üzerine getirin. Elektroda pozitif basınç uygulayın. Ardından, pipet ucu retinaya yaklaşırken yansımanın nasıl değiştiğini gözlemleyin.Pipeti hızlı ancak nazikçe GCL içine itin ve pozitif basıncı hemen azaltın. Pipeti etiketlenmiş bir nörona doğru hareket ettirin; diğer nöronlar, kan damarları ve Müller hücrelerinin uç ayaklarıyla temastan kaçının. Elektrot tıkanıklığını önlemek için gerekirse daha fazla pozitif basınç uygulayın.Ardından, bir girinti görünene kadar pipet ucunu etiketlenmiş nöronun yanına konumlandırın. Daha sonra, pozitif basıncı serbest bırakın ve plazma membranının pipet ucuna geri sıçramasına izin verin. Gigaohm sızdırmazlığının (gigaohm seal) oluşmasına yardımcı olmak için pipete 20 ila 120 picoampere negatif akımlar uygulayın.Pozitif basınç serbest bırakıldıktan sonra hücre membranının geri esnemesine izin vermek önemlidir; çünkü kayıt sonrası hücre morfolojisinin korunması için membran ile pipet ağzı arasında doğal olarak mükemmel bir sızdırmazlığın oluşması gerekir. Gerekirse, plazma membranını pipetin içine çekmek için hafif bir vakum uygulayın. Sızdırmazlık oluştuktan sonra, dökülen iç solüsyonun superfüzyon yoluyla temizlenmesine izin vermek için hücre membranını yırtmadan önce beş dakika bekleyin.Membran yırtıldıktan sonra ve akım klemp modundayken, köprü dengelemesini açın ve Raccess düğmesini kullanarak ayarlayın. Hücreyi geri dönüş potansiyellerinde tutarak voltaj klemp modunda eksitatör ve inhibitör postsinaptik akımları kaydedin. Kayıt işleminden sonra, pipeti somadan nazikçe çıkarın.Düzenek, odadan temiz bir kaba aktarılır. Ardından, tespit işlemi sırasında retinanın düz kalmasını sağlamak için delik açmadan, retina başka bir düzleştirilmiş nitrocellüloz membrana ayrılıp yeniden sabitlenir. Doku artık boyama işlemi için hazırdır.Bu görüntüler, hem GCL hem de INL'deki kolinerjik hücrelerin tdTomato floresansı ile güvenilir bir şekilde tanımlanabildiğini ve DIC altında tüm hücre yama kenetleme (whole-cell patch clamp) kaydı için hedeflenebildiğini göstermektedir. Membran potansiyellerinin osilasyonu akım kenetleme (current clamp) kaydı ile ortaya çıkarılabilir; inhibitör ve eksitatuar sinaptik akımların yönlendirdiği osilasyonlar ise voltaj kenetleme koşulları altında hücrelerin sırasıyla sıfır milivolt ve negatif 75 milivolta sabitlenmesiyle belirlenir. Burada, kaydedilen hücrelerin kayıt sonrası histolojik karakterizasyonu, IPL'deki tipik SAC dendritik morfolojisini ve stratifikasyon seviyelerini göstermektedir.Bu prosedürü uygularken, kaydedilebilir bir örnek elde etmek için retina membran düzeneğinin kayıt odasına sıkı ve hassas bir şekilde sabitlendiğinden ve altında hava kabarcığı kalmayacak şekilde yeniden hidrate edildiğinden emin olmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, hedef çoklu hücrelerin osilasyonlarının aynı sinaptik mekanizmalar tarafından yönlendirilip yönlendirilmediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla çift yama kenetleme (dual-patch clamp) kayıtları gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, retinal nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların fotoreseptör dejenerasyonu olan retinalarda komşu retinal nöronlar arasındaki osilasyon senkronizasyonunu keşfetmelerinin önünü açmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, vitreus hümörün nasıl uzaklaştırılacağı ve iç retinal nöronlardan hedeflenmiş tam ölçekli patch clamp kaydı yapmak için retinal flat-mount örneğinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

patch-clamp-recording-starburst-amacrine-cells-flat-mount-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Bu makale, fare izole retinal hazırlanması incelemek ve kaydetmek için nasıl bir açıklama sağlar. Özellikle, floresan etiketli ganglion hücre popülasyonu ışık yanıtlarını kaydetmek ve daha sonra belirlemek ve morfolojisi analiz nasıl açıklar.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

Biz sağlam fare retinadan çubuk ve koni photoresponses elde etmek için transretinal elektroretinogram (ERG) kayıtları nispeten basit bir yöntem sunduk. Bu yaklaşım ışığında cevaplar ayırmak ve izole düz monte retina arasında yer alan elektrotlar kullanarak bunları kaydetmek için fotoreseptör gelen sinaptik iletim bloğu yararlanır.

