İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Bu yaklaşımın genel amacı, kolorektal kanserlerin oluşturduğu metastatik tümör klonlarının karaciğer kolonizasyonunu modellemek ve bu modeli karaciğer metastazlarının teşhis ve tedavisini geliştirmek için kullanmaktır. Klinik gözlemler, metastatik hastalığın heterojenliğini göstermektedir. Modelimiz, oligometastatik ve polimetastatik hastalıkla ilişkili genleri tespit etmek için bu heterojenliği yakalama imkanı sağlamaktadır.

Ve bu bilgiyi, metastazın erken teşhisinin ve tedavisinin geliştirilmesi için kullanmak. Tekniğimizin temel avantajı, kolorektal kanserli hastalardan türetilmiş çift etiketli monoklonal hücre hatları kullanmamız ve karaciğer metastazlarının gelişimini hem in vivo hem de ex vivo gözlemleyebilmemizdir. Bu tekniğin doğurguları, metastatik hastalık tedavisine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem, metastatik lezyon sayılarının kantitatif tahmini ve her bir lezyonun büyüme kinetiği ile herhangi bir potansiyel ilacı test etme imkanı sağlar. Metin protokolüne uygun olarak lusiferaz tdTomato işaretli HCT116 hücrelerini oluşturduktan ve besiyerini, reaktifleri ve cihazları hazırladıktan sonra, transfekte edilmiş hücreleri 96 kuyucuklu plakalarda, her kuyucuk için aşağıdaki yoğunluklarda, üç tekrar halinde ekimleyin. Hücrelerin beş saatlik inkübasyonunun ardından, masaüstündeki görüntüleme yazılımını başlatarak bir IVIS sistemi aracılığıyla tdTomato floresan yoğunluklarını ölçün.

Görüntüleme süresini, orta düzey binning'i, F/Stop için iki, eksitasyon filtresi için 535 ve emisyon filtresi için 580 değerlerini başlatmak için Initialize düğmesine tıklayın. 96 kuyucuklu plakayı görüntüleme istasyonuna yerleştirin ve görüntülemeyi başlatmak için Acquire'a tıklayın. Görüntü elde edildikten sonra Araç Paleti'nde (Tool Palette) ROI araçlarına (ROI tools) tıklayın ve yarık simgesinden 12x8'i seçin.

96 kuyucuklu plaka görüntüsündeki sinyal alanını kapsayacak şekilde 12x8 yarık oluşturun ve Ölçümler sekmesine tıklayın. Saniyede, steradyan başına, santimetrekare başına foton birimindeki ROI ölçümleri tablosunun bulunduğu bir pencere gözlemleyin. Hücreler, dalak enjeksiyonundan yaklaşık bir saat önce yüzde 70 ila 80 konflüense ulaştığında, onları ayrıştırmak için hücrelere yüzde 0,05 tripsin ve 0,53 milimolar EDTA ekleyin.

Hücreleri üç ila beş dakika inkübe ettikten sonra, tripsini nötralize etmek için eşit hacimde C-DMEM kullanın. Topaklanmayı önlemek için kültürleri iyice pipetleyin, ardından hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayıcı kullanın. Süspansiyon halindeki hücreleri, topaklanmayı önlemek için iyice pipetleyerek, 1x DBPS içinde 100 µL başına 1,2 ila 2 x 10⁶ hücre konsantrasyonunda dondurun.

Ardından, hücreleri enjeksiyona kadar buz üzerinde tutun ve ara ara tüp içerisinde tekrar süspande edin. Altı ila sekiz haftalık dişi atimik nude fareye metin protokolüne uygun olarak analjezik uygulayıp anestezi yaptıktan sonra, dalak bölgesini sol yan tarafta deri üzerinden dışarıdan görülen mor alan olarak belirleyin ve organun hemen üzerindeