Name: 3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Öğrenin fare embriyolarında yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi ile 3D görüntüleme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisinde morfometrik analiz için standart laboratuvar ekipmanları kullanarak hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Teknik destekleri için Dr. Yichen Huang, Chunming Guo ve Zhenfang Zhou'ya teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) ve Amerikan Kalp Derneği (AHA, 13GRNT16950006, XL) tarafından finanse edilmiştir.

Tüm hayvan kullandığı Boston Çocuk Hastanesi&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1. Numune Hazırlama <ol><li> Zamanlı çiftleşme <ol><li> Aynı kafeste birlikte C57BL6 vahşi tip erkek ve bir dişi koyun. </li><li> Bir çiftleşme fiş oluşumu sonraki sabah erken olup olmadığını kontrol edin. Çiftleşme fişi (aka vajinal veya çiftleşme fişi) bloke vajina sertleştirilmiş jelatinli birikmesidir. </li><li> embriyonik gün 0.5 (E0.5) olarak fiş tarihini ayarlayın. </li></ol></li><li> Fare embriyolarının izolasyonu <ol><li> CO 2 boğulma hamile kadın öldürülür. </li><li> emici ped sırtüstü fareler koyun ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün. </li><li> Cildi kaldırın ve cerrahi makas kullanarak kaudal karın bölgesinde bir ilk 5 mm kesi yapmak. Kes ve tam iç organları maruz karın cilt kaldırmak </li><li> va yakın Cutgina tüm rahim kaldırmak için. </li><li> uterin horn boyunca implantasyon siteleri arasında kesin. Her segment veya konseptus içinde sadece tek bir embriyo olmalıdır. </li><li> 1x buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde uterus segmentleri tutun. </li></ol></li><li> embriyo diseksiyonu <ol><li> Stereoskop altında buz soğukluğunda PBS ile ayrı bir kapta, her bir konseptus yerleştirin. </li><li> sırayla ince diseksiyon forseps kullanarak rahim dokuları, plasenta ve sonra fetal membranlar çıkarın. </li><li> 1x soğuk PBS büyük transfer pipeti kullanılarak 50 ml&#39;lik bir tüpe parçalara embriyo transferi. doku hasarı en aza indirmek için forseps ile doğrudan embriyo toplayıp kaçının. </li></ol></li><li> tespit <ol><li> fiksatif en az 10 numunelerle fazla 24 saat boyunca 4 ° C&#39;de% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisinde kesildi embriyolar düzeltildi. </li></ol></li><li> Tedavi öncesi <ol><li> Takas Çözüm hazırlayın: 4M üre, çift damıtılmış su içinde% 10 gliserol,% 4 sodyum dodesil sülfat (SDS). </li><li> Takas Çözümü ile fiksatif değiştirin. </li><li> 2 hafta - yavaşça 1 oda sıcaklığında bir rocker örnek döndürün. İkinci ve üçüncü gününde bir kez Takas Çözüm alışverişi. Numune yavaş yavaş açık ve saydam hale gelir. </li><li> % 10 formalin ile Takas değiştirin Çözüm ve 2 gün boyunca bir rocker bırakın. </li></ol></li><li> kurutma <ol><li> Her biri 5 dakika için 1 x 3 defa PBS ile muamele edilmiş numune yıkanır. </li><li> yumuşak bir rocker oda sıcaklığında artan etanol seri örnekleri kurutmak. E15.5 embriyo için,% 50,% 60,% 70,% 80,% 85,% 90,% 95 ve% 100 etanol, 2 saat her bir aşama dahil olmak üzere yükselen etanol serisi kullanır. büyük embriyolar için inkübasyon süresi arttırılması gerekir. </li></ol></li><li> boyanma <ol><li> Eosin Y Disodyum Tuz ve 0.02 0,1375 gram ekleyin: Boyama Çözüm hazırlayınAkridin Portakal Hemi (çinko klorür)% 100 etanol içinde 50 ml tuz 75 gram. 2 saat boyunca karıştırın. Bir filtre kağıdı ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının. </li><li> 1 saat Boyama Çözüm örnek aktarın. </li><li> Taze Boyama Çözüm ve leke gecede ile değiştirin. </li></ol></li><li> Süzülme <ol><li> Sızma çözeltisi hazırlayın: JB-4 gömme kiti çözeltisi bir 100 ml, C Katalizörünün 1.25 g, Eosin Y disodyum tuzunun 0.275 g ve Akridin Portakal Hemi (çinko klorür) tuzunun 0.055 g &#39;ını. 2 saat boyunca, bir buz kova içinde (200 rpm) karışımı karıştırılmış ve bundan sonra filtre kağıdı ile süzülür. </li><li> 4 ° C&#39;de Sızma Çözüm saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının. </li><li> (1: 1) Boyama Çözüm: Çözüm infiltrasyon embriyo transferine ve 4 ° C&#39;de bir rocker en az 3 saat süreyle inkübe. </li><li> Çözüm infiltrasyonuna embriyo transferi ve 3 saat süre ile inkübeSoğuk bir odada bir rocker r. </li><li> bir zamanlar her gün Sızma değiştirin Çözüm ve üç gün daha nazik bir rocker soğuk bir odada bırakın. </li></ol></li></ol> 2. gömülmesi <ol><li> buz üzerinde Çözüm B ve Sızma Çözüm