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

Bu makale, tek tek hücrelerin sağlam fare retinada floresan etiketli nöron popülasyonları kayıt gösteriyor. Iki foton kızılötesi uyarma kullanarak transgenetically etiketli hücreleri ışık tepkileri, açık alan özellikleri, ve morfoloji çalışması için patch-klemp kayıt için hedef alındı.

Bozulmamış Retina Elektrofizyolojik Karakterizasyonu GFP-ifade eden hücre popülasyonlarının

Bu video, düz montajlı bir fare retinasından elektrofizyolojik kayıt için tam hücre yama kelepçesi tekniğini göstermektedir. Retina içindeki yıldız patlaması amakrin hücrelerine (SAC'ler) yaklaşmak için elektrotlu ince bir cam pipet kullanılır. Bir conta oluşturduktan sonra, zarı yırtmak ve tüm hücre yama-kelepçe konfigürasyonunu oluşturmak için emme uygulanır. Son olarak, iyonların SAC sinaptik reseptörlerinden akışı konfigürasyon kullanılarak ölçülür.

Düz Montajlı Bir Fare Retinasından Elektrofizyolojik Kayıt için Tam Hücre Yama Kelepçesi Oluşturma

Bu video, karanlığa uyarlanmış bir fare retina dokusu dilimi hazırlığında ışıkla uyarılan post-sinaptik yanıtların kaydını göstermektedir. Retina dilimi bir kayıt odasına yerleştirilir ve bir retinal ganglion hücresi ile elektriksel süreklilik sağlamak için bir kayıt pipeti kullanılır. Pipet tarafından kaydedilen ganglion hücrelerinde uyarıcı post-sinaptik potansiyeller oluşturmak için ışık darbeleri uygulanır.

Fare Retina Dilimlerinin Nöronlarında Işık Uyarılmış Postsinaptik Yanıtlar

Bu video makalede hücre gövdeleri yama kurulum, usul ve nasıl tüm montaj fare retinae ganglion hücrelerinden dinamik kelepçe kayıtları uygulamaya göstermektedir. Bu teknik, eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi kesin katkısının incelenmesi ve nöronal spike için göreceli büyüklüğü ve zamanlaması sağlar.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Fare gözünden retina dilimlerinin nasıl hazırlanacağını ve retina nöronlarında ışık tepkilerinin nasıl kaydedileceğini göstereceğiz. Tüm prosedür karanlığa uyarlanmış koşullarda gerçekleştirilir.

Kayıt Patch Kelepçe Teknikleri Kullanarak Koyu adapte Fare Retina Dilim Hazırlıkları Nöronlar içinde postsinaptik Yanıtları Işık-uyarılmış

Biz fare retinanın ex-vivo dilim hazırlık kullanarak koni fotoreseptörlerin akson terminallerinde Ca 2 + dinamiklerini izlemek için bir protokol açıklar. Bu protokol önemli bir memeli model sisteminde koni Ca 2 + sinyalizasyon kapsamlı çalışmalar, fare verir.

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Biz retina yüzeyine paralel kesit düzlemi ile erişkin memeli retina yatay dilim hazırlık geliştirdi. nonradially odaklı retinal nöronların dendritik alanları patch-kelepçe ve görüntüleme teknikleri ile sinyal işleme çalışma izin kesilmiş değil.

Elektrofizyolojik Çalışmalar Yetişkin Fare Retina Yatay Dilimleri hazırlanması

Bu çalışma, fotoreseptör hücre gövdelerinin çıkarılmasının daha hızlı antikor difüzyonu ve immünohistokimya, in situ hibridizasyon ve elektrofizyoloji deneyleri için iç retinal nöronlara gelişmiş yama pipet erişimi sağladığı alternatif bir düz montajlı retina preparatı sunmaktadır.

Omurgalı Retinasında İç Nükleer Tabaka Nöronlarını İncelemek için Geliştirilmiş Bir Düz Montaj Preparatı Olarak Bölünmüş Retina

Öğrenin fare retinası düz montaj hazırlama ve iç retina nöronlarında yama kelepçe kaydı yapma yöntemini. Bu teknik sinaptik bağlantıları incelemek için kullanılır.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Daha fazla video keşfet