Hazırlama ve İn Vivo Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için K -acylethanolamine Asit aminidaz

Bu prosedürün genel amacı, N-asiletanolamin asit amid veya NAAA için spesifik aktivite tabanlı prob, ARN 14 altı sekiz altı sentezini göstermek ve hücre ekstraktlarında ve doku kesitlerinde katalitik olarak aktif enzimi tespit etmek için kullanımını tanımlamaktır. Bu yöntem, NAAA'nın in viva işlevi hakkındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir ve inflamatuar ve nöro dejeneratif hastalıklar gibi farklı fizyolojik ve patolojik durumlarda NAAA aktivasyonu hakkında bilgi sağlar. Başlıca avantajı, bir prob ile NAAA reaksiyonunu takiben basit bir manipülasyonun yapılması ve böylece enzimin in viva aktivasyon durumu hakkında güvenilir bilgi vermesidir.

Diğer bir avantaj, spesifik antikorların aksine, probumuzun sadece floresan mikroskobu durumu için yararlı olan enzimin aktif formunu tespit etmesidir. Bu yöntemin görsel gösterimi, uygun sentezden nihai uygulamalarına kadar eksiksiz bir hikayeye dayanan farklı uzmanlıkları bir araya getirdiği için kritik öneme sahiptir. 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişede, 350 miligram undecynenol ve üç nokta beş mililitre kuru diklorometan çözülür.

Ardından bu çözeltiye 25 miligram DMAP ve 530 miligram DPC ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 16 saat karıştırın. 16 saat sonra, çözeltiye 20 mililitre diklorometan ekleyin.

Karışımı bir ayırma hunisine aktarın. 15 mililitre su ekleyin. Karışımı çalkalayın ve iki fazın ayrılmasına izin verin.

Ardından, vanayı açın, alttaki organik fazı toplayın, vanayı kapatın ve organik fazı huniye geri aktarın. Karışıma 15 mililitre doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin. Ayırma hunisini sallayın ve iki fazın ayrılmasına izin verin.

Organik tabakayı sodyum sülfatla kuruttuktan sonra, pamuktan katmanlı yuvarlak tabanlı bir şişeye süzün. Daha sonra organik tabakayı, döner bir buharlaştırıcı kullanarak düşük basınç altında kuruyana kadar buharlaştırın. Şişeyi tartın ve iki piridil, undesinil karbonat ve undesinol, iki oksipiridin karboksilatın bir karışımı olan 600 miligram yağ elde edin.

10 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir şişede, 60 miligram oksoasetydenol amonyum asetatı iki mililitre kuru diklorometan içinde çözün. Çözeltiyi bir buz banyosunda sıfır santigrat dereceye kadar soğutun, ardından damla damla 81 mikrolitre diazapropaletilamin ekleyin. Daha sonra, undesinol, iki oksipiridin karboksilat içeren ham karışımın 350 miligramını iki mililitre kuru diklorometan içinde çözün.

Çözünmüş karışımı çözeltiye ekleyin ve oda sıcaklığında 15 saat karıştırın. Daha sonra çözücüyü döner bir buharlaştırıcı kullanarak düşük basınç altında kuruyana kadar buharlaştırın. Bileşiği, otomatik bir kolon kromatografi aparatı kullanarak silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın.

Önce numuneyi silika jel üzerine emdirin. Kolonu sikloheksen ile dengeledikten sonra, numuneyi kartuşa yükleyin. Numuneyi sikloheksan içinde etil asetat ile sıfırdan 100'e kadar elute edin ve tepe noktalarını test tüplerine toplayın.

Bileşiğe karşılık gelen fraksiyonların çözücüsünü, 40 miligram beyaz bir katı elde etmek için döner bir buharlaştırıcı kullanarak düşük basınç altında kuruyana kadar buharlaştırın. Numuneyi metin protokolünde tarif edildiği gibi ön temizledikten sonra, beş milimolar azid, polietilen, gliko, biyotin ve girdap stoğundan 11 nokta üç mikrolitre ekleyin. Daha sonra numuneye ve girdaba 50 milimolar taze hazırlanmış TCEP stoğundan 11 nokta üç mikrolitre ekleyin.

Bir nokta yedi milimolar TBTA'dan oluşan taze hazırlanmış bir çalışma solüsyonunun 34 mikrolitresini 11 punto, üç mikrolitre 50 milimolar bakır sülfat stoğu ile önceden karıştırdıktan sonra, bu solüsyondan 45 nokta üç mililitre numuneye ve girdaba ekleyin. Etiketli kaplar kullanın. Reaksiyonu en az iki saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin.

