Name: Hazırlama ve İn Vivo Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için K -acylethanolamine Asit aminidaz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Öğrenin ARN14686 aktivite bazlı probunun sentezini ve NAAA enziminin aktif formunu hücre ekstraktlarında ve doku kesitlerinde tespit etme yöntemini. Bu teknik, inflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklarda enzim aktivasyonunu incelemek için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, İtalya'daki Nikon Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür eder (NIC@IIT).

<ol><li>Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+mass+spectrometry+and+sequence+database+searching%3A+tools+for+cancer+research+in+the+post-genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era.</a> Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).</li>
<li>Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+yeast+proteome+by+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology.</a> Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).</li>
<li>Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteomics.</a> Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+the+two-hybrid+system+in+exploration+of+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).</li>
<li>Evans, M. J., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+profiling+of+enzyme+families%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based profiling of enzyme families.</a> Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).</li>
<li>Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling%3A+from+enzyme+chemistry+to+proteomic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry.</a> Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Meldal, M., Tornoe, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition.</a> Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).</li>
<li>Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+in+vivo+using+a+copper%28i%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kohn, M., Breinbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Staudinger+ligation-a+gift+to+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Staudinger ligation-a gift to chemical biology.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).</li>
<li>Romeo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Probe+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase.</a> ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).</li>
<li>Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+an+acid+amidase+selective+for+N-palmitoylethanolamine%2C+a+putative+endogenous+anti-inflammatory+substance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance.</a> J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).</li>
<li>Tsuboi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+novel+member+of+the+choloylglycine+hydrolase+family+with+structural+and+functional+similarity+to+acid+ceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase.</a> J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).</li>
<li>Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+%28NAAA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodivers%22%5BJournal%5D)">The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA).</a> Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).</li>
<li>Ribeiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+Systemically+Active+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+Inhibitor+that+Suppresses+Inflammation+and+Human+Macrophage+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation.</a> ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).</li>
<li>Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+and+glycosylation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+lysosomal+enzyme+involved+in+the+endocannabinoid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism.</a> Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+crucial+in+pH+regulation+and+proteolytic+activation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).</li>
<li>West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+human+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).</li>
<li>Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+discovery+of+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors.</a> Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).</li>
<li>Sasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+effects+of+the+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitor+ARN077+in+rodent+pain+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models.</a> Pain. 154, 350-360 (2013).</li>
<li>Duranti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-%282-oxo-3-oxetanyl%29carbamic+acid+esters+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%3A+synthesis+and+structure-activity+and+structure-property+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships.</a> J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).</li>
<li>Ponzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+of+2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic+acid+esters%2C+a+class+of+potent+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).</li>
<li>Solorzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationships+of+N-%282-oxo-3-oxetanyl%29amides+as+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors.</a> J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).</li>
<li>Vitale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure-activity%2C+and+structure-stability+relationships+of+2-substituted-N-%284-oxo-3-oxetanyl%29+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Fiasella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Aminoazetidin-2-one+derivatives+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors+suitable+for+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration.</a> ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).</li>
<li>Armirotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Lactones+Inhibit+N-acylethanolamine+Acid+Amidase+by+S-Acylation+of+the+Catalytic+N-Terminal+Cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine.</a> ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).</li>
<li>Nuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+alpha-amino-beta-lactam+carbamic+acid+ester+as+NAAA+inhibitors.+Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies.</a> Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).</li>
<li>Bonezzi, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Important+Role+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+in+the+Complete+Freund%27s+Adjuvant+Rat+Model+of+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis.</a> J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Speers, A. E., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Protein+Profiling+%28ABPP%29+and+Click+Chemistry+%28CC%29-ABPP+by+MudPIT+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).</li>
<li>Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+biotinylated+proteins+on+streptavidin+resin%3A+a+protocol+for+quantitative+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution.</a> Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (264), (2007).</li>
<li>Giuffrida, A., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution+GC%2FMS+determination+of+anandamide+and+other+fatty+acylethanolamides+in+rat+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma.</a> FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).</li>
<li>Buczynski, M. W., Parsons, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+brain+endocannabinoid+levels%3A+methods%2C+interpretations+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls.</a> Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Enzim aktivitesi ince RNA transkripsiyonu, protein sentezi, protein translokasyon, post-translasyonel modifikasyon ve protein-protein etkileşimi dahil olmak üzere farklı seviyelerde düzenlenir. Genellikle, enzim ifadesi tek başına faaliyeti hesaba katmaz. ABPP kendi doğal yapısında proteinlerin aktivitesi çalışma için geliştirilmiştir. İki özellik gereklidir: kovalent olarak ilgi bir enzim ve bir raportör etiketi aktif sitesine bağlanan kimyasal bir sonda prob etiketli enzim tespit etmek. Pr...