tutun. </li><li> hemen gömmeden önce (Çözüm Yatak ve Sızma Çözüm 1:25) gömülmesi Çözüm olun. </li><li> Bir gömme kalıp Orient örnek, daha sonra yavaşça gömme kalıp içine soğuk katıştırma Çözüm dökün. Yeniden yönlendirmek gerekirse bir iğne ile. </li><li> Gömme Çözüm katılaşmış olup olmadığını incelemek için bir iğne kullanın. Numune bloğu dışarı itmek, ve gerekirse düzeltin. </li><li> çapraz yönlendirme elde etmek için ayrı kalıp kullanılarak örnek blok yönünü değiştirin. </li><li> gömme kalıp üstünde bir blok tutucu koyun. Kalıp ve blok tutucu Çözüm gömülmesi ile batık kadar yavaşça kalıp içine gömülmesi Çözüm dökün. </li><li> ikincil kapta numune tutun ve bırakınBir çeker ocak içinde 4 saat - 3 boyunca buz üzerinde. </li><li> 4 ° C&#39;de katılaştırıldı örnekleri saklayın. </li><li> gömme kalıp uzak soyun. bloğundaki numunenin konumunu incelemek için eğik aydınlatma ile stereomicroscope altında blok koyun. numune etrafında blok yüzünde işaretleyiniz ızgara çizgileri. </li><li> referans olarak işaretlenmiş kılavuz çizgileri kullanarak gömülü malzemenin erişim miktarını kaldırmak için blok Trim. </li></ol> 3. Görüntü Alma <ol><li> mikrotom numune bloğu Kelepçe ve taze kesilmiş bir yüzey elde. Set kesit kalınlığı (örneğin, e9.5-10.5, 1.5 um; e11.5-12.5, 2.0 um; e13.5-15.5, 2.5 mikron; e16.5-yaşlı, 3 um). microtome ev pozisyonunda numune / blok tutun. </li><li> yatay numunenin blok yüzeyine bakan stereo zoom mikroskop monte edin. </li><li> Bilgisayar ve mikroskop açın ve görüntü elde etme yazılımı başlatmak. </li><li> Görselleştirmek ve blok yüze optik odakgörüntüleme yazılımı &quot;canlı görüntü&quot; modunda. </li><li> Blok-yüz vizörün merkezde olacak şekilde gerekirse mikroskop ve mikrotom hizalayın. </li><li> Tüm blok yüz vizör içinde olacak şekilde zoom ayarlayın. </li><li> Yeşil floresan proteini (GFP) filtre (uyarma 470 ± 20 nm, dikroik 495 nm, emisyon 525 ± 25 nm) seçin ve gerekirse tekrar odaklayın. </li><li> Tedbir ve manuel pozlama süresi ayarlayın (örneğin, 80-400 küçük sn). </li><li> Her taze kesilmiş sonra blok-yüz görüntüleri elde etmek ve mümkünse otomatik olarak görüntüleri kaydetmek. </li><li> çözünürlük, kesit kalınlığı ve zoom dahil Tutanak önemli parametreler. </li><li> Tüm örnek, ihracat terbiye ve gerekirse JPEG formatına tüm resim dosyalarını dönüştürdükten sonra. </li><li> Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak tüm orijinal görüntüleri haricindekileri ve parlaklık ve kontrastı ayarlayın. </li><li> Ayrı bir klasördeki tüm işlenmiş görüntüler kaydedin. </li></ol> 4. 3Dgörüntüleme <ol><li> talimatları izleyerek bir 3B görselleştirme yazılımı tüm işlenmiş görüntüleri yükleyin. </li><li> Giriş hassasiyeti ve kesit kalınlığı hacimsel veri (yani voksel boyutu) tüm görüntüleri dönüştürmek ve 3B dosyayı kaydedin. </li><li> Otomatik modu kullanarak tüm görüntüleri hizalayın. Gerekirse elle tek tek görüntüleri ayarlayın. </li><li> yeni bir dosya adı hizalanmış görüntü kaydetme. </li><li> 3D görselleştirme yazılımı kullanarak numunenin morfometrik özelliklerini analiz. </li></ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29, 700-711 (2013).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+model+mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).</li>
<li>Sizarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+and+molecular+analysis+of+the+arterial+pole+of+the+developing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart.</a> J Anat. 220, 336-349 (2012).</li>
<li>Anderson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+intrapericardial+arterial+trunks+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice.</a> Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).</li>
<li>Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+mammalian+cloacal+morphogenesis+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dev Biol. 409, 106-113 (2016).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, hızlı 3 boyutlu görselleştirme ve karmaşık yapıların morfometrik analizi için uyumlu seri HREM görüntüleri elde etmek için rutin laboratuvar ekipmanı kullanılarak modifiye edilmiş bir protokol mevcut. yüksek çözünürlüklü görüntüler yerine bireysel bölümlerin blok yüzüne doğrudan alınır, çünkü ince morfolojik özellikleri korunmuş ve hızla bir 3B görselleştirme programında dijital olarak yeniden yapılandırılmaktadır. 3D görüntü görselleştirmek ve karmaşık morfolojik özellikleri anlaşıl...

3D görüntüleme teknolojilerinin ortaya çıkışı, fetal gelişim sırasında ayrıntılı morfolojik özelliklerin sistemik analizi olasılığını ortaya çıkarmıştır. Mikro manyetik rezonans görüntüleme (mikro-MRI), mikro bilgisayarlı tomografi, yüksek frekanslı ultrason, optik koherens tomografi, optik proje tomografisi ve episkopik mikroskopi1-4 gibi çeşitli 3D görüntüleme modaliteleri mevcuttur. Her modalitenin çözünürlük, kontrast, hız, maliyet, rahim içi kabiliyet ve kullanılabilirlik açısından kendine özgü özellikleri vardır.
Piskopik floresan görüntü yakalama (EFIC) ve yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi (HREM) episkopik mikroskopi görüntüleme yöntemleridir4. Burada doku kesitleri yerine blok yüzünden sürekli olarak yüksek çözünürlüklü seri görüntüler yakalanır. Elde edilen görüntüler, minimum doku distorsiyonu ile veya hiç doku distorsiyonu olmadan ayrıntılı morfolojik özellikleri aslına uygun olarak yansıtır. Elde edilen hacimsel veriler, doğru morfometrik analiz için uygun olan yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntülere kolayca dönüştürülür. Göreceli olarak düşük maliyet ve yüksek çözünürlük nedeniyle, HREM ve EPIC, insan doğum kusurlarının fare modellerinin sistemik değerlendirmesi için üstün alternatifler haline gelmiştir2,4-8.
Hem EFIC hem de HREM yöntemleri, numunelerin uygun ortama gömülmesini gerektirir. EFIC, gömülü dokudan yayılan otofloresanı algılar. Bu nedenle, yüksek düzeyde otofloresan yayan örneklerle sınırlıdır, ancak erken evre embriyolar gibi nispeten zayıf otofloresan yayan örneklerle sınırlı değildir9. Otofloresan bağımlılığının üstesinden gelmek için, numuneler HREM görüntüleme için eozin gibi bir floresan boya ile boyanır. Boya ve boyama yöntemlerinin seçimleri, HREM'i doku mimarisi ve morfolojisi bağlamında moleküler sinyalleri tespit etmek için daha uyumlu hale getirir4,10.
Bu makalede, geç evre fare embriyolarının tüm vücut değerlendirmesi için uygun geliştirilmiş bir HREM protokolü sunuyoruz. Boyamayı kolaylaştırmak için, doku penetrasyonunu artırmak için bir ön işlem adımı ekliyoruz, böylece yaşlı fare embriyolarının HREM görüntülemesini sağlıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Kanıt, Mutlak, ACS/USP/Koşer Sınıfı</td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Temizleme Çözeltisi</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher bilimsel</td><td>G33-4</td><td>Temizleme Çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Temizleme Çözeltisi</td></tr><tr><td>Eosin Y Disodyum Tuzu</td><td>Fisher bilimsel</td><td>BP241925</td><td>Sızma Çözeltisi</td></tr><tr><td>Akridin Portakal hemi (çinko klorür) tuzu</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Sızma Çözeltisi</td></tr><tr><td>Whatman kağıdı</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Gömme Kiti - Çözüm A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Sızma Çözümü</td></tr><tr><td>JB-4 Gömme Kiti - Çözüm B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Gömme Çözümü</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Gömme Kiti - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Sızma Solüsyonu</td></tr><tr><td>Gömme Kalıpları</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Soyulabilir Keskin Gömme Kalıpları</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm x 22 mm kare, 12 mm x 12 mm olarak kesilmiş</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Plastik Blok Tutucular</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Dereceli Transfer Boruları</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Petrl Çanak</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Embriyo diseksiyonu</td></tr><tr><td>Forseps Inox Ucu</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Embriyo diseksiyonu</td></tr><tr><td>Graefe Doku Forsesip</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>Embriyo diseksiyonu</td></tr><tr><td>Hassas Ameliyat Makası</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Embriyo diseksiyonu</td></tr><tr><td>14 ml Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Tüpler</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropilen Konik Tüpler</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Buz Kovası</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3,4 oz.) Antistatik Polistiren Tartı Tekneleri</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11,2 oz.) Antistatik Polistiren Tartı Tekneleri</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>MP Biyomedikal</td><td>102892</td><td>PBS Çözeltisi</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>PBS Çözeltisi</td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS Çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS Çözeltisi</td></tr><tr><td>Dijital Kamera</td><td>Hamamatsu Fotonik</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Aydınlatıcı</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Stereo Zoom Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optik Işık Kaynağı</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Mikrotom Bıçağı</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kenarlı Dağıtıcı</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Yazılımı</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Bilgisayar</td><td>Dell T7600, 2x900 GB SAS sabit sürücü ve 64 GB DDR3 RDIMM bellek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sallanan Platform Çalkalayıcılar</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Standart Sıcak Plaka Karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

3d görüntüleri hızlı toplama yüksek çözünürlüklü episcopic mikroskopi kullanma

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

Yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskobik (HREM) teknolojisi, yüksek çözünürlüklü dijital hacimsel ve üç boyutlu (3D) morfometrik verilerin hızlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Burada, tüm fare embriyosunu görüntülemek için ayrıntılı protokolü açıklıyoruz. Protokol dört ana bölümden oluşur: numune hazırlama, gömme, görüntü elde etme ve son olarak 3D görselleştirme. Teknoloji, numunelerin floresan bir boya ile boyanmasını gerektirir, bu da büyük veya yoğun numuneler için sorunlu olabilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, numuneyi üre ve sodyum dodesil sülfat içeren bir çözelti ile ön işleme tabi tutarak boyanın doku penetrasyonunu arttırmak için mevcut protokolü geliştirdik. Protokol, standart laboratuvar ortamlarında kolay adaptasyon için yalnızca rutin laboratuvar ekipmanı ve reaktifleri kullanır. Elde edilen yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerin, fare embriyolarının iç organlarının ayrıntılı morfolojik özelliklerini aslına uygun olarak özetlediğini ve böylece morfometrik analizlere izin verdiğini gösteriyoruz. Birlikte, küçük ve büyük boyutlu numunelerin yüksek çözünürlüklü 3D görüntülerini elde etmek için standart laboratuvar ekipmanını kullanarak ayrıntılı ve geliştirilmiş bir protokol sunuyoruz.

Biz E9.5 ve E13.5 8 arasında fare embriyoları yüksek kaliteli HREM görüntüler bildirdi. Geç sahnelenen embriyoların Görüntü kalitesi, ancak, önemli ölçüde, çünkü floresan boya eozin sınırlı doku penetrasyonu tehlikeye düşer. Boyama verimini artırmak için, biz floresan görüntüleme 11 uyumlu birkaç ön yöntemleri test ettik. Özel olarak, E15.5 fare embriyo Sca / e A2 12 veya tüm vücut 13 KÜP ile tedavi edildi. Ayrıca aşağıdaki basitleştirilmiş for...

Fare embriyolarının üç boyutlu (3D) görüntülerini elde etmek için yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi kullanan ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu geliştirilmiş protokol, floresan boyanın penetrasyonunu arttırmak için modifiye edilmiş bir doku hazırlama yöntemi kullanır, böylece hem küçük hem de büyük boyutlu numunelerin morfometrik analizine izin verir.

3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Bu protokolün genel amacı, standart laboratuvar ekipmanları kullanarak biyolojik örneklerin yüksek çözünürlüklü 3D dijital görüntülerini hızlı bir şekilde elde etmektir. Bu yöntem, karmaşık morfolojik özelliklerin görselleştirilmesi ve dinamikleri aracılığıyla gelişimsel biyoloji alanındaki temel sorulara yanıt verebilir. Bu tekniğin temel avantajları, standart laboratuvar ekipmanları kullanması ve minimum ön deneyim gerektirmesidir.Prosedür, laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Jungang Huang tarafından gösterilecektir. Metin protokolünde açıklandığı üzere embriyonun diseksiyonu ve fiksasyonu tamamlandıktan sonra, fiksatif çözeltiyi şeffaflaştırma çözeltisi ile değiştirin ve örneği oda sıcaklığında bir sarsıcının (rocker) üzerinde bir ila iki hafta boyunca nazikçe döndürün. İnkübasyonun sonunda, örneği %10 formaline aktarın ve iki gün daha sarsıcı üzerinde bırakın.Üçüncü günde, örneği PBS ile beşer dakikalık üç yıkama şeklinde yıkayın. Ardından, örnekleri oda sıcaklığında, her konsantrasyon için iki saat boyunca hafif bir sarsıntılı platformda, artan etanol serisi ilele dehidrate edin. %100 etanol dehidrasyonundan sonra, örneği ışıktan koruyarak bir saat boyunca boyama çözeltisine aktarın.Ardından, örneğin gece boyu etiketlenmesi için çözeltiyi taze boyama çözeltisiyle değiştirin. Ertesi sabah, örneği taze hazırlanmış infiltrasyon ve boyama çözeltilerinin bire bir hacimce karışımına daldırın ve dört santigrat derecede bir sarsıcı üzerinde en az üç saat bekletin. İnkübasyonun sonunda, embriyoyu üç saatlik başka bir sarsıntılı inkübasyon için infiltrasyon çözeltisine aktarın.Ardından, süpernatanı taze sızdırma çözeltisiyle değiştirin ve dört santigrat derecede üç gün daha sallama işlemine devam edin. Dördüncü günde, embriyoyu bir gömme kalıbı içinde yönlendirin ve kalıbı buz üzerine yerleştirin. Çözelti B'yi sızdırma çözeltisiyle karıştırın ve ardından kalıbı dört santigrat derecedeki soğuk gömme çözeltisine nazikçe daldırın.Yaklaşık üç saat sonra, çözeltinin katılaştığını onaylamak için bir uç kullanın ve numuneyi kalıptan dışarı itin. Fazla gömme malzemesini kesin, ardından numune bloğunu yeni bir kalıba çapraz yönde olacak şekilde yeniden yerleştirin. Daha sonra, tüm düzeneği bir çeker ocak içindeki buz üzerine yerleştirin.Yeni kalıp tamamen gömülene kadar gömme solüsyonunu yavaşça ekleyin. Ardından, kalıbın üzerine bir blok tutucu yerleştirin. Üç ila dört saat sonra, gömme kalıbını soyun ve bloğun içindeki örneğin konumunu belirlemek için bloğu eğik aydınlatmalı bir stereo mikroskop altına yerleştirin.Blok yüzeyinde, numunenin etrafına ızgara çizgileri işaretleyin ve bu çizgileri fazla gömme materyalini kırpmak için kılavuz olarak kullanın. Numuneyi görüntülemek için önce bloğu bir mikrotoma sabitleyin ve numuneden taze bir yüzey kesiti alın. Ardından, bir stereo zoom mikroskobu numunenin blok yüzeyine bakacak şekilde yatay olarak yerleştirin; mikroskobu ve beraberindeki bilgisayarı açın.Ardından, görüntüleme yazılımını başlatın ve optikleri blok yüzeyine odaklamak için yazılımdaki canlı izleme modunu kullanın. Blok yüzeyi vizörün merkezinde olacak şekilde mikroskobu ve mikrotomu gerektiği gibi hizalayın. Bu prosedürün en kritik adımlarından biri, görüntüleri mikrotomun sabit başlangıç konumunda elde etmektir.Tüm blok yüzeyinin vizör içerisinde olduğundan emin olmak için zum ayarını yapın. Ardından yeşil floresan protein filtresini seçin. Örnek doku görünene kadar bloğu ön kesim işlemine tabi tutun ve gerektiğinde görüntüyü yeniden odaklayın.Pozlama süresi manuel olarak ölçülüp ayarlandıktan sonra, her yeni kesimden sonra blok yüzeyinin görüntülerini edinin ve kaydedin; ayrıca önemli görüntüleme parametrelerini not edin. Görüntüleme oturumunun sonunda, tüm görüntü dosyalarını dışa aktarın ve JPEG formatına dönüştürün; ardından uygun görüntü işleme yazılımını kullanarak tüm orijinal görüntüleri ters çevirin (invert) ve gerekirse görüntülerin parlaklık ve kontrast ayarlarını düzenleyin. Tüm işlenmiş görüntüleri, talimatları takip ederek bir 3D görselleştirme yazılımına yükleyin.Tüm görüntüleri otomatik modu kullanarak hizalayın ve 3D ile 2D sonuçlarını gösterin. Bu temsilî görüntüde, az önce gösterildiği gibi hazırlanan ve görüntülenen embriyonik 15,5 günlük bir fare embriyosunun bütün montajlı yüzey görünümü yer almaktadır. Bıyık pedleri ve gelişmekte olan kıl folikülleri dahil olmak üzere derinin detaylı morfolojik özellikleri gözlemlenebilir.Önemli bir nokta olarak, bu yöntemle görüntülenen embriyonik 15,5. gün örneğinin sanal kesit görünümü çözünürlüğü, standart bir histolojik kesite benzerdir. Tüm prosedürde uzmanlaşıldığında, berraklaştırma solüsyonu ile ön işlemden sonraki tüm süreç, düzgün yürütüldüğü takdirde bir hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, sızdırma ve gömme adımları sırasında boyama solüsyonunun 4 °C'de ışıktan korunması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, hücre tiplerinin spesifik dağılım modellerine ilişkin ek soruları yanıtlamak için skala boyama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, biyolojik örneklerin morfometrik analizleri için laboratuvar ekipmanlarını kullanarak nasıl yüksek çözünürlüklü 3D görüntüler elde edeceğiniz konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Fiksasyon, boyama ve infiltrasyon solüsyonlarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocak kullanımı ve eldiven giyilmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

rapid-acquisition-3d-images-using-high-resolution-episcopic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Tahribatsız ses görselleştirme sadece x-ray mikro bilgisayarlı tomografi (BT) en verimli olduğu tomografi teknikleri ile elde edilebilir.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme Ex-Vivo Biyolojik örnekler Micro CT

Otofaji hücreler protein ve organellerin aşağılamak ve geri dönüşüm sağlayan her yerde bulunan bir süreçtir. Biz görselleştirmek ve küçük ölçmek için gelişmiş floresan mikroskop geçerli, ama autolysosomes içine oluşumu ve autophagosomes ve lizozomlar dağılımı, ve füzyon da dahil olmak üzere otofaji indüksiyon ile ilgili temel, fiziksel değişiklikler,.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Canlı hücrelerin içindeki dinamik proteinler hakkındaki uzay-zamansal bilgi, biyolojiyi anlamak için çok önemlidir. Hızlı 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (f3D-SIM) adı verilen bir tür süper çözünürlüklü mikroskopi, bakterilerdeki sitokinetik Z halkası hakkında benzersiz bilgiler ortaya çıkarır: hem boncuk benzeri görünümü hem de halka içindeki FtsZ'nin hızlı dinamikleri.

Hızlı 3D-Yapılandırılmış Aydınlatma mikroskopi ile Canlı Bakteri Cytokinetic Z Yüzük Süper çözünürlük Görüntüleme (F3D-SIM)

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi yöntemi ile sayısal hacim veri üretmesine izin vermek için, çeşitli türlerin biyopsi materyali, biyomedikal model organizmaların embriyoları ve diğer organik dokuların numunelerinin işlenmesi için basit ve sağlam protokoller sunuyoruz.

Yüksek Çözünürlüklü Episkopik Mikroskopi (HREM) - Organik Malzemelerin İşlenmesi ve Görselleştirilmesi için Basit ve Sağlam Protokoller

Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

Bu protokol, canlı üç boyutlu görüntüleme için bakteri örneklerinin nasıl hazırlanacağını ve monte edilebildiğini ve bu görüntülerden E. coli'nin üç boyutlu şeklinin nasıl yeniden yapılandırılabildiğini açıklar.

Doğru Hücresel Temsiller ve Hassas Protein Lokalizasyonu için Bakteri Hücrelerinin Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.

Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları

Bir kafa plakası ve hem tek hem de iki fotonlu mikroskoplarla uyumlu bir optik tasarımla entegre edildiğinde, mikroprizma mercek, kafa sabit durumlarda iyi kontrol edilen deneyler veya serbestçe hareket eden hayvanlarda doğal davranışsal görevler dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında dikey bir sütundaki nöral tepkileri ölçmede önemli bir avantaj sunar.

Serbest Hareket Eden ve Kafası Sabit Hayvanlarda Mikroprizmalar Kullanılarak Tanımlanmış Nöral Popülasyonların Uzun Süreli Görüntülenmesi

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü hücresel ve alt hücresel görüntüleme için çoklu dizi dedektörüyle entegre edilmiş lazer taramalı konfokal mikroskop sisteminin gelişmiş görüntüleme uygulamalarını ve paylaşılan kaynak yönetimini detaylandırır. Bu iş akışı, tek bir platform içinde konfokalden süper çözünürlükle (~120 nm) çok modal görüntülemeyi mümkün kılarak nano ölçekli görselleştirmeyi daha erişilebilir kılar.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme ve Paylaşılan Yönetim: Multiplex Algılama ile Konfokal Mikroskopi İçin Bir Protokol

Öğrenin fare embriyolarında yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi ile 3D görüntüleme yöntemini. Bu teknik, gelişim biyolojisinde morfometrik analiz için standart laboratuvar ekipmanları kullanarak hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

Daha fazla video keşfet