3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

Bu protokolün genel amacı, standart laboratuvar ekipmanı kullanarak biyolojik örneklerin yüksek çözünürlüklü 3D dijital görüntülerini hızlı bir şekilde elde etmektir. Bu yöntem, karmaşık morfolojik özelliklerin görselleştirilmesi ve dinamikleri yoluyla gelişim biyolojisi alanındaki temel soruları cevaplayabilir. Bu tekniğin temel avantajları, standart laboratuvar ekipmanı kullanması ve minimum ön deneyim gerektirmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Jungang Huang olacak. Embriyonun metin protokolünde tarif edildiği gibi diseksiyonu ve fiksasyonundan sonra, fiksatifi temizleme solüsyonu ile değiştirin ve numuneyi bir ila iki hafta boyunca oda sıcaklığında bir külbütör üzerinde yavaşça döndürün. Kuluçka süresinin sonunda, numuneyi% 10 formaline aktarın ve iki gün daha külbütörde bırakın.

Üçüncü gün, numuneyi beş dakikalık üç yıkama için PBS'de yıkayın. Daha sonra numuneleri, oda sıcaklığında artan bir etanol serisinde, her konsantrasyon için iki saat boyunca yumuşak bir külbütör üzerinde kurutun. % 100 etanol dehidrasyonundan sonra, numuneyi ışıktan koruyarak bir saat boyunca boyama çözeltisine aktarın.

Ardından, numunenin gece boyunca etiketlenmesi için çözeltiyi taze boyama çözeltisi ile değiştirin. Ertesi sabah, numuneyi dört santigrat derecede bir külbütör üzerinde en az üç saat boyunca taze hazırlanmış sızma ve boyama solüsyonlarının bire bir hacim karışımına daldırın. Kuluçka süresinin sonunda, embriyoyu başka bir üç saatlik sallanan inkübasyon için infiltrasyon çözeltisine aktarın.

Ardından, dört santigrat derecede üç gün daha sallanmak için süpernatanı taze sızma solüsyonu ile değiştirin. Dördüncü günde, embriyoyu bir gömme kalıba yönlendirin ve kalıbı buzun üzerine yerleştirin. Çözelti B'yi sızma çözeltisi ile karıştırın ve ardından kalıbı dört santigrat derecede soğuk gömme çözeltisine yavaşça daldırın.

Yaklaşık üç saat sonra, çözeltinin katılaştığını doğrulamak için bir uç kullanın ve numuneyi kalıptan dışarı itin. Fazla gömme malzemesini kesin, ardından numune bloğunu yeni bir kalıba çapraz yönde yeniden yönlendirin. Ardından, tüm kurulumu bir çeker ocaktaki buzun üzerine yerleştirin.

Kalıp suya batırılana kadar yeni kalıba yavaşça gömme solüsyonu ekleyin. Ardından, kalıbın üzerine bir blok tutucu yerleştirin. Üç ila dört saat sonra, gömme kalıbını soyun ve numunenin blok içindeki konumunu belirlemek için bloğu eğik aydınlatmalı bir stereo mikroskop altına yerleştirin.

Blok yüzünde, numunenin etrafındaki ızgara çizgilerini işaretleyin ve çizgileri, fazla gömme malzemesini kesmek için kılavuz olarak kullanın. Numuneyi görüntülemek için önce bloğu bir mikrotoma sıkıştırın ve numunenin yeni bir yüzey kesimini elde edin. Ardından, numunenin blok yüzüne yatay olarak bakacak şekilde bir stereo yakınlaştırma mikroskobu monte edin ve mikroskobu ve beraberindeki bilgisayarı açın.

Ardından, görüntü alma yazılımını başlatın ve optiği blok yüzüne odaklamak için görüntüleme yazılımındaki canlı görüntü modunu kullanın. Mikroskobu ve mikrotomu, blok yüzü vizörün merkezinde olacak şekilde gerektiği gibi hizalayın. Bu prosedürün en kritik adımlarından biri, mikrotomun sabit ev konumunda görüntü elde etmektir.

Tüm blok yüzünün vizörün içinde olduğundan emin olmak için yakınlaştırmayı ayarlayın. Ardından yeşil floresan protein filtresini seçin. Numune dokusu görünene kadar bloğu önceden kesmeye devam edin ve görüntüyü gerektiği gibi yeniden odaklayın.

Pozlama süresini manuel olarak ölçtükten ve ayarladıktan sonra, her yeni kesimden sonra blok yüzünün görüntülerini alın ve kaydedin ve önemli görüntü elde etme parametrelerini kaydedin. Görüntüleme oturumunun sonunda, tüm görüntü dosyalarını dışa aktarın ve JPEG formatına dönüştürün ve tüm orijinal görüntüleri ters çevirmek için uygun görüntü işleme yazılımını kullanın, görüntülerin parlaklığını ve kontrastını gerektiği gibi ayarlayın. Talimatları izleyerek işlenen tüm görüntüleri bir 3D görselleştirme yazılımına yükleyin.

Otomatik modu kullanarak tüm görüntüleri hizalayın ve 3D ve 2D sonuçları gösterin. Bu temsili görüntüde, embriyonik bir 15.5 fare embriyosunun tam montajlı yüzey görünümü hazırlanmış ve az önce gösterildiği gibi görüntülenmiştir. Bıyık yastıkları ve gelişmekte olan saç folikülleri de dahil olmak üzere cildin ayrıntılı morfolojik özellikleri gözlemlenebilir.

Daha da önemlisi, bu yöntemle görüntülenen bir embriyonik gün 15.5 örneğinin sanal kesit görünümünün çözünürlüğü, standart bir histolojik bölüme benzer. Temizleme çözeltisi ile ön işlemden sonra tüm prosedüre hakim olduktan sonra, uygun şekilde gerçekleştirilirse bir hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, infiltrasyon ve gömme adımı sırasında boyama solüsyonunu dört derecede ışıktan korumayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, hücre tiplerinin spesifik dağılım modelleri hakkında ek soruları yanıtlamak için ölçek boyama gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, morfometrik analizleri için biyolojik örneklerin yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerini elde etmek için laboratuvar ekipmanlarının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Fiksasyon, lekeleme ve sızma solüsyonu ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocakta çalıştırma ve eldiven giyme gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.