Yaygın tüfek analizi 1,2, maya için sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi platformları içeren ekspresyonu, etkileşimler ve işlevleri proteinlerin araştırmak için yöntem kullanılan iki hibrid yöntemler 3,4 ve in vitro deneyler, bu olmasıyla sınırlıdır kendi doğal yapısında proteinlerinin aktivitesini değerlendirmek mümkün. Etkinlik bazlı protein profilleme (ABPP) bu boşluğu doldurmak için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, küçük moleküllü kovalent hedef saptama için izin veren bir raportör gruba konjuge edilmiş bir ilgi enzimin aktif bölgesine bağlanabilen probes. Tıklama kimyası (CC) kullanarak, muhabir prob entegre edilebilir veya hedef nişan 5,6 oluştuktan sonra sokulabilir. İkinci prosedür, suc biyo-dik reaksiyonlar vasıtasıyla haberci reaktif bir dizi modifiye edilebilir bir terminal alkin veya azid gibi uygun kimyasal gruplar ihtiva eden sondalannın kullanılmasını gerektirirCu (I) H [3 + 2] siklo-7-9 ya da Staudinger ligasyon 10,11 Hüsgen, paladyum. Son zamanlarda, in vitro ilk ABP gibi sistein hidrolaz, NAAA 12 in vivo tespiti bileşik ARN14686 tarif. NAAA antienflamatuar nükleer reseptör PPAR-alfa 13-15 endojen agonistleri olan oleoylethanolamide (OEA) ve palmitoiletanolamidi (PEA) de dahil olmak üzere doymuş ve tekli doymamış FAES, hidrolitik devreden katalize eder. NAAA ağırlıklı doğal bağışıklık tepkisinin düzenlenmesinde önemli bir rol öne hem de B-lenfositleri 14,16 olarak, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücre olarak ifade edilir. Enzim, bir aktif olmayan formda endoplazmik retikulum içinde sentezlenir ve otoproteolitik mekanizması 17 hücrenin asidik bölümlerinde aktive edilir. Otoproteolitik klevaj (C13 Yeni N-terminal sisteini üretirFare ve sıçanlarda 1, insanlarda 126P), bu FAE için nükleofil sorumlu 18,19 hidrolizidir. NAAA aktivitesinin farmakolojik inhibisyonu FAEler 16,20,21 artmış hücresel seviyedeki lehine FAE sentezini / yıkımını dengesini değiştirir. Çeşitli β-lakton ve β-laktam türevleri, yüksek bir potansiyel ve seçicilik 16,22-26 ile NAAA aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu inhibitörler, katalitik sistein 16,27,28 S -acylation olarak hareket eder. (- [(S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat 4-cyclohexylbutyl- K) 16 bileşiği, ARN14686 sistemik aktif serin türevi β-laktam NAAA inhibitörünün kimyasal yapısı, ARN726 göre tasarlanmıştır. ARN726 4-bütil-sikloheksil grubu, bir azid taşıyan raportör etiketi ile müteakip CC konjügasyonu için bir terminal alkin etiket taşıyan bir C9 doymuş alifatik zinciri ile ikame edilmiştir. Biz minimall için iki adımlı bir ABP tasarımı seçtiy böylece NAAA için prob afinite koruyarak, orijinal iskele yapısını değiştirebilir. Ayrıca, hacimli etiketlerin giriş kaçınarak, bir sonda, bir doğrudan ABP daha canlılarda tedavi için daha uygun olabilir. ARN14686 yüksek etki ile NAAA inhibe enzim 12 katalitik sistein ile kovalent bir katılma ürünü oluşturmak suretiyle (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM). canlı farelerde deneyler prob NAAA akciğerlerde ifade yakalama seçici olduğunu göstermiştir. Yüksek prob konsantrasyonunu (in vitro 10 uM, 10 mg / damar içi, iv mi) 12 kullanılarak, asit seramıdaz, NAAA ile 33-34% özdeşlik paylaşan başka sistein amidaz, aynı zamanda, düşük afiniteli bir hedef olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, tam Freund adjuvanı (CFA) 29 uygulanmasından sonra iltihaplı sıçan dokularında aktif NAAA varlığını incelemek için ARN14686 kullandık. Burada, Preparati için bir protokol anahatARN14686 (Şekil 1) ve NAAA aktivasyonu ex vivo soruşturma onun uygulaması üzerinde. Bir örnek olarak, CFA tatbikatından sonra sıçan pençelerde NAAA görselleştirmek için deneysel bir prosedürü açıklar. Bu deneyde, protein sondanın IV enjeksiyonundan sonra pençe dokusundan ekstre edilir ve ABP-etiketli proteom biyotin-azid ile CC tabi tutulur. Biyotinile örnekleri streptavidin boncuk kullanılarak zenginleştirilmiş ve protein lekeler yapılmaktadır. Başka bir uygulamada, prob ile tedavi edilen farelerden alınan fare akciğerlerinde floresan mikroskobu aktif NAAA lokalizasyonunu tarif etmektedir. Bu durumda, dokunun kesit bölümleri ve rodamin ilave edilmesi için CC tabi tutulur. Bir iş akışı şeması Şekil 2&#39;de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sülfonildiimidazol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Zararlı</td></tr><tr><td>2-dipiridikarbonat</td><td>Florohem</td><td>11331</td><td>Zararlı</td></tr><tr><td>2-Metilbutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Yanıcı, toksik, su ortamı için tehlikeli</td></tr><tr><td>4- (Dimetilamino) piridin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Yanıcı, Aşındırıcı</td></tr><tr><td>Asetonitril&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Yanıcı, Toksik</td></tr><tr><td>Aktif kömür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Zararlı</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein test kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biyo-döndürme sütunları</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Engelleme tamponu</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Yüksek derecede toksik</td></tr><tr><td>Bovin serum albümini (BSA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td>Serik amonyum nitrat ve nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Oksitleyici, Zararlı</td></tr><tr><td>Kloral hidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>Yüksek toksik</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Sikloheksadien</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Yanıcı, Sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td>Sikloheksan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Yanıcı, Zararlı, Sağlık tehlikesi, Çevresel tehlike</td></tr><tr><td>Diklorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Zararlı, Sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td>Dietil eter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Yanıcı, Zararlı</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Yanıcı, Zararlı</td></tr><tr><td>Etil asetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Yanıcı, Zararlı</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptavidin&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Protein komplekslerini çökeltmek için kullanmadan önce kısaca santrifüjleyin</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Yüksek derecede toksik</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Yanıcı, Toksik, Sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td> N / em <> - (3-Dimetilaminopropil) - < > N ve asal; -etilkarbodiimid hidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>Zararlı, Aşındırıcı</td></tr><tr><td>N, N-diizopropilaminlamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>Yanıcı, Aşındırıcı, Toksik</td></tr><tr><td><>emN, N-dimetilformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Yanıcı, Zararlı, Sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serin</td><td>Florohem</td><td>M03053</td><td>Zararlı</td></tr><tr><td>Nikon A1 konfokal mikroskopi</td><td>Nikon</td><td></td><td>Kullanım kılavuzunu okuyun</td></tr><tr><td>NuPAGE %4-12 Bis-Tris jel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Karbon üzerinde paladyum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Toksik, Sağlık tehlikesi, Çevresel tehlike</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Toksik, solunuma zararlı, aşındırıcı, yanılabilir</td></tr><tr><td>Poli (etilen glikol)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong DAPI ile Altın antifade mountant&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Kabarcık oluşumunu önleyin</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Toksik, aşındırıcı, sahte</td></tr><tr><td>Sodyum hidrit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td>Yanıcı</td></tr><tr><td>Sodyum sülfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 tarayıcı</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Kullanım kılavuzunu okuyun ve nbsp</td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-bütanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Toksik, yanıcı</td></tr><tr><td>Tetrahidrofuran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Yanıcı, Zararlı, Sağlık tehlikesi</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Toksik, 50 ° C'de sıcak; Tris'i çözmek için</td></tr><tr><td></td><td>C Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>Ara-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 temel doku homojenizatörü</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>Zararlı</td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Toksik, 50 ° C'de sıcak; Çözünmek için C</td></tr></tbody></table>

hazırlama ve<em&gt; İn vivo</em&gt; bir faaliyet tabanlı sondası kullanılması için<em&gt; k</em&gt; -acylethanolamine asit aminidaz

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Aktivite bazlı protein profili (ABPP) enzimin aktif sitesi hedef kimyasal sistemlerinin kullanımı ile kompleks proteomun daki bir enzimin tanımlanması için bir yöntemdir. sonda içine bir raportör etiketi-jel floresans tarama protein blot, floresan mikroskobu ya da sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile etiketlenmiş enzim algılanmasına olanak verir. Burada, hazırlanması ve bileşik ARN14686 kullanımını seçici enzim N -acylethanolamine asit amidaz (NAAA) tanıdığı bir tıklama kimya faaliyet tabanlı prob (CC-ABP) açıklar. NAAA örneğin palmitoiletanolamidi (PEA) ve oleoylethanolamide (OEA) gibi endojen peroksizom proliferatör ile aktive olan reseptör (PPAR) -alfa agonistleri devre dışı bırakarak iltihabı teşvik eden bir sistein hidrolazdır. NAAA lizozom asidik pH autoproteolysis ile aktive edilen bir aktif olmayan, tam uzunlukta bir proenzim olarak sentezlenir. Lokalizasyon çalışmaları hNAAA ağırlıklı B-lenfositlerinde ve, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücrelerde eksprese olduğu gösterilmiştir ave. Biz ARN14686 tespit ve protein blot ve floresan mikroskobu ile kemirgen dokularında aktif NAAA ex vivo olarak ölçmek için kullanılabilir şeklinin örneklerini sağlar.

ARN14686 NAAA önleyicisi ARN726 skafold göre tasarlanmıştır. ARN726 4-bütil-sikloheksil grubu, bir C9 doymuş alifatik zincirdir, bir terminal alkin etiketi (Şekil 1) taşıyan ile ikame edilmiştir. alkin etiketi bir flüorofor ya da CC yoluyla biyotin molekülü eklemek için iki aşamalı bir etiketleme prosedürü kullanımını sağlamak amacıyla tanıtıldı. Bu özellik, in vitro ve in vivo olarak NAAA prob için çok yönlü bir araç ARN14686 vermektedir. <p class=...

Burada, bir etkinlik bazlı prob hazırlanmasını ve kullanımını tarif (ARN14686, undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat) saptanması ve ölçülmesi için izin verir proinflamatuar enzimi N -acylethanolamine asit amidaz aktif formu (NAAA), hem in vitro ve ex vivo.

