Hazırlama ve

Bu prosedürün genel amacı, N-açiletanolamin asit amidaz (NAAA) için spesifik olan aktivite tabanlı prob ARN 14 six eight six'nın sentezini göstermek ve bu probun hücre ekstraktları ile doku kesitlerindeki katalitik olarak aktif enzimi saptamak için kullanımını açıklamaktır. Bu yöntem, inflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklar gibi farklı fizyolojik ve patolojik durumlarda NAAA aktivasyonuna dair içgörüler sağlayarak NAAA'nın in vivo fonksiyonu hakkındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Yöntemin temel avantajı, NAAA'nın bir prob ile reaksiyonunu takiben basit bir manipülasyonun uygulanabilmesi ve böylece enzimin in vivo aktivasyon durumu hakkında güvenilir bilgi sunmasıdır.

Bir diğer avantajı ise, spesifik antikorların aksine probumuzun enzimin yalnızca aktif formunu tespit etmesidir ki bu durum floresan mikroskopi durumları için kullanışlıdır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü uygun sentezden nihai uygulamalarına kadar eksiksiz bir hikaye oluşturan farklı uzmanlık alanlarını bir araya getirir. 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir balonda 350 miligram undecynenol ve üç virgül beş mililitre kuru diklormetan çözün.

Ardından bu çözeltiye 25 milligrams DMAP ve 530 milligrams DPC ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 16 saat boyunca karıştırın. 16 saat sonra çözeltiye 20 milliliters diklorometan ekleyin.

Karışımı bir ayırma hunisine aktarın. 15 mililitre su ekleyin. Karışımı çalkalayın ve iki fazın ayrılmasını bekleyin.

Ardından musluğu açın, alttaki organik fazı toplayın, musluğu kapatın ve organik fazı tekrar huniye aktarın. Karışıma 15 mililitre doygun sodyum bikarbonat çözeltisi ekleyin. Ayırma hunisini çalkalayın ve iki fazın ayrılmasını bekleyin.

Organik tabakayı sodyum sülfat ile kuruttuktan sonra, pamuk kullanarak kademeli bir yuvarlak tabanlı balona filtreleyin. Ardından, bir döner evaporatör kullanarak indirgenmiş basınç altında organik tabakayı kuruluk gerçekleşene kadar evapore edin. Balonu tartın; 1,7'ye 1 oranında iki pyridyl undecynyl carbonate ve undecynol two oxypyridine carboxylate karışımından oluşan 600 miligram yağ elde edin.

10 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir balon içinde, 60 miligram oxo asetydenol amonyum asetatı iki mililitre kuru diklormetan içinde çözün. Çözeltiyi buz banyosunda sıfır derece santigrat dereceye soğutun ve ardından 81 mikrolitre diazapropalethylamine damla damla ekleyin. Sonra, undecynol iki oksipiridin karboksilat içeren 350 miligram ham karışımı iki mililitre kuru diklormetan içinde çözün.

Çözünmüş karışımı solüsyona ekleyin ve oda sıcaklığında 15 saat boyunca karıştırın. Ardından, döner evaporatör kullanarak indirgenmiş basınç altında solventi kuruluk until buharlaştırın. Bileşiği, otomatik bir kolon kromatografisi cihazı kullanarak silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın.

Öncelikle numuneyi silika jele absorbe edin. Kolon siklohekzen ile dengelendikten sonra numuneyi kartuşa yükleyin. Numuneyi, %0'dan %100'e kadar siklohekzan içindeki etil asetat ile elüye edin ve pikleri deney tüplerine toplayın.

Bileşiğe karşılık gelen fraksiyonların çözücüsünü, 40 miligram beyaz katı elde etmek için bir döner evaporatör kullanarak indirgenmiş basınç altında kuruluk derecesine kadar buharlaştırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi örneği ön temizlemeden geçirdikten sonra, 5 milimolar stok azid polietilen gliko biotin'den 11,3 mikrolitre ekleyin ve vorteksleyin. Ardından, örneğe taze hazırlanmış 50 milimolar stok TCEP'den 11,3 mikrolitre ekleyin ve vorteksleyin.

Taze hazırlanmış 1,7 mM TBTA çalışma çözeltisinin 34 µL'si ile 50 mM bakır sülfat stok çözeltisinin 11,3 µL'si önceden karıştırıldıktan sonra, bu çözeltiden 45,3 mL numuneye ekleyin ve vortekslenmeye tabi tutun. Etiketli kaplar kullanın. Reaksiyonu 25 °C'de en az iki saat inkübe edin.

Bir saatlik inkübasyonun ardından protein çökelmesini gözlemleyin ve reaksiyonu karıştırın. Örneği 4 °C'de 6.500 ×g'de dört dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra 750 µL soğuk metanol ekleyin ve peleti bir prob sonikatör kullanarak beş saniye boyunca sonikasyonla yeniden süspande edin.

Ardından numuneyi 4 °C'de, 6.500 ×g'de dört dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı bir şırınga ve iğne yardımıyla uzaklaştırın. Soğuk metanol ile iki kez daha yıkadıktan sonra, protein peletine PBS içinde %2,5 SDS'den 325 µL ekleyin.

Numuneye üç kez beşer saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Ardından numuneyi 65 °C'de beş dakika ısıtın. Sonikasyon işleminden sonra numuneyi oda sıcaklığında 6.500 ×g'de beş dakika santrifüjleyin.

Ardından süpernatantı temiz bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve SDS konsantrasyonunu %0,5'e seyreltmek için süpernatanta 1,4 mililitre PBS ekleyin. Streptavidin zenginleştirmesi için önce örneğin hacmini PBS ile 4,2 mililitreye tamamlayın. Daha sonra, ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak önceden yıkanmış streptavidin agarozun %50'lik süspansiyonundan 40 mikrolitre ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında, rotasyon eşliğinde iki saat boyunca inkübe edin. 1,400 ×g'de iki dakika santrifüjlemeden sonra, boncuk peletini kurutmadan süpernatanı uzaklaştırın. Boncukları bir mililitrelik spin kolona aktarmak için kalan süpernatanı kullanın ve kolonu, PBS içerisinde yüzde bir SDS içeren bir mililitre çözelti ile yer çekimi yardımıyla yıkayın.

Boncukları, metin protokolünde açıklandığı gibi altı molar üre ve ardından PBS ile yıkamaya devam edin. Daha sonra, yıkanmış boncukları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 500 µL PBS kullanın. Örnek 1.400 ×g'de iki dakika boyunca santrifüj edildikten sonra, süpernatanı bir şırınga ve iğne yardımıyla nazikçe aspire edin.

Reçineye bağlı proteinleri elüe etmek için reçine peletine 25 µL elüsyon tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika, ardından 95 °C'de 15 dakika inkübe edin. Metin protokolüne göre hazırlanmış doku kesitlerine yaklaşık 400 µL click kimyası karışımı ekleyin. Seçilen click kimyası karışımı hacminin kesitleri kaplamaya yetecek miktarda olduğuna dikkat edin.

Ardından, doku kesitlerini oda sıcaklığında, ışıktan koruyarak bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonu takiben, örnekleri beş dakika boyunca PBS ile, ardından beş dakika boyunca soğuk metanol ile yıkayın. Sonrasında, doku kesitlerini PBS içerisinde yüzde bir Tween 20 ve sıfır virgül beş milimolar EDTA içeren bir çözelti ile ikişer dakika olmak üzere üç kez yıkayın.

Son olarak, dilimleri beş dakika boyunca PBS ile bir kez daha yıkayın. Havada kuruduktan sonra, DAPI içeren bir damla antifade mountant ekleyin. Örnekleri lamellerle kapatın ve oje ile mühürleyin.

Prob sentezi için undecynenol, katalitik dört dimetil aminil piridin varlığında dipiridil karbonat ile aktive edilerek karışık bir karbonat üretilir; bu karbonat daha sonra aminil laktam ile reaksiyona sokulur. Beta laktam olan probun baş kısmı NAAA aktif bölgesiyle reaksiyona girerken, terminal alkin tıklama kimyası aracılığıyla bir raporlayıcı etiket ile fonksiyonelleştirilebilir. Protein bloğu ile sıçanların iltihaplı patilerinden alınan hücre ekstraktlarında NAAA aktivasyonunu tespit etmek için ARN 14 altı sekiz altı kullanılmıştır. Naif sıçanlarda herhangi bir NAAA sinyali tespit edilmez.

Buna karşılık, komple Freund Adjuvanı ile tedavi edilen sıçanlarda, aktif NAAA'ya karşılık gelen belirgin bir bant gözlemlenir. ARN 14 six eight six'nın bir diğer uygulaması ise floresan mikroskobu ile doku görüntülemedir. Burada kırmızı hücreler, aktif NAAA için pozitif olan alveolar makrofajları temsil etmektedir.

NAAA, daha yüksek büyütmede fark edilebildiği üzere, yaygın veziküler yapılarda lokalize olmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, dokulardaki aktif NAAA'yı hem protein blot hem de floresan mikroskobu ile tespit etmek için ARN 14 six eight six'nın nasıl sentezleneceği ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ek olarak, bu protokol hedefimize özgü olsa da, tanımladığımız prob uygulamaları, NAAA dışındaki hedeflere özgü farklı aktivite tabanlı problar için kolayca uyarlanabilir.