Bir saatlik inkübasyondan sonra, protein çökelmesini gözlemleyin ve reaksiyonu karıştırın. Numuneyi dört santigrat derecede 6, 500 kez G'de dört dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 750 mikrolitre soğuk metanol ekleyin ve peleti beş saniye boyunca bir prob sonikatörü kullanarak sonikasyon ile yeniden süspanse edin.

Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede 6.500 kez G'de dört dakika santrifüjleyin. Ve süpernatanı bir şırınga ve iğne ile çıkarın. Soğuk metanol ile iki kez daha yıkadıktan sonra, protein peletine PBS'de 325 mikrolitre iki nokta beş yüzde SDS ekleyin.

Örneği beş saniye boyunca üç kez sonikleştirin. Daha sonra numuneyi 65 santigrat derecede beş dakika ısıtın. Sonikasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 6, 500 kez G'de beş dakika santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı temiz bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve SDS konsantrasyonunu yüzde sıfır nokta beşe seyreltmek için süpernata bir nokta dört mililitre PBS ekleyin. Streptavidin zenginleştirmesi için, önce numunenin hacmini PBS ile dört nokta iki mililitreye getirin. Daha sonra, kesilmiş bir uç ucu kullanarak% 50'lik bir bulamaç olan önceden yıkanmış streptavidin agarozundan 40 mikrolitre ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında iki saat boyunca döndürerek inkübe edin. 1.400 kez G'de iki dakika santrifüjledikten sonra, boncuk peletini kurutmadan süpernatanı çıkarın. Boncukları bir mililitrelik spin kolonuna aktarmak için artık süpernatanı kullanın ve kolonu PBS'de bir mililitre yüzde bir SDS ile yerçekimi ile yıkayın.

Boncukları altı molar üre ile yıkamaya devam edin, ardından metin protokolünde açıklandığı gibi PBS uygulayın. Daha sonra, yıkanmış boncukları bir nokta beş mililitrelik bir tüpe aktarmak için 500 mikrolitre PBS kullanın. Numuneyi 1.400 kez G'de iki dakika santrifüjledikten sonra, süpernatanı bir şırınga ve iğne ile nazikçe aspire edin.

Reçineye bağlı proteinleri elüte etmek için, reçine peletine 25 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika, ardından 95 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Metin protokolüne göre hazırlanmış doku dilimlerine yaklaşık 400 mikrolitre tıklama kimyası karışımı ilave edilir. Seçilen tıklama kimyası karışımının hacminin dilimleri kaplamak için yeterli olduğuna dikkat edin.

Daha sonra doku dilimlerini ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri PBS ile beş dakika ve ardından soğuk metanol ile beş dakika yıkayın. Daha sonra, doku dilimlerini PBS'de iki dakika boyunca yüzde bir, Tween 20 ve sıfır nokta beş milimolar EDTA'lık bir çözelti ile üç kez yıkayın.

Son olarak, dilimleri PBS ile bir kez daha beş dakika yıkayın. Havayla kuruduktan sonra DAPI ile bir damla antifade mountant ekleyin. Numuneleri kapak fişleri ile kapatın ve cila ile kapatın.

Prob sentezi için, undecynenol, daha sonra aminil laktam ile reaksiyona giren karışık bir karbonat üretmek için katalitik dört dimetil aminil piridin varlığında dipiridil karbonat ile aktive edilir, beta laktam veya probun başı NAAA aktif bölgesi ile reaksiyona girerken, terminal alkin, tıklama kimyası yoluyla bir raportör etiketi ile işlevselleştirilebilir. ARN 14 altı, altı, altı, protein bloğu ile sıçan iltihaplı pençelerinin hücre ekstraktlarında NAAA aktivasyonunu tespit etmek için kullanıldı. Saf sıçanlarda, NAAA sinyali tespit edilmez.

Tersine, tam Freunds Adjuvanı ile tedavi edilen sıçanlarda, aktif NAAA'ya karşılık gelen işaretli bir bant gözlenir. ARN 14 altı sekiz altı'nın bir başka uygulaması da floresan mikroskobu ile doku görüntülemedir. Burada kırmızı hücreler, aktif NAAA için pozitif olan alveolar makrofajları temsil eder.

NAAA, daha yüksek bir büyütmede kayda değer olarak dağınık veziküler yapılarda lokalizedir. Bu videoyu izledikten sonra, hem protein lekesi hem de floresan mikroskobu ile dokularda aktif NAAA'yı tespit etmek için ARN 14 altı, altı, altı, nasıl sentezleneceğini ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Ek olarak, bu protokol hedefimize özel olsa da, tanımladığımız prob uygulamaları, NAAA dışındaki hedeflere özgü farklı aktivite tabanlı problar için kolayca ayarlanacaktır.