İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Bu yaklaşımın genel amacı, kolorektal kanserler tarafından üretilen metastatik tümör klonları ile karaciğer kolonizasyonunu modellemek ve bu modeli karaciğer metastazlarının tanı ve tedavisini geliştirmek için kullanmaktır. Klinik gözlemler metastatik hastalığın heterojenliğini göstermektedir. Modelimiz, oligometastatik ve polimetastatik hastalıklarla ilişkili genleri tespit etmek için bu heterojenliği yakalama yeteneği sağlar.

Ve bu bilgiyi metastazın erken tespiti ve tedavisinin iyileştirilmesi için kullanmak. Tekniğimizin en büyük avantajı, kolorektal kanserli hastalardan elde edilen çift etiketli monoklonal hücre dizilerini kullanmamız ve hem in vivo hem de ex vivo karaciğer metastazı gelişimini gözlemleyebilmemizdir. Bu tekniğin etkileri, metastatik hastalığın tedavisine kadar uzanır.

Metastatik lezyonların sayısının ve her lezyonun büyüme kinetiğinin kantitatif tahmini ile herhangi bir potansiyel ilacı test etme yeteneği verir. Luciferase tdTomato etiketli HCT116 hücrelerini ürettikten ve metin protokolüne göre ortam, reaktifler ve aletler hazırladıktan sonra, transpetekst edilmiş hücreleri 96 oyuklu plakalar halinde üç kopya halinde, oyuk başına aşağıdaki yoğunluklarda plakalayın. Hücrelerin beş saat boyunca inkübe edilmesinin ardından, görüntü yazılımını masaüstünde başlatarak bir IVIS sistemi kullanarak tdTomato floresan yoğunluklarını ölçün.

Görüntüleme süresini, orta gruplamayı, F/Stop için iki, uyarma filtresi için 535 ve emisyon filtresini başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. 96 oyuklu plakayı görüntüleme istasyonuna yerleştirin ve görüntülemeye başlamak için Al'a tıklayın. Görüntü alındıktan sonra, Araç Paleti'nde ROI araçları'na tıklayın ve yarık simgesinden 12x8'i seçin.

96 oyuklu plakanın görüntüsündeki sinyalin alanını kaplamak için 12x8 yarıklar oluşturun ve Ölçümler sekmesine tıklayın. Saniyede, steradyan başına, santimetre kare başına foton birimleriyle ROI ölçümleri tablosunun bulunduğu bir pencereyi gözlemleyin. Hücreler yüzde 70 ila 80 birleşmeye ulaştığında, dalak enjeksiyonundan yaklaşık bir saat önce, hücrelere ayırmak için yüzde 0.05 tripsin ve 0.53 milimolar EDTA ekleyin.

Hücreleri üç ila beş dakika inkübe ettikten sonra, tripsini nötralize etmek için eşit miktarda C-DMEM kullanın. Topaklanmayı önlemek için kültürleri iyice pipetleyin, ardından hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Askıya alınmış hücreleri, topaklanmayı önlemek için iyice pipetleyerek 100 mikrolitre başına 1,2 ila 2 x 10 ila 6 hücre konsantrasyonunda 1x DBPS'de dondurun.

Daha sonra, hücreleri enjeksiyona kadar buz üzerinde tutun, ara sıra tüpte tekrar süspanse edin. Analjezikler uyguladıktan ve metin protokolüne göre altı ila sekiz haftalık bir dişi atletik çıplak fareyi uyuşturduktan sonra, dalağı sol taraftaki deriden dışarıdan görülen mor bir alan olarak tanımlayın ve organın hemen üzerindeki cilt üzerinde sekiz milimetrelik bir sol yan kesi yapın. Sonra, karın duvarını kaldırın ve küçük bir kesi yapın.

Karın boşluğuna hava girmesine izin verin, böylece iç organlar kesi bölgesinden uzaklaşır. Daha sonra karın duvarı kesisini yaklaşık beş milimetreye kadar genişletin. Enjeksiyon için gösterilen adımlar prosedür için kritik öneme sahiptir.

