Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

Bu prosedürün genel amacı, düz montajlı fare retina hazırlığında iç retina nöronlarından tam hücre yama kelepçesi kaydı yapmaktır. Bu yöntem, retinal nörobiyoloji alanındaki nöronların çeşitliliği, normal ve patolojik koşullar altında sinaptik bağlantıları gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hem dikey hem de yanal bağlantıların korunmasıdır, bu da büyük yanal bileşenlere sahip retina devrelerinin incelenmesine izin verir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, retinanın büyük bir özen ve sabırla ele alınması gereken ince, hassas bir doku olması nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bununla birlikte, pratik yapmak, ustalaşmanın en iyi yoludur. Bu işleme başlamak için, kanı çıkarmak için fare gözbebeklerini temiz bir kağıt havluya yuvarlayın.

Ardından, onları karbojene memeli Ringer çözeltisine daldırın. Ardından, 23 gauge bir iğne ile limbus üzerine bir delik açın ve mikro makasla limbus boyunca keserek göz kürelerini ikiye bölün. Ardından, ince forseps kullanarak korneayı ve lensi çıkarın.

Retinal tam montaj için, ince forseps ile pigmentli epitelden tüm retinayı nazikçe soyun ve kenardan optik sinir kafasına doğru dört adet 1,5 ila iki milimetre ortogonal kesi yapın. Bundan sonra, delikli bir nitroselüloz zarı tabağa daldırın ve retinayı GCL tarafı yukarı bakacak şekilde yavaşça üzerine sürükleyin. Ardından, tam montajlı bir retina hazırlarken optik sinir kafasını ortadaki deliğe yerleştirin.

Daha sonra, zarı retina ile birlikte başka bir temiz kaba aktarın. İnce bir boya fırçasıyla retinayı Malta haçı gibi nazikçe düzleştirin ve dört kenarı da deliklerin üzerine yerleştirin. Nitroselüloz membranı bir parça kuru filtre kağıdı ile kurulayın ve camsı ve iç sınırlayıcı membranı forseps ve bir boya fırçası ile çıkarın.

Düzeneği, altta sızdırmaz bir cam kapak sürgüsü ile kayıt odasına aktarmadan önce tüm retina kenarlarının membrana tam olarak yapıştığından emin olun. Membranı vakumlu gres ile kapak kızağına sabitleyin ve retinayı harici solüsyonla yeniden sulandırın. Tertibatın altına hava kabarcığı sıkıştırmamaya dikkat edin.

Ardından, odayı dik bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Odayı, dakikada yaklaşık üç mililitre oranında 34 santigrat derece karbojene dış çözelti ile doldurun. Önce retinayı 10x subjektif lens altında inceleyin.

Ardından, DIC ve epifloresan ayarı altında GCL ve INL nöronlarını görmek için 60x suya daldırma lensi kullanın. tdTomato eksprese eden SAC'leri görselleştirmek için, 554 nanometrelik bir uyarma filtresi ve 581 nanometrelik bir emisyon filtresi ile birlikte beyaz bir LED ışık kaynağı kullanın. Bu prosedürde, dahili çözeltiyi bir şırınga filtresinden özel dolgu filamentine süzün.

Ardından, filamenti yeni çekilmiş bir mikropipete yerleştirin ve çözelti gümüş elektrot telini beş milimetreden fazla kaplayana kadar iç çözeltiyi ucun yakınında dağıtın. Daha sonra, mikropipeti, 10 mililitrelik plastik şırıngaya bağlı bir tüpün pistonunu iterek veya çekerek elektrot içindeki basıncın ayarlanabildiği bir emme çekişi ile bir elektrot tutucusuna sabitleyin. Ardından, pipeti objektifin altına yerleştirin ve retinanın yaklaşık 100 mikrometre üzerine indirin.

Akım takipçisi modunda, duran DC voltaj sinyalini sıfırlamak için DC ofsetini kullanın. Banyodayken pipetten sabit genlikli kare dalga akımları enjekte ederek akım kelepçesi modunda pipet direncini ölçün. Raccess düğmesini çevirerek farkı nötralize edin ve pipet direncini hesaplamak için üzerindeki okumayı kullanın.

Bundan sonra, elektrodu yavaşça retinanın yaklaşık 10 mikrometre üzerine getirin. Elektroda pozitif basınç uygulayın. Ardından, retinaya yaklaşırken pipet ucunun yakınındaki yansıma değişimini izleyin.

Hızlı ama nazik bir şekilde pipeti GCL'ye doğru itin ve pozitif basıncı hemen azaltın. Pipeti etiketli bir nörona doğru hareket ettirin ve diğer nöronlara, kan damarlarına ve Muller hücrelerinin uç ayaklarına temas etmekten kaçının. Elektrot tıkanmasını önlemek için gerekirse daha fazla pozitif basınç uygulayın.

Ardından, pipet ucunu bir çukur görünene kadar etiketli nöronun yakınına yerleştirin. Ardından, pozitif basıncı serbest bırakın ve plazma zarının pipet ucuna geri sıçramasına izin verin. Bir gigaohm contasının oluşmasına yardımcı olmak için pipete 20 ila 120 pikoamper negatif akım uygulayın.

Pozitif basıncı serbest bıraktıktan sonra hücre zarının geri sıçramasına izin vermek önemlidir, çünkü kayıttan sonra hücre morfolojisini korumak için zar ile pipet açıklığı arasında doğal olarak oluşan mükemmel bir sızdırmazlık önemlidir. Gerekirse, plazma zarını pipetin içine çekmek için hafif bir emme uygulayın. Dökülen iç çözeltinin süperfüzyonla temizlenmesini sağlamak için hücre zarını yırtmak için conta oluşumundan sonra beş dakika bekleyin.

Membran yırtıldıktan sonra ve mevcut cl modundaykenamp modunda, köprü dengesini açın ve Raccess düğmesini kullanarak ayarlayın. Hücreyi ters potansiyellerde tutarak uyarıcı ve inhibitör postsinaptik akımları voltaj kelepçesi modunda kaydedin. Kayıttan sonra, pipeti soma dan yavaşça çıkarın.

Düzeneği hazneden temiz bir tabağa aktarın. Ardından, fiksasyon sırasında retina düzlüğünü sağlamak için retinayı delik açmadan başka bir düzleştirilmiş nitroselüloz zara ayırın ve yeniden takın. Doku artık lekelenmeye hazırdır.

Bu görüntüler, hem GCL hem de INL'deki kolinerjik hücrelerin tdTomato floresan ile güvenilir bir şekilde tanımlanabileceğini ve DIC altında tam hücre yama kelepçesi kaydı için hedeflenebileceğini göstermektedir. Membran potansiyellerinin salınımı, akım kelepçesi kaydı ile ortaya çıkarılabilir ve inhibitör ve uyarıcı sinaptik akımlar tarafından yönlendirilen salınım, hücrelerin voltaj kelepçesi koşulları altında sırasıyla sıfır milivolt ve negatif 75 milivoltta tutulmasıyla ortaya çıkar. Burada, kaydedilen hücrelerin post hoke histolojik karakterizasyonu, IPL'deki tipik SAC dendritik morfolojisini ve tabakalaşma seviyelerini gösterir.

Bu prosedürü denerken, kaydedilebilir bir numune sağlamak için retina zarı düzeneğini kayıt odasına sabitlemeyi ve altına hava kabarcıkları sıkıştırmadan sıkı ve hassas bir şekilde rehidre etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hedef çoklu hücrelerin salınımlarının aynı sinaptik mekanizmalar tarafından yönlendirilip yönlendirilmediği gibi ek soruları yanıtlamak için çift yamalı kelepçe kayıtları gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, retinal nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların, fotoreseptör dejenere retinalardaki komşu retinal nöronlar arasındaki salınımın eşzamanlılığını keşfetmelerinin yolunu açar.

Bu videoyu izledikten sonra, vitreus mizahının nasıl çıkarılacağını iyi anlamalı ve iç retinal nöronlardan hedeflenen tam ölçekli yama klemp kaydı için bir retinal düz montaj hazırlamalısınız.