Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Bu prosedürün genel amacı, transdüksiyon-transplantasyon yöntemini kullanarak hematopoetik hücrelerde ilgilenilen genin eksprese edildiği fareler üretmektir. Bu yöntem, kısa bir süre içinde ilgilenilen geninizin hematolojik bir maligniteye yol açıp açmadığı sorusuna cevap vermeye yardımcı olabilir. Potansiyel terapötiklerin test edilebileceği fare modellerinin hızlandırılmış geliştirilmesi sayesinde, bu tekniğin etkileri hematolojik malignitelerin tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem hematolojik maligniteler hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, normal hematopoezde ilgilenilen bir genin rolünü incelemek için de kullanılabilir. Genel olarak, bu deneyde yeni olan kişiler, çok sayıda adım gerektirdiği için zorluk yaşayabilirler. Ayrıca, yüksek titreli bir virüs üretimi, bu deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir.

Farelerle çalışmak zor olabildiği ve pratik gerektirdiği için bu prosedürün görsel gösterimi önemlidir. Bir fareyi anestezi altına aldıktan ve metin protokolüne göre anestezinin derinliğini kontrol ettikten sonra, fareyi yan tarafına doğru konumlandırın ve başparmak ile işaret parmağınızı kullanarak, göz baş kısmından hafifçe çıkacak şekilde hayvanı sabitleyin. Retro-orbital enjeksiyon yoluyla kilogram başına 150 miligram 5-flurouracil veya 5-FU enjekte etmek için, 27-gauge yarım inçlik bir iğneyi 45 derecelik bir açıyla, eğik ucu yukarı bakacak şekilde medial yönde yerleştirin ve iğne yarıya kadar girdiğinde durun.

Çözeltiyi yavaşça enjekte edin ve ardından iğneyi dikkatlice çıkarın. Fareyi şişme veya kanama gibi herhangi bir yaralanma belirtisi açısından inceleyin ve farenin kendisini toparlayıp yürümeye başladığından emin olun. Beş gün sonra, hayvanı metin protokolüne uygun olarak sakrifiye ettikten sonra, kürk ıslanana kadar bolca püskürterek %70 ethanol ile sterilize edin.

Diseksiyon makasıyla deride bir kesi yapın ve fasyayı bacak kaslarından ayırın. Ardından, femur kemiğini kalçadan ve tibia kemiğini ayak bileğinden keserek bacağı fareden ayırın. Bacağı L şekline getirin ve diz ekleminden keserek her bir bacak kemiğini disseksiyon makasıyla birbirinden ayırın.

Ardından, kıkırdak ayrılana kadar kası bacak kemiğinin bir ucuna doğru nazikçe kazıyın. Daha sonra, %2 FBS ile desteklenmiş PBS içerisinde, hasat edilen hücre sayısını maksimize etmek için kemik beyazlaşana kadar, 27 gauge yarım inç iğneli bir şırınga kullanarak her bir bacak kemiğini 100 mikrometrelik bir naylon membran üzerinden 50 mililitrelik konik bir tüpe yıkayın. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri şırınga pistonuyla naylon membran üzerinden 50 mililitrelik konik tüpün içine itin.

Diğer fare bacağı ile işlemi tekrarlayın. Toplanan hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 ×g'de santrifüj edin ve süpernatantı atın. Ardından, kemik iliğini yeniden süspansiyon haline getirmek için 5 mL amonyum klorür potasyum veya ACK ekleyin.

Kırmızı kan hücrelerini liz etmek için hücre süspansiyonunu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Liz işlemini durdurmak için tüpü PBS ile doldurun. Ardından, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.

Hücreleri 5 mL PBS ile yeniden süspande edin ve Trypan blue dışlama yöntemiyle, bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Ardından, hücreleri mL başına 2x10⁶ olacak şekilde yeniden süspande etmek için 2x pre-stem kokteyli ekleyin. Daha sonra, altı kuyucuklu plakaların kuyucuklarına 2 mL ekleyin.

Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her kuyucuğa iki mililitre viral süpernatan ve ardından mililitre başına sekiz mikrogram polybrene ekleyin. Plakaları 30 °C'de 1500 ×g hızında 90 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından plakaları gece boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Hücre süspansiyonunu konik tüplere pipetleyin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 400 ×g'de santrifüjleyin. Hücreleri yeniden süspandirmek için kuyuk başına 2x pre-stem kokteyli kullanın ve hücreleri orijinal kuyucuklara yeniden ekin.

Metin protokolüne göre alıcı fareler transplantasyona hazırlandıktan sonra, süpernatantı konik tüplere nazikçe pipetleyerek altı kuyucuklu plakalardan transduce edilmiş donör hücreleri hasat edin. Her kuyucuğu yıkamak için 1 mL PBS kullanın ve kalan hücreleri tüplerde toplayın. Kuyucuklara 0,5 mL %0,05 tripsin ekleyin ve 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, kuyucuklara bir mililitre D-10 ekleyin ve kalan hücreleri nazikçe pipetleyerek ayırın. Sonra, hücreleri ilgili tüplere aktarın ve 4 °C'de 400 ×g'de 10 dakika santrifüj ederek çöktürün. Hücreleri PBS ile tekrar yıkayın.

Ardından, santrifüj işleminden sonra, hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için beş mililitre PBS kullanın ve Trypan mavi dışlama yöntemi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Farelere enjeksiyon için, 5 × 10⁵ ile 2 × 10⁶ arası hücreyi 50 ila 100 µL PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirin. Fareyi yan tarafına gelecek şekilde konumlandırın ve göz baş kısmından hafifçe çıkıntı yapacak şekilde başparmak ve işaret parmağınızla sabitleyin.

Bevel kısmı yukarı bakacak şekilde, iğneyi medial kantusun yan tarafına 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve enjeksiyonu gerçekleştirin. Enjeksiyondan sonra, fareyi enjeksiyon bölgesinde şişlik veya kanama gibi herhangi bir yaralanma belirtisi açısından inceleyin ve enjeksiyon sonrası ek bakım için metin protokolüne başvurun. Son olarak, metin protokolüne uygun olarak kandaki GFP ekspresyonunu analiz edin.

Bu şekil, GFP yüzdesinin canlı hücre kapısından toplanan olaylardan hesaplandığı durumlarda göreli viral titrenin nasıl hesaplanacağını göstermektedir. Burada, hücre başına birden fazla viral partikül içeren bir titre gösterilmekte olup, bu örnekler hücre başına tek viral partikül içeren titreleri temsil etmektedir. İdeal olarak, viral süpernatantın 1/30 seyreltmesinde GFP-pozitif hücrelerin en az %50'si tespit edilmelidir.

Bu deneyde, CALRdel52 farelerinin artmış trombositler, kemik iliğinde artmış megakaryositler ve kemik iliği fibrozisi ile seyreden bir MPN fenotipi sergilediği başarılı bir transplant alıcısı sunulmaktadır. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde sekiz gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, protokolün her adımının takip edilmesi önemlidir.

Bu teknik geliştirildikten sonra, araştırmacıların hematopoezdeki spesifik genlerin etkilerini incelemelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hematopoetik hücrelerde ilgilendiğiniz geni eksprese eden farelerin nasıl üretileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.