Enjeksiyon sırasında tümör hücrelerinin sızması karaciğer dışı metastazlara neden olabilir. Enjeksiyon, portal venöz trombozu önlemek için 1,5 milyondan fazla hücre olmadan, 30 ila 60 saniye arasında yavaşça yapılmalıdır. Kesi etrafına hafifçe baskı uygulamak için pamuklu çubuk kullanarak dalağı açığa çıkarın.

Gerekirse, pankreas yağı, dalağa zarar vermemek için maruz kalmaya yardımcı olmak için nazikçe manipüle edilebilir. 27 gauge iğneli bir mililitrelik şırınga kullanarak, 30 ila 60 saniyelik bir süre boyunca, açıkta kalan dalağın ucuna 100 mikrolitre hücre enjekte edin. Enjeksiyonun sonunda, enjekte edilen hücre süspansiyonunun sızmasını önlemek için iğneyi çıkarmadan önce dalağın üzerine bir mikro klips yerleştirin ve beş dakika boyunca yerinde bırakın.

Enjeksiyondan beş dakika sonra, hemostaz için splenektomi yapmak için elde tutulan bir koter cihazı kullanın. Damarların proksimal tarafını bitişik yağ dokusu ile önceden pıhtılaştırarak ön taraftaki splenik hilum ile başlayın. Enjeksiyon bölgesinde dalak kanaması meydana gelebilir.

Mikro klips, tümör hücresi sızıntısını önlemek ve dalak kanamasını kontrol etmek için dalağa uygulanır. Hemostaz yöntemleri arasında koter, üç ila beş dakika boyunca basınç tutma ve gerekirse sütür ligasyonu yer alabilir. Karın duvarını 5.0 emilebilir örgülü sütür ve tek bir yatay dikiş kullanarak kapatın.

Ardından, cildi kapatmak için yine tek bir yatay dikişle 4.0 emilmeyen mono filamentli bir sütür kullanın. Hayvanı ameliyat sonrası metin protokolüne göre izleyin. Biyolüminesan görüntüleme yapmak için, metin protokolüne göre fareleri uyuşturduktan sonra, hayvanlara intraperitoneal olarak önceden hazırlanmış 150 mikrolitre ateşböceği lusiferin enjekte edin.

Fareleri, bitişik farelere giden sinyali en aza indirmek için hayvanlar arasında ara parçalar olacak şekilde sırtüstü pozisyonda bir IVIS'e yerleştirin. Lusiferin enjeksiyonundan üç dakika sonra, IVIS'i başlattıktan sonra, ışıldayan, bir saniyelik maruz kalma süresi ve orta gruplamayı seçin. Görüntülemeyi başlatmak için Al düğmesine tıklayın ve görüntülemenin lusiferin enjeksiyonundan üç dakika sonra tutarlı bir şekilde gerçekleştirildiğinden emin olun.

Görüntü alındıktan ve bir görüntü penceresi ve araç paleti göründükten sonra, ROI araçları'nı tıklatın ve görüntülenen fare sayısına karşılık gelen daire simgesinden bir ile beş arasında bir sayı seçin. ROI'leri tanımlamak için, ışıldayan sinyalin sinyal alanını farenin karın boşluğu üzerine daire içine alın ve ardından ROI'nin ölçümlerini rastgele bir parlaklık birimi olarak tıklayın. Arka plan için ek bir ROI çemberi ekleyin.

Enjeksiyondan dört hafta sonra, yaygın ışıldayan görüntüleme tomografisi veya DLIT yapmak için, IVIS'i başlattıktan sonra Görüntüleme Sihirbazı, Biyolüminesans'ı seçin ve İleri'ye tıklayın. DLIT'i seçin ve İleri'ye tıklayın. Firefly Probes'u seçin ve İleri'ye tıklayın.

Görüntü Konusu için Fare'yi, Pozlama Parametresi için Otomatik'i, Görüş Alanı için C-13 Santimetre'yi ve Konu Türü olarak 0,5 Santimetre'yi seçin ve İleri'yi tıklatın. Ardından görüntülemeye başlamak için Kazan düğmesine tıklayın. Bir görüntü aldıktan sonra, Analiz sekmesindeki DLIT 3D Yeniden Yapılandırma sekmesini seçin ve 3B yeniden yapılandırma görüntüsünü oluşturmak için Yeniden Yapılandır'a tıklayın.

Araçlar ve 3D Animasyon'a tıklayın. Ardından, 3B Animasyon penceresinde CCW'yi Y Ekseninde Döndür'ü seçin. Tıklayın Rekor ve Kaydet Dosyayı mov formatında bir dosyaya kaydetmek için.

Ex-vivo floresan görüntüleme yapmak için, metin protokolüne göre farelerden karaciğerleri topladıktan ve diseksiyon yaptıktan sonra, IVIS kullanarak her tümör kolonisi için floresan yoğunluklarını ölçün. Floresan, dört saniye Pozlama Süresi, Orta Gruplama, F/Stop için 2, uyarma filtresi için 535 ve emisyon filtresi için 580 seçilerek. Görüntülemeyi başlatmak için Edin'e tıklayın.

Görüntüyü aldıktan sonra, Araç Paleti'nde Görüntü penceresini bulun. ROI Araçları'na tıklayın ve daire simgesinden 1'i seçin. ROI'leri tanımlamak için, görüntüdeki tek tek tümör kolonilerinin sinyal alanını daire içine alın.

Arka planda ek bir ROI dairesi alın ve ardından rastgele bir parlaklık birimi olarak ROI Ölçümleri'ni tıklatın. Arka planda ek bir yatırım getirisi çemberi edinin. Son olarak, metin protokolüne göre hesaplamalar yapın.

Burada biyolüminesans ile gösterildiği gibi, dalak enjeksiyonundan üç hafta sonra, HCT116 L2T klonları P1 ve P2, klonlar O1 ve O2 ile karşılaştırıldığında daha büyük bir tümör yüküne sahipti. Bu veriler, O1 ve O2 klonlarının oligometastatik hastalığı taklit edebildiğini, P1 ve P2'nin ise karaciğerin agresif geniş yayılımlı metastatik kolonizasyonunu temsil ettiğini göstermiştir. Dalak enjeksiyonundan dört hafta sonra karaciğerin ex vivo floresansının ölçülmesi, P1 ve P2'nin O1 ve O2 karaciğerlerine kıyasla daha yüksek floresan yoğunluklarına sahip olduğunu doğruladı. Tümör klonlarının floresan etiketlemesi, karaciğerdeki bireysel metastatik kolonilerin sayısını ve boyutlarını tanımladı.

Genel olarak, ex vivo floresan görüntüler makroskopik bulgularla tutarlıydı, ancak yüzeyin altına gizlenmiş küçük koloniler floresan görüntüleme ile daha iyi tespit edildi. Burada gösterildiği gibi, her bir karaciğerde metastatik kolonilerin sayıları ve boyutları sayıldı ve ölçüldü ve her bir monoklon için her metastatik koloni üzerinde ex vivo floresan görüntüleme yapıldı. Bu grafiklerde gösterildiği gibi, P1'deki toplam metastaz sayısı P2, O1 ve O2'ye kıyasla daha yüksekken, bireysel kolonilerin ortalama büyüklüğü P2'de P1, O1 ve O2'den daha büyüktü. Modelimiz, metastazın moleküler heterojenliği ile ilişkili yeni ikna genlerinin tanımlanması için bir yaklaşım sunmaktadır.

Bu genler, metastaz tedavisinde yeni yaklaşımlar için hedef olarak kullanılabilir. Modelimiz, mevcut büyük klinik veri tabanlarından ortaya çıkan ancak metastatik hastalık bağlamında henüz işlevsel olarak tanımlanmamış farklı protein kodlayan ve kodlamayan genlerin doğrulanması için de kullanılabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, hayvan cerrahisinin inceliği nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Bununla birlikte, pratikle, kısa sürede iyi sonuçlar elde edilebilir. Bu prosedürü denerken, hayvan cerrahisi yönergelerini takip etmeyi, kanamayı dikkatlice kontrol etmeyi ve tümör hücresi süspansiyonunun sızmasını önlemeyi unutmamak önemlidir.