Name: İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Keşfedin, kolorektal kanserden kaynaklanan metastatik tümör klonlarının karaciğer kolonizasyonunu modellemek için geliştirilen ileri hayvan modelini. Bu yöntem, metastatik hastalığın heterojenliğini yakalayarak oligometastatik ve polimetastatik hastalıkla ilişkili genleri tespit etme olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Luc2-tdTomato plazmid ve HCT116 hücre hattı, yardım için Sayın Ani Solanki (Hayvan Kaynak Merkezi) fareler yönetimi için, ve Dr. Lara Leoni Dr. Geoffrey L. Greene (Chicago Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum DLIT ile. Floresan ve ışıldayan yoğunlukları sayımsal bir IVIS Spectrum Chicago Üniversitesi (Perkin Elmer, Hopkinton, MA) Entegre Küçük Hayvan Görüntüleme Araştırma Kaynak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma Kanser Araştırma Virginia ve DK Ludwig Fonu tarafından desteklenen, Akciğer Kanseri Araştırma Vakfı (LCRF), Prostat Kanseri Vakfı (PCF), ve Kanser Merkezi Destek Hibe (P30CA014599). fon çalışma dizaynı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

Bütün hayvan prosedürleri Chicago Üniversitesi (Protokol # 72213-09) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. 1. hazırlıklar <ol><li> % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM): 500, HCT116 tümör hücrelerinin kültürü için orta mL olun. </li><li> 20 dakika boyunca 251 ° F &#39;de, 4, cerrahi havlu, gazlı bez, iki küçük Adson alıcılar, iğne sürücüsü, makas iki çift küçük bir kelepçe ve 3 microclips - cihazlar dahil olmak üzere 3 dalak enjeksiyon modeline için kullanılabilir, otoklavın . </li><li> , Fareler için ameliyat sonrası anestezi hazırlayın dalak enjeksiyonu takiben deri altına uygulanacak. fare başına 0.9 normal serum fizyolojik 500 uL buprenorfin 4 ug - 2 seyreltilir. </li><li> periton enjeksiyonlar dur için ateşböceği luciferase 150 mikrogram / 150 uL hacimde hazırlayınbiyoparlaklık deneyleri ing. -20 ° C&#39;de saklayın ve ışıktan korumak. </li></ol> Lusiferaz / tdTomato etiketli monoklonal hücre çizgileri 10,11 2. Üretim <ol><li> Çözülme ve HCT116 insan kolorektal kanser hücre ve% 10 FBS, 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile DMEM içerisinde 293FT insan embriyonik böbrek hücreleri korumak. % 5 CO2 ve 37 ° C &#39;de kültür içinde muhafaza edin. </li><li> yüksek titre lentivirüs üretin. <ol><li> 12 x 10 6 293FT% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ile bitmiş DMEM, 18 ml (cDMEM) 15 cm hücre kültür tabaklarında kanalı 3 ve 10 arasında hücreler ve% 1 temel olmayan amino asitler, - D 1, levha 10 üzerinde . 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 CO2. </li><li> D2, aşağıdaki transfeksiyon çözeltisi kullanılarak hücrelerin transfekte: <ol><li> Her yemeğin, aşağıdakileri kullanın: lusiferaz (Luc2) ve tdTomato eklenen pFUG lentiviral vektör 37.5 ug DNA karışımınısteril H 2 O. 1062 uL toplam tekrar süspanse 11 (Chicago Üniversitesi&#39;nde Dr. Geoffrey Greene bir hediye), pCMVΔ8.74 25 ug ve pMD2.G ve 12.5 mikrogram yapıları 2 M CaCl 2 188 mcL ekleyin. </li><li> Ekle 1,250 2x Hepes-tamponlu tuzlu su (HBS, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na 2 HPO 4, 180 mM NaCl, pH 7.12), DNA / CaCl2 çözeltiye, bir kerede, bir damla uL, Kabarcık üflerken bir pipet ile çözüm. </li><li> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir, ve sonra da 25 uM&#39;lik bir son konsantrasyon yapmak için RT cDMEM ve klorokin 15.5 ml. </li></ol></li><li> 293FT hücrelerinin her tabak ortamı aspire ve transfeksiyon solüsyonu ile değiştirin. Kaplama hücreleri kolayca yerinden gibi, yavaş transfeksiyon solüsyonu 16 mL ekleyin. </li><li> D3 üzerine 8 sonra - yine Taki 16 saat transfeksiyon solüsyonu çıkarın ve Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile bir kez yıkama hücrelering hücreleri çıkarmak için değil bakım. 10 mM Hepes taze cDMEM 18 mL ile değiştirin. Not: yavaşça bulaşık hareket transfeksiyon solüsyonu aspire ve hücreleri uzaklaştırmak için, böylece plakaların yan duvarı boyunca ortamı eklenir. </li><li> D, 4, transfeksiyon zamanı 48 saatte, hücreleri çıkarmak için şekilde bir pipet ile yavaşça aspire yemekler ortamı toplar. Santrifüj 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de toplanan medya büyük hücreli enkaz çöktürmek için. </li><li> kullanılarak viral süpernatan filtre 0.45 um düşük-protein bağlayıcı 50,000 xg ve 4 ° C &#39;de 2 saat süre ile, SW-28 rotor kullanılarak filtre şişesi ve santrifüj. santrifüj bittikten hemen sonra süpernatant süzün ve silecekler ile tüpün içini kurutun. </li><li> % 1 FBS, düşük serum Ortamı (RSM) 50 uL viral pelletini. Alikotlar ileride kullanmak (viral stok) -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> lentivirüs transduceve HCT116 hücrelerine es tdTomato pozitif klonlardan oluşan bir panel oluşturabilir. <ol><li> Viral enfeksiyondan önce 1 x 10 5 1 yuvalı plakalar 24 d yoğunluğunda HCT116 hücreler plaka. </li><li> % 1 penisilin / streptomisin ve 8 ug / ml polibren ile: (100 seyreltme 1) (CRSM) RSM 4 mL (2.2.7) yeniden süspansiyon haline getirilmiş virüs 40 uL seyreltilir. </li><li> enfeksiyonun günde, DPBS ile bir kez yıkama hücreleri ve daha sonra her bir aşama 2.3.2 seyreltilmiş virüs 250 uL ekleyin. Her bir oyuğa cDMEM 1 ml, sonra 37 ° C&#39;de 4 saat ve% 5 CO2 inkübe ve; 72 saat - 48 CO2, 37 ° C&#39;de inkübe ve% 5. </li><li> % 0.05 tripsin 1 mL 0.53 mM EDTA hücrelerin tekrar ve tripsin nötralize etmek için cDMEM 1 ml. 4 dakika boyunca 300 x g&#39;de bir mikrosantrifüj tüpü ve pelet hücreleri aktarın. Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) artı% 2 FBS 1 mL pelet 3x yıkanır. </li><li> Adım 2.3.4 den pelet1 x 10 6 hücre / mL, tek bir hücre süspansiyonu içine FACS tamponu (% 2 FBC ve PBS içinde 2 mM EDTA) ile. </li><li> Sıralama PE pozitif hücreler için yolluklama bir hücre ayırıcıyla tdTomato pozitif HCT116 hücreleri (uyarım / emisyon: 556/585 nm). Ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri (Şekil 1 A) oluşturmak için% 5 CO2 37 ° C&#39;de 10 cm&#39;lik bir tabak içinde toplanan hücreler büyümek. </li><li> % 0.05 tripsin 8 mL, 3 0.53 mM EDTA 2.3.6 gelen ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri tekrar - 5 dakika ve daha sonra tripsin nötralize etmek için 8 mL cDMEM ilave edin. <ol><li> 4 dakika boyunca 300 x g&#39;de 50 ml tüp ve pelet hücreleri aktarın. Süpernatantı ve cDMEM (Şekil 1B) 200 uL başına 1 hücreye ebeveyn tdTomato pozitif HCT116 hücreleri sulandırmak. </li></ol></li><li> % 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de (Şekil 1C) bir 96-çukurlu plaka içinde çukur başına bir tek hücre (seyreltme 200 uL) plaka. </li><li> % 5 CO2 37 ° C&#39;de şişeler içinde tek tek monoklonları büyütün. (Şekil 1D). </li></ol></li></ol> Hücre sayısı bir işlev olarak Floresan Sinyal Şiddeti 3. Kalibrasyon <ol><li> 10 3, 0 yoğunluğunda, hemen HCT116-l2t olarak adlandırılır, transfekte olmamış HCT116 hücreleri, levha 2 x 10 4, 3 x 10 5 x 10 4 5, 7 x 10 4, x, 10 4 9 ve 10 5 hücre / göz her yoğunluk üç kez, 96 oyuklu plakalar. </li><li> Inkübasyondan 5 saat sonra, IVIS 10 kullanılarak tdTomato floresan şiddetleri ölçmek. <ol><li> Yazılımı başlatmak için masaüstündeki görüntü yazılımı simgesini tıklayın. görüntüleme sistemi başlatmak için &quot;Başlat&quot; butonuna tıklayın. (Birkaç dakika sürer) başlatma tamamlandıktan sonra, &quot;Floresan&quot;, &quot;4 saniyelik&quot; pozlama süresi, &quot;Orta&quot; binning, &quot;2&quot; F / durdur seçeneğini &quot;535&quot; uyarma filtresi,ve &quot;580&quot; emisyon filtresi. </li><li> görüntüleme istasyonu üzerinde 96 plaka yerleştirin ve görüntüleme başlatmak için &quot;Acquire&quot; üzerine tıklayın. Görüntü alındıktan sonra, araç paleti içinde &quot;ROI Araçlar&quot; linkine tıklayın ve yarık simgesinden 12 x 8 seçin. </li><li> 96 plaka görüntü üzerinde sinyal alanı kapsayacak ve ölçümler sekmesini tıklayın 12 x 8 yırtmaçlı oluşturun. Cm kare başına steradyan&#39;dır s başına fotonların birimleri ile ROI ölçümleri bir tablo ile bir pencere gözlemlemek (fotonlar / s / sr / cm2). </li></ol></li><li> hücre sayısı ve sinyal yoğunluğu temsil eden işlev (Y ekseni) eşit bağımsız değişken (X ekseni) bir scatterplot oluşturun. Floresan yoğunluğunun birimine karşılık gelen hücrelerin miktarını hesaplamak için (Şekil 2) 10, bir veri analiz yazılımı kullanılarak regresyon eğrisi hesaplanır. </li></ol> Karaciğer Metastazlarının 4. Hayvan Modeli <ol><li> HCT116-l2t hücreleri 70 ulaştıklarında-% 80 confluency, dalak enjeksiyon yaklaşık 1 saat önce onları hazırlamak. 3 0.53 mM EDTA,% 0.05 tripsin kullanılarak hücreleri ayırmak - 5 dakika, ve daha sonra cDMEM eşit miktarda ile nötralize. topaklanma önlemek için iyice pipetle emin olun. </li><li> Otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak. </li><li> 2 x 10 6 hücre / 100 uL - 1.2 &#39;lik bir konsantrasyon 1 x DPBS tekrar süspansiyon hücreleri. pipet ve topaklanma önlemek için iyice hücreleri tekrar süspansiyon emin olun. </li><li> bazen tüp onları resuspending, enjeksiyon kadar buz üzerinde hücreleri tutun. </li><li> fareler anestezi öncesinde, adım 1.3 açıklanan buprenorfin karışımı 500 uL enjekte deri altından tarafından ameliyat öncesi anestezi ve sıvı bolus sağlar. Ağrı (hareketliliğin azalması, kambur boy, damat başarısızlık, ele seslendirme) belirtileri çözülene kadar günde iki kez ek buprenorfin karışımının aynı dozunu. </li><li> 6 ila 8 haftalık anestezisibir anestezi bölmesi oksijen içinde% 2 izofluran ile -eski dişi atimik çıplak fareler. Fareler kuyruk sıkıştırarak anestezi altında tamamen emin olun. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. dalak enjeksiyon için tek bir burun konisi her anestezi fare aktarın. insizyon önce, her bir fare olan steril bir cerrahi örtü ile kaplanmalıdır. </li><li> çıplak farelerin sol kanattan deri yoluyla dışarıdan görülen bir mor alanı olarak dalak tanımlayın. Mikrodiseksiyon makas kullanarak, sadece dalak üstündeki cilde 8 mm sol yan kesi yapmak. <ol><li> Sonraki, karın duvarında yukarı kaldırın ve küçük bir kesi yapmak. iç organlar kesi uzaklaşmaya böylece karın boşluğuna hava izin verin. Yaklaşık 5 mm karın ön duvarı kesi büyütün. </li><li> hafifçe bir pamuklu çubuk ile kesi çevresinde basınç uygulayarak dalak Açığa. Gerekirse, pankreas şişman nazikçe adam olabilirdalak zarar etmeyecek şekilde maruz kalma ile yardımcı olmak için ipulated. </li></ol></li><li> Yavaşça maruz dalak ucuna bir 27 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak hücrelerin 100 uL enjekte edilir. İlave karaciğer tümörleri önlemek için, 60 s - en az 30 daha uzun bir sürede, yavaş yavaş enjekte edilir. </li><li> önceden enjekte edilen hücre süspansiyonu sızmasını önlemek için enjeksiyon sonunda iğne çıkarmadan dalak bir mikro yerleştirin. </li><li> 5 dakika boyunca yerine mikro-klip bırakın. </li><li> 5 dk enjeksiyondan, hemostaz için bir el koter cihazı kullanılarak bir splenektomi gerçekleştirin. Ön taraftan başlayarak dalak hilusu teşrih. Büyük Gemilerin diseksiyon, aşırı kanama önlemek için koter kullanılarak, komşu yağ dokusu ile damarların proksimal tarafı ön coagulate. NOT: hemostaz için Yöntemler: koter ile doğrudan kanama noktasını koagüle 3 kanama noktasına baskı uygulamak - 5 dakika, ya da bir 5-0 ipek kravat ile kanama noktası dikiş-Arter. </li&gt; <li> iki kat, her bir fare cenah kesi kapatın. İlk olarak, tek bir yatay dikiş 5-0 emilebilir örgülü sütür (örneğin, vikril) ile karın duvarı kapatın. Sonra, tek bir yatay dikiş ile yine 4-0 emilemeyen monofilament sütür (örneğin, prolen) kullanarak cilt kapatın. </li><li> Her prosedür arasındaki steril koşulları sağlamak için% 70 izopropanol püskürterek bütün aletleri temizleyin. NOT: Anestezi uyanık iken hayvanlar ısındı emin olun. Onlar ayakta olmak ve normal aktiviteye dönünceye kadar ameliyat sonrası tüm fareleri izleyin. 5 dk - Tipik olarak, iyileşme süresi yaklaşık 3 olduğunu. Onlar sternum yatma muhafaza edilmesi için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvanları bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. </li></ol> Vivo Bioluminescent Görüntüleme 5. <ol><li> üzerinde görüntüleme gerçekleştirmekhaftalık olarak ölçmek ve zamanla biyoparlaklık değişiklikleri ölçmek için. </li><li> Bir anestezi odasına fareler yerleştirin ve oksijen içinde% 2 izofluran ile onları uyutmak. Fareler kuyrukları kısma anestezi altında tamamen emin olun. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem kullanın. </li><li> Daha sonra, periton boşluğu içine adım 1.4 firefly luciferase önceden hazırlanmış 150 uL her fare enjekte edilir. </li><li> Bireysel burun konileri izofluran uygulanması ile IVIS fareler yerleştirin. Bitişik farelere sinyali en aza indirmek için aralarında ayırıcılar ile yatar pozisyonda fareler yerleştirin. beş farenin en fazla bir zamanda görüntülenebilir. </li><li> Tedbir ve bioluminescent şiddetleri luciferase enjeksiyondan sonra 3 dakika analiz. <ol><li> Adım 3.2.1 de açıklandığı gibi IVIS başlatılıyor sonra, &quot;Luminescent&quot;, &quot;1 saniye&quot; maruz kalma süresi ve &quot;Orta&quot; binning seçin. </li><li> IMAGin başlatmak için &quot;Acquire&quot; düğmesini tıklayınörn. luciferase enjeksiyondan sonra tutarlı bir süre (3 dk) her görüntüleme gerçekleştirmek için emin olun. </li><li> Görüntü alındıktan sonra, bir görüntü penceresi ve araç paleti görünecektir. &quot;YG Araçlar&quot; tıklayın ve &quot;1&quot;, &quot;2&quot;, &quot;3&quot;, &quot;4&quot;, ya da &quot;5&quot; daire simgesi, görüntülü farelerin sayısına karşılık gelen. </li><li> , İlgi (ROI) Bölgeleri tanımlamak fare karın boşluğuna ışıldayan sinyalinin sinyal alanını daire ve sonra radyant verimlilik keyfi bir birim olarak ROI &quot;ölçümleri&quot; tıklayın ((fotonlar / s / cm 2 / steradyan) / (uW / cm2)). arka ek bir yatırım getirisi daire var emin olun. </li></ol></li><li> Dört hafta sonrası enjeksiyon ve önceki hayvan kurban etmek, tek tek tümör kolonileri biyolüminesans şiddetlerinin gerçek zamanlı 3D rekonstrüksiyon kullanarak tümör yükünü ve dağılımını değerlendirmek için IVIS kullanarak Diffüz Lüminesans Görüntüleme Tomografi (DLIT) gerçekleştirin. <ol&gt; <li> fareler anestezi ve aşama 5.2.4 de tarif edildiği gibi, luciferase enjekte edilir. DLIT her seferinde bir fare üzerinde gerçekleştirilmiştir. </li><li> Adım 3.2.1 de açıklandığı gibi IVIS başlatılıyor sonra, &quot;Görüntüleme sihirbazı&quot;, &quot;biyolüminesensin&quot; seçin ve &quot;İleri&quot; ye tıklayın. &quot;DLIT&quot; seçin ve &quot;İleri&quot; butonuna tıklayınız. &quot;Firefly&quot; probları seçin ve &quot;İleri&quot; butonuna tıklayınız. &quot;Fare&quot; görüntü konusunu, &quot;Otomatik&quot; poz parametresi, görüş &quot;C-13 cm&quot; alan ve &quot;0,5 cm&quot; konu yüksekliği seçin ve &quot;İleri&quot; butonuna tıklayınız. görüntüleme başlatmak için &quot;Edinme&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> Görüntü alındıktan sonra, &quot;DLIT 3D İmar&quot; sekmesini seçin ve &quot;Analiz&quot; sekmesine gidin ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon görüntü oluşturmak için &quot;yeniden yapılandırma&quot; tıklayın. </li><li> &quot;Araçlar&quot; ve &quot;3D Animasyon&quot; tıklayın. 3D animasyon penceresinde &quot;Y ekseni üzerinde Spin SOLA&quot; seçeneğini seçin. Bir .mov dosya biçimi içine &quot;Kaydet&quot; ve &quot;Kaydet&quot; i tıklayın. </li></ol></li></ol> 6. Ex Vivo Floresan Görüntüleme <ol><li> dalak enjeksiyonları izleyen 6 hafta - anestezi, veya 4 kurumsal yönergelere göre ise servikal dislokasyon ile fareler kurban. </li><li> karaciğer Hasat. sağdan sola bir yatay bir kesi yapmak. Bir pikap ile kılıç şeklinde sürecini kapma falciform, hepatik ven ve inferior vena kava teşrih. <ol><li> triadın diseksiyon sırasında kaudat lob kesmemeye özen sağ hepatorenal ligament, triadın ve sol hepatorenal ligament teşrih. Bu otofloresans gösterecektir olarak karaciğer hasat sonra, safra kesesi çıkarın. Mevcut herhangi bir ek ekstra karaciğer tümörlerinin not edin. </li></ol></li><li> Mevcut makroskopik numaraları ve karaciğer tümörlerinin boyutları not alın ve DPBS hasat ciğeri yerleştirin. NOT: Tümörler çıplak gözle makroskopik olarak görünürBeyaz tümörler (a Örnek örneğin, bakınız Şekil 4). </li><li> Önceki görüntüleme kağıda yerleşimi, her karaciğer alıp yavaşça bir kağıt havlu üzerine blot aşırı sıvı kaldırmak. </li><li> IVIS kullanarak her bir tümör kolonisinden floresan şiddetleri ölçün. <ol><li> &quot;Floresan&quot;, &quot;4 saniye&quot; pozlama süresi, &quot;Orta&quot; binning, &quot;2&quot; F / stop &quot;535&quot; uyarma filtresi ve &quot;580&quot; emisyon filtresi seçin. görüntüleme başlatmak için &quot;Edinme&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> Görüntüyü aldıktan sonra, görüntü penceresi ve araç paleti bulun. &quot;YG Araçlar&quot; tıklayın ve daire simgesinden &quot;1&quot; seçeneğini seçin. ((Radyan verimlilik keyfi bir birim olarak ROI &quot;ölçümleri&quot; tıklatın daire, görüntü üzerinde bireysel tümör kolonileri sinyal alanını İB&#39;leri tanımlamak ve fotonlar / s / cm 2) / steradyan / (uW / cm 2) ). arka ek bir yatırım getirisi daire var emin olun. </li></ol&gt; </li><li> Bir küre olmaya varsayarak toplam tümör hacmini hesaplayın. Tümör hacmi = 4 x π xr 3/3 (r = yarıçap). splenically enjekte edilen hücrelerin sayısı bölü karaciğer tümör sayısı gibi tümör koloni oluşturan hücrelerin (Fc) fraksiyonu hesaplayın. </li><li> Adım 3.3 doğrusal yaklaşım gelen koloni başına toplam hücre sayısını (= X) hesaplayın. Td (gün) 28 / Y. = Y = 2 X ve Td günlük olarak hücre bölünmeleri (= Y) sayısını hesaplayın </li></ol>

<ol><li>Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+score+for+predicting+recurrence+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+analysis+of+1001+consecutive+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases.</a> Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).</li>
<li>Pawlik, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surgical+margin+status+on+survival+and+site+of+recurrence+after+hepatic+resection+for+colorectal+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases.</a> Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).</li>
<li>Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+Cancer%2C+Systemic+Inflammation%2C+and+Outcome%3A+Staging+the+Tumor+and+Staging+the+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host.</a> Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).</li>
<li>Veen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Follow-Up+and+Survivorship+After+Completing+Systematic+Surveillance+in+Stage+I-III+Colorectal+Cancer%3A+Who+Is+Still+at+Risk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastrointest.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk.</a> J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).</li>
<li>Siegel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).</li>
<li>O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+cancer+survival+rates+with+the+new+American+Joint+Committee+on+Cancer+sixth+edition+staging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging.</a> J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).</li>
<li>House, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+after+hepatic+resection+for+metastatic+colorectal+cancer%3A+trends+in+outcomes+for+1%2C600+patients+during+two+decades+at+a+single+institution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Surg%22%5BJournal%5D)">Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution.</a> J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).</li>
<li>Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+bioluminescence+imaging+of+colorectal+liver+metastases+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse.</a> J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).</li>
<li>Rajendran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+bioluminescent+hepatic+tumour+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine bioluminescent hepatic tumour model.</a> J. Vis. Exp. (41), (2010).</li>
<li>Oshima, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+tumor+clones+with+differential+liver+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging of tumor clones with differential liver colonization.</a> Sci. Rep. 5 (10946), (2015).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Wang, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analyses+identify+osteopontin%2C+LAMB3+and+ITGB1+as+critical+pro-metastatic+genes+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer.</a> PLoS One. 8 (2), e55714(2013).</li>
<li>Fidler, I. J., Kripke, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+results+from+preexisting+variant+cells+within+a+malignant+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor.</a> Science. 197 (4306), 893-895 (1977).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Khodarev, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT1+pathway+mediates+amplification+of+metastatic+potential+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy.</a> PLoS One. 4 (6), e5821(2009).</li>
<li>Langley, R. R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell-organ+microenvironment+interactions+in+the+pathogenesis+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis.</a> Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligo-+and+polymetastatic+progression+in+lung+metastasis%28es%29+patients+is+associated+with+specific+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs.</a> PLoS One. 7 (12), e50141(2012).</li>
<li>Lussier, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+characterizes+oligometastasis%28es%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es).</a> PLoS One. 6 (12), e28650(2011).</li>
<li>Calon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+colorectal+cancer+on+a+TGF-beta-driven+program+in+stromal+cells+for+metastasis+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation.</a> Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).</li>
<li>Vanharanta, S., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+metastatic+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Origins of metastatic traits.</a> Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).</li>
<li>Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways%3A+Interferon%2FStat1+Pathway%3A+Role+in+the+tumor+resistance+to+genotoxic+stress+and+aggressive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth.</a> Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-stimulated+gene+15+%28ISG15%29+is+a+trigger+for+tumorigenesis+and+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).</li>
<li>Cespedes, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+microinjection+of+human+colon+cancer+cells+in+nude+mice+induces+tumor+foci+in+all+clinically+relevant+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.</a> Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J. Vis. Exp. (10), (2007).</li>
<li>Soares, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preclinical+murine+model+of+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A preclinical murine model of hepatic metastases.</a> J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).</li>
<li>Evans, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mice+to+men%3A+Murine+models+of+colorectal+cancer+for+use+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Geçerli raporunda sunulan hayvan modeli iki ana yaklaşım dayanmaktadır. İlk olarak, koloni ve karaciğerde çoğalan farklı eğilimleri metastatik klonlar gözlemleme yeteneği sağlamak için, yüksek ölçüde heterojen monoklonal hücre soylarının bir paneli yerine kurulmuş bir bölünmemiş kanser hücre hattı 12,13 daha kurulmuştur. Metastaz gelişmesine monoklonal yaklaşımı son genomik verileri 14 tarafından haklı ve başarılı metastatik süreç 10,15,16 modellemek için önceden kullanıldı. İkinci olara...

Primer kolorektal kanserler (CRC) karaciğer metastazı olan hastalar kötü prognoz ile karakterizedir. % 12 5 - karaciğer metastazlarının (evre IV) olan hastalar sadece 8 5 yıllık sağkalım oranı ise% 88 3,4 - birincil metastatik olmayan CRC için 5 yıllık sağkalım oranı (aşamaları I - III) 75 olarak tahmin edilmektedir 6. Ancak, metastatik hastalar metastazlar ve farklı nüks kez farklı numaralar ile başvuran, heterojen bir grubunu temsil etmektedir. Klinik gözlemler, ve (yerel büyüme oranı ile orantılı) tek bir metastaz boyutu (kolonileşme yetisi ya kolonizasyon frekansına orantılı olabilir) metastaz sayısı bağımsız prognostik faktörler 1,7 olduğuna işaret etmektedir. büyümek için kendi yetenek ve yaymak ve karaciğer mikroçevresinin hayatta kendi yeteneği: Bir başka deyişle, karaciğer kolonize metastatik klonların başarısı iki önemli özelliği bağlıdır. Dizaynyakalama ve büyük ölçüde karaciğer metastazı biyoloji anlayışımızı geliştirmek ve potansiyel terapötik yaklaşımların tasarımı için etkili bir araç sağlayabilir metastatik klonların özelliklerini nicel yeteneği ile başarılı klinik modelleri. Deneysel karaciğer metastazı modelleri daha önce 8,9 rapor edilmiştir, ancak bunların hiçbiri niceliksel yakalamak ve in vivo ve ex vivo hem de bireysel metastatik klonların özelliklerini tanımlamak için yeteneği sağladı. Burada, farklı karaciğer kolonizasyon verimlilik ve büyüme özellikleri ile tümör klonların nesil içeren karaciğer metastazı yeni, gelişmiş bir model sunuyoruz. Metastatik kapasite iç farklılıklar vardır monoklonal hücre çizgilerinin üretimi ile lusiferaz ve tdTomato floresan protein kanser hücrelerinin çift etiketleme bir arada kullanılabilir. Bu deneysel modelde, veriler gelişimi göstermektedirKaraciğer metastazları kolonizasyon sıklığı açısından ve klinik gözlemlerle tutarlı iki katına zaman (Td), tarif edilebilir. Bu modelin sayısal doğa ilaç keşfi ve tanı amaçlı kolayca uyarlanamıyor yapar.

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Görüntüleme Sistemi</td><td>Kumpas Yaşam Bilimleri</td><td>124262</td><td>In Vivo görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 Yazılımı</td><td>Kumpas Yaşam Bilimleri</td><td>128165</td><td>Görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>VAD-MGX Araştırma Anestezik Makinesi</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>İnhalasyon anestezi makinesi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>Hücre kültürü reaktifleri</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Hücre kültürü reaktifleri</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin, sıvı (10.000 ünite penisilin; 10.000 &mu; g streptomisin)</td><td>İnvitrojen</td><td>15140163</td><td>Hücre kültürü reaktifleri</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>Hücre kültürü reaktifleri</td></tr><tr><td>Buprenex Enjeksiyonu (0.3 mg/mL)</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>Buprenorfin hidroklorür</td></tr><tr><td>İkizler Koter Sistemi</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Splenektomi için elde tutulan koter</td></tr><tr><td>, Mikro Klip; Düz; 70 gram basınç; 1,5 mm Klips Genişliği; 10 mm Çene Uzunluğu</td><td>Roboz Cerrahi Alet</td><td>RS-5426</td><td>Hemoclip: Dalak enjeksiyonu sonrası hemostaz aletleri</td></tr><tr><td>D-lusiferin, potasyum tuzu</td><td>Goldbio Teknolojisi</td><td>LUCK-1G</td><td>Luciferin potasyum tuzu</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>Azaltılmış Serum Ortamı</td></tr><tr><td>TC20 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>Otomatik hücre sayacı</td></tr><tr><td>JMP10 yazılımı&nbsp;</td><td>SAS Enstitüsü</td><td></td><td>Veri analiz yazılımı</td></tr><tr><td>BD FACSAria II hücre sıralayıcı</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>Hücre sıralayıcı</td></tr></tbody></table>

İleri hayvan karaciğer kolorektal metastaz model: görüntüleme teknikleri ve metastatik klonların Özellikleri

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Karaciğer metastazlarının ve ilerlemesi yavaş oranlarının sınırlı sayıda hasta başarılı bir şekilde lokal tedavi ile tedavi edilebilir 1,2 yaklaşır. Bununla birlikte, küçük bir karaciğer metastazlarının heterojenliği hakkında bilinen ve tek tek metastatik koloni gelişimini değerlendirmek edebilen hayvan modelleri ihtiyaç vardır. Burada, kantitatif karaciğerde bireysel tümör klonların gelişimini görselleştirmek ve büyüme kinetiği ve kolonizasyon verimliliğini tahmin yeteneği sağlar hepatik metastaz gelişmiş bir model sunuyoruz. Bu stabil olarak lusiferaz ve tdTomato ve farklı büyüme özelliklerine sahip ile etiketlenmiş HCT116 insan kolorektal kanser hücrelerinin monoklonal türevlerinin bir panel oluşturulur. Bir splenektomi ardından dalak enjeksiyonu ile, bu klonların çoğunluğu karaciğer metastazı üretebilen, fakat kolonizasyon farklı frekanslarda ve farklı büyüme oranları ile vardır. In vivo görüntüleme Sisteml kullanılmasıM (IVIS), görselleştirmek ve in vivo ve ex vivo Işıklı flüoresan görüntüleme ile metastazı gelişimi ölçmek mümkündür. Buna ek olarak, Diffüz Lüminesans Görüntüleme Tomografi (DLIT) in vivo karaciğer metastazı 3D dağılımını sağlar. Hasat karaciğerin ex vivo floresan görüntüleme bireysel hepatik metastatik kolonilerin nicel ölçümler sağlar, karaciğer kolonizasyon sıklığı değerlendirilmesi ve büyüme kinetiği için izin metastaz. Model klinik gözlenen karaciğer metastazları benzer olduğundan, karaciğer metastazı ile ilişkili genleri tespit etmek için ve karaciğer metastatik hastalık için potansiyel ablatif veya adjuvan tedaviler test etmek için bir yöntemi olarak hizmet verebilir.

Bu denemenin amacı,., In vivo metastatik tümör yükü seri ölçümü için ve kolonize sıklığı ve karaciğer metastazları gelişen büyüme kinetiğinin tahmini için potansiyeli olan bir tutarlı ve kolayca tekrarlanabilir hayvan modeli kurmak oldu 2-6 Rakamlar efsanelerle, Creative Commons CC-BY lisansı 10 altında önceki yayın sağlanmaktadır. Çift etiketli tümör hücre monoklonları Üretimi <p class="j...

Metastatik klonların uzak bölgeleri kolonize etme yeteneği, çoğalma kapasitelerine ve/veya önemli bir çoğalma olmaksızın konakçı mikro ortamda hayatta kalma yeteneklerine bağlıdır. Burada, metastatik klonlar tarafından her iki tip karaciğer kolonizasyonunun kantitatif olarak görselleştirilmesine izin veren bir hayvan modeli sunuyoruz.

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Bu yaklaşımın genel amacı, kolorektal kanserlerin oluşturduğu metastatik tümör klonlarının karaciğer kolonizasyonunu modellemek ve bu modeli karaciğer metastazlarının teşhis ve tedavisini geliştirmek için kullanmaktır. Klinik gözlemler, metastatik hastalığın heterojenliğini göstermektedir. Modelimiz, oligometastatik ve polimetastatik hastalıkla ilişkili genleri tespit etmek için bu heterojenliği yakalama imkanı sağlamaktadır.Ve bu bilgiyi, metastazın erken teşhisinin ve tedavisinin geliştirilmesi için kullanmak. Tekniğimizin temel avantajı, kolorektal kanserli hastalardan türetilmiş çift etiketli monoklonal hücre hatları kullanmamız ve karaciğer metastazlarının gelişimini hem in vivo hem de ex vivo gözlemleyebilmemizdir. Bu tekniğin doğurguları, metastatik hastalık tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem, metastatik lezyon sayılarının kantitatif tahmini ve her bir lezyonun büyüme kinetiği ile herhangi bir potansiyel ilacı test etme imkanı sağlar. Metin protokolüne uygun olarak lusiferaz tdTomato işaretli HCT116 hücrelerini oluşturduktan ve besiyerini, reaktifleri ve cihazları hazırladıktan sonra, transfekte edilmiş hücreleri 96 kuyucuklu plakalarda, her kuyucuk için aşağıdaki yoğunluklarda, üç tekrar halinde ekimleyin. Hücrelerin beş saatlik inkübasyonunun ardından, masaüstündeki görüntüleme yazılımını başlatarak bir IVIS sistemi aracılığıyla tdTomato floresan yoğunluklarını ölçün.Görüntüleme süresini, orta düzey binning'i, F/Stop için iki, eksitasyon filtresi için 535 ve emisyon filtresi için 580 değerlerini başlatmak için Initialize düğmesine tıklayın. 96 kuyucuklu plakayı görüntüleme istasyonuna yerleştirin ve görüntülemeyi başlatmak için Acquire'a tıklayın. Görüntü elde edildikten sonra Araç Paleti'nde (Tool Palette) ROI araçlarına (ROI tools) tıklayın ve yarık simgesinden 12x8'i seçin.96 kuyucuklu plaka görüntüsündeki sinyal alanını kapsayacak şekilde 12x8 yarık oluşturun ve Ölçümler sekmesine tıklayın. Saniyede, steradyan başına, santimetrekare başına foton birimindeki ROI ölçümleri tablosunun bulunduğu bir pencere gözlemleyin. Hücreler, dalak enjeksiyonundan yaklaşık bir saat önce yüzde 70 ila 80 konflüense ulaştığında, onları ayrıştırmak için hücrelere yüzde 0,05 tripsin ve 0,53 milimolar EDTA ekleyin.Hücreleri üç ila beş dakika inkübe ettikten sonra, tripsini nötralize etmek için eşit hacimde C-DMEM kullanın. Topaklanmayı önlemek için kültürleri iyice pipetleyin, ardından hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayıcı kullanın. Süspansiyon halindeki hücreleri, topaklanmayı önlemek için iyice pipetleyerek, 1x DBPS içinde 100 µL başına 1,2 ila 2 x 10⁶ hücre konsantrasyonunda dondurun.Ardından, hücreleri enjeksiyona kadar buz üzerinde tutun ve ara ara tüp içerisinde tekrar süspande edin. Altı ila sekiz haftalık dişi atimik nude fareye metin protokolüne uygun olarak analjezik uygulayıp anestezi yaptıktan sonra, dalak bölgesini sol yan tarafta deri üzerinden dışarıdan görülen mor alan olarak belirleyin ve organun hemen üzerindeki deriye sekiz milimetrelik bir sol yan kesi yapın. Daha sonra, karın duvarını yukarı kaldırarak küçük bir insizyon gerçekleştirin.İç organların insizyon bölgesinden uzaklaşması için abdominal boşluğa hava girmesine izin verin. Ardından, abdominal duvar insizyonunu yaklaşık beş milimetreye kadar genişletin. Enjeksiyon için gösterilen adımlar prosedür için kritiktir.Enjeksiyon sırasında tümör hücrelerinin sızması, hepatik dışı metastazlara yol açabilir. Portal ven trombozunu önlemek için enjeksiyon, 1,5 milyon hücreyi geçmeyecek şekilde, 30 ila 60 saniye boyunca yavaşça gerçekleştirilmelidir. Kesi çevresine pamuklu çubukla nazikçe baskı uygulayarak dalak açığa çıkarılmalıdır.Gerektiğinde, dalağa zarar vermemek amacıyla, görünürlüğü artırmak için pankreas yağı nazikçe manipüle edilebilir. 27 gauge iğneye sahip bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, 30 ila 60 saniyelik bir süre içinde, açıkta kalan dalak ucuna 100 µL hücre enjekte edin. Enjeksiyon sonunda, enjekte edilen hücre süspansiyonunun sızmasını önlemek için iğneyi çıkarmadan önce dalağa bir mikro klips yerleştirin ve klipsi beş dakika boyunca orada bırakın.Enjeksiyondan beş dakika sonra, hemostaz için el tipi bir koter cihazı kullanarak splenektomi gerçekleştirin. Damarların proksimal tarafını bitişik yağ dokusuyla birlikte önceden koagüle ederek anterior taraftaki splenik hilumdan başlayın. Enjeksiyon bölgesinde splenik kanama meydana gelebilir.Tümör hücresi sızıntısını önlemek ve splenik kanamayı kontrol etmek için dalağa mikro klips uygulanır. Hemostaz yöntemleri; koterizasyon, üç ila beş dakika boyunca basınç uygulamak ve gerekirse sütur ligasyonunu içerebilir. Karın duvarını 5.0 emilebilir örgü sütur ve tek bir yatay dikiş kullanarak kapatın.Ardından, cildi kapatmak için 4.0 emilmez monofilaman sütür kullanarak tek bir yatay dikiş atın. Metin protokolüne uygun olarak, operasyon sonrası hayvanı takip edin. Biyolüminesans görüntüleme yapmak için, fareleri metin protokolüne göre anestezi altına aldıktan sonra, hayvanlara intraperitoneal olarak önceden hazırlanmış 150 µL ateş böceği lusiferin enjekte edin.Fareleri, yan yana olan hayvanlara sinyal geçişini en aza indirmek için aralarına ara parçalar yerleştirerek sırtüstü pozisyonda bir IVIS cihazına yerleştirin. Lusiferin enjeksiyonundan üç dakika sonra, IVIS cihazını başlatıp lüminesan seçeneğini, bir saniyelik pozlama süresini ve orta düzey binning ayarını seçin. Görüntülemenin lusiferin enjeksiyonundan tam üç dakika sonra tutarlı bir şekilde gerçekleştirildiğinden emin olarak görüntülemeyi başlatmak için Acquire düğmesine tıklayın.Görüntü alındıktan, bir görüntü penceresi ve araç paleti göründükten sonra, ROI araçlarına tıklayın ve daire simgesinden görüntülenen fare sayısına karşılık gelen bir ila beş arasında bir sayı seçin. ROI'leri tanımlamak için, farenin karın boşluğundaki lüminesans sinyalinin sinyal alanını daire içine alın ve ardından ROI'nin ölçümlerini keyfi bir radyans birimi olarak tıklayın. Arka plan için ek bir ROI dairesi ekleyin.Enjeksiyondan dört hafta sonra, difüz lüminesans görüntüleme tomografisi (DLIT) gerçekleştirmek için, IVIS'i başlattıktan sonra Imaging Wizard, Bioluminescence seçeneklerini belirleyin ve Next'e tıklayın. DLIT seçeneğini belirleyin ve Next'e tıklayın. Firefly Probes seçeneğini belirleyin ve Next'e tıklayın.Görüntü Konusu için Mouse, Pozlama Parametresi için Auto, Görüş Alanı için C-13 Centimeter ve Konu Tipi olarak 0.5 Centimeter seçeneğini belirleyin ve Next düğmesine tıklayın. Ardından görüntülemeyi başlatmak için Acquire düğmesine tıklayın. Bir görüntü elde ettikten sonra, Analyze sekmesindeki DLIT 3D Reconstruction sekmesini seçin ve 3D rekonstrüksiyon görüntüsünü oluşturmak için Reconstruct düğmesine tıklayın.Araçlar (Tools) ve 3D Animasyon (3D Animation) seçeneklerine tıklayın. Ardından, 3D Animasyon penceresinde, Y-Ekseninde Saat Yönünün Tersine Döndür (Spin CCW on Y-Axis) seçeneğini belirleyin. Dosyayı mov formatında kaydetmek için Kaydet (Record) ve Sakla (Save) butonlarına tıklayın.Ex vivo floresan görüntüleme yapmak için, metin protokolüne uygun olarak farelerden karaciğerleri toplayıp diseke ettikten sonra, IVIS kullanarak her bir tümör kolonisi için floresan yoğunluklarını ölçün. Fluorescence, dört saniye Exposure Time, Medium Binning, F/Stop için 2, eksitasyon filtresi için 535 ve emisyon filtresi için 580 seçeneklerini belirleyin. Görüntülemeyi başlatmak için Acquire düğmesine tıklayın.Görüntü elde edildikten sonra, Araç Paleti'ndeki Görüntü penceresini bulun. ROI Araçları'na tıklayın ve daire simgesinden 1'i seçin. ROI'leri tanımlamak için görüntü üzerindeki münferit tümör kolonilerinin sinyal alanlarını daire içine alın.Arka plan için ek bir ROI çemberi belirleyin ve ardından radyansın keyfi bir birimi olarak ROI Ölçümleri'ne tıklayın. Arka plan için ek bir ROI çemberi daha belirleyin. Son olarak, metin protokolüne göre hesaplamaları gerçekleştirin.Burada biyolüminesans ile gösterildiği üzere, dalak enjeksiyonundan üç hafta sonra, HCT116 L2T klonları P1 ve P2, O1 ve O2 klonlarına kıyasla daha yüksek bir tümör yüküne sahipti. Bu veriler, O1 ve O2 klonlarının oligometastatik hastalığı taklit edebildiğini, P1 ve P2'nin ise karaciğerin agresif ve yaygın metastatik kolonizasyonunu temsil ettiğini göstermiştir. Dalak enjeksiyonundan dört hafta sonra karaciğerin ex vivo floresans miktarının belirlenmesi, P1 ve P2'nin O1 ve O2 karaciğerlerine göre daha yüksek floresan yoğunluklarına sahip olduğunu doğrulamıştır. Tümör klonlarının floresan etiketlemesi, karaciğerdeki münferit metastatik kolonilerin sayısını ve boyutlarını belirlemiştir.Genel olarak, ex vivo floresan görüntüler makroskobik bulgularla tutarlıydı, ancak yüzeyin altında gizli kalan küçük koloniler floresan görüntüleme ile daha iyi tespit edildi. Burada gösterildiği gibi, her bir karaciğerdeki metastatik kolonilerin sayıları ve boyutları sayıldı ve ölçüldü; ayrıca her bir monoklon için her metastatik koloni üzerinde ex vivo floresan görüntüleme yapıldı. Bu grafiklerde gösterildiği üzere, P1'deki toplam metastaz sayısı P2, O1 ve O2'ye kıyasla daha yüksekti, buna karşın bireysel kolonilerin ortalama boyutu P2'de, P1, O1 ve O2'den daha büyüktü. Modelimiz, metastazın moleküler heterojenliği ile ilişkili yeni ikna genlerinin belirlenmesi için bir yaklaşım sunmaktadır.Bu genler, metastaz tedavisine yönelik yeni yaklaşımlar için hedef olarak kullanılabilir. Modelimiz, güncel geniş klinik veri tabanlarından ortaya çıkan ancak metastatik hastalık bağlamında henüz fonksiyonel olarak tanımlanmamış farklı protein kodlayan ve kodlamayan genlerin doğrulanması için de kullanılabilir. Genel olarak, hayvan cerrahisinin hassasiyeti nedeniyle bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır.Bununla birlikte, pratik yaparak kısa sürede iyi sonuçlar elde edilebilir. Bu prosedürü uygularken, hayvan cerrahisi kılavuzlarına uymayı, kanamayı dikkatle kontrol etmeyi ve tümör hücresi süspansiyonunun sızıntısını önlemeyi hatırlamak önemlidir.

advanced-animal-model-colorectal-metastasis-liver-imaging-techniques

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Çekum üzerine bir kanser hücre süspansiyonu çekal duvar subkutan tümörün bir parçasının veya transplantasyon içine enjeksiyon: İki teknikleri bu modeli kurmak için kullanılan olabilir. Bu model, kolorektal kanseri doğal bir ilerleme eğitim ve kolorektal kansere karşı yeni tedavi ajanları test için yararlıdır.

Kolorektal Kanser Ortotopik Fare Modeli

Bu makalede, farelerde ortotopik bioluminescent karaciğer tümörleri indüksiyon ve canlı tüm vücut lüminesans görüntüleme ile karaciğer sınırlı tümör büyümesini sonraki analiz için bir prosedür açıklanmıştır.

Murin Bioluminescent Karaciğer Tümör Modeli

Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Kemik Metastaz Modelleri

Bu videoda, kolorektal kanser hastadan türetilmiş ksenogreftlerin veya PDX'lerin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için kullanılan protokol açıklanmaktadır. Bu ksenogreft modelleri, insan karsinomlarının özelliklerini kısmen taklit eder ve invazyon ve metastaz dahil olmak üzere insan malignitelerinin kritik yönlerini anlar.

Spontan Metastaz Fare Modelleri: Ortototopik Olarak Enjekte Edilen Kolorektal Kanser Hücrelerinin Metastatik Potansiyelini İncelemek İçin Bir Platform

Karaciğer metastazlarının klinik öncesi bir sıçangil modeli, hemispleen enjeksiyon tekniği ile gerçekleştirilir.

Karaciğer metastazları Klinik öncesi fare modeli

Meme tümör hücrelerinin portal ven enjeksiyonu yoluyla murin karaciğerine iletilmesi için cerrahi bir prosedür geliştirilmiştir. Bu model, tümör hücresi ekstravazasyonu, tohumlama, sağkalım ve karaciğerde metastatik büyüme dahil olmak üzere tamamen immün yetkin bir konakta karaciğer metastazının geç aşamalarının araştırılmasına izin verir.

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu hücrelerinin intra-vesically instilling veya intra-rektal enjekte kolorektal kanser hücreleri olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine tarafından hasta türeyen ortootopik xenograft modellerinin oluşturulması açıklanmaktadır immüneksikliği (NOD/SCıD) primer tümör büyümesi için fareler ve lenf nodu stromal hücrelerin etkisi altında spontan metastaz, hangi insan metastatik hastalıkların ilerlemesini taklit.

Insan Üromotorial Hücre Karsinomu ve kolorektal kanser tümörü büyüme ve spontan Metasrik için hasta türevi Ortootopik xenograft modelleri

Klinik olarak ilgili kolorektal kanser karaciğer metastazları (CRLM) tümör modeli ve karaciğer iskemi reperfüzyonunun (I/R) tümör büyümesi ve metastazdaki etkisini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu model daha iyi karaciğer metastatik büyüme cerrahi kaynaklı promosyon altında yatan mekanizmaları anlamak için yardımcı olabilir.

İskemi Reperfüzyon Hasarı Ayarında Metastatik Karaciğer Tümörlerinin Murine Modeli

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Kolorektal kanser (KRK) organoidlerinin portal ven enjeksiyonu stroma bakımından zengin karaciğer metastazı oluşturur. CRC hepatik metastazının bu fare modeli, tümör-stroma etkileşimlerini incelemek ve adeno ilişkili virüs aracılı gen terapileri gibi yeni stroma yönelimli terapötikler geliştirmek için yararlı bir araçtır.

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Keşfedin, kolorektal kanserden kaynaklanan metastatik tümör klonlarının karaciğer kolonizasyonunu modellemek için geliştirilen ileri hayvan modelini. Bu yöntem, metastatik hastalığın heterojenliğini yakalayarak oligometastatik ve polimetastatik hastalıkla ilişkili genleri tespit etme olanağı sunar.

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Daha fazla video keşfet