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Bu prosedürün genel amacı, N-açiletanolamin asit amidaz (NAAA) için spesifik olan aktivite tabanlı prob ARN 14 six eight six'nın sentezini göstermek ve bu probun hücre ekstraktları ile doku kesitlerindeki katalitik olarak aktif enzimi saptamak için kullanımını açıklamaktır. Bu yöntem, inflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklar gibi farklı fizyolojik ve patolojik durumlarda NAAA aktivasyonuna dair içgörüler sağlayarak NAAA'nın in vivo fonksiyonu hakkındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yöntemin temel avantajı, NAAA'nın bir prob ile reaksiyonunu takiben basit bir manipülasyonun uygulanabilmesi ve böylece enzimin in vivo aktivasyon durumu hakkında güvenilir bilgi sunmasıdır.Bir diğer avantajı ise, spesifik antikorların aksine probumuzun enzimin yalnızca aktif formunu tespit etmesidir ki bu durum floresan mikroskopi durumları için kullanışlıdır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü uygun sentezden nihai uygulamalarına kadar eksiksiz bir hikaye oluşturan farklı uzmanlık alanlarını bir araya getirir. 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir balonda 350 miligram undecynenol ve üç virgül beş mililitre kuru diklormetan çözün.Ardından bu çözeltiye 25 milligrams DM

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Trichothecenes (insan sağlığı için endişe mikotoksinler) rekabetçi bir immünokimyasal yöntemi ve bir final elektrokimyasal algılama dayalı yeni geliştirilen bir tarama yöntemi kullanılarak tespit etmek için bir protokol olduğunu göstermiştir.

Mikotoksin Algılama ELIME (Enzim İmmüno Manyetik Elektrokimyasal Bağlantılı) Yöntem

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Asetat kinaz aktivitesinin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu testte, asetat oluşturan yönde asetat kinaz enzim aktivitesi ve kinetiği farklı fosforilasyonunu alıcıları belirlemek için doğrudan bir tepki kullanır. Ayrıca, bu yöntem diğer asetil fosfat ya da asetil-CoA kullanan enzimler assaying için kullanılabilir.

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Bu video, sentetik 4-Metilumbelliferil substratlar kullanılarak numunelerde α-galaktosidaz A ve asit α-glukozidaz için enzim aktivitesinin in vitro ölçümünü göstermektedir.

α-Galaktosidaz A ve Asit α-Glukozidaz Enzim Aktivitesinin İn Vitro Ölçümü

Proteinlere palmitat arasında reversibl Ayrıca hücre içi protein ticaretinin önemli bir düzenleyicisidir. Bu birçok sinaptik proteinlerin palmitoylated edilir nöronların özel bir ilgi alanıdır. Biz birden fazla hücre tipleri ve dokuları için adapte edilebilir kültürü nöronlar içinde palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit bir biyokimyasal yöntem kullanmaktadır.

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Mevcut rapor, Leishmania hücre ekstraktları kullanılarak fosfatidiletanolamin metiltransferaz aktivitesini ölçmek için in vitro enzimatik bir testi açıklamaktadır. Bu tahlil, bir radyoaktif metil grubunun S- [Metil-3H] adenosil-L-metiyoninden endojen fosfatidiletanolamin üzerine transferine dayanmaktadır.

Vitro Tahlil Fosfatidiletanolamin Metiltransferaz Aktivite Tedbir

Bu çalışma, teorik olarak 200'den fazla enzime uygulanabilen evrensel bir genetik enzim tarama sistemi kullanarak yüksek verimli bir tarama yöntemi sunmaktadır. Burada, tek tarama sistemi, kullanılan substratı (p-nitrofenil asetat, p-nitrofenil-β-D-selobiosit ve fenil fosfat) değiştirerek üç farklı enzimi (lipaz, selülaz ve alkalin fosfat) tanımlar.

Çok enzim Yüksek verim Genetik Enzim Eleme Sisteminin Kullanılması Eleme

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Murine hipokampustaki dendritik dikenleri görüntülemek ve analiz etmek için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM) uygulanır.

Dendritik Dikenlerin Çalışması için Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBEM)

Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi

Öğrenin ARN14686 aktivite bazlı probunun sentezini ve NAAA enziminin aktif formunu hücre ekstraktlarında ve doku kesitlerinde tespit etme yöntemini. Bu teknik, inflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklarda enzim aktivasyonunu incelemek için güvenilir bir araç sunar.

Hazırlama ve

Daha fazla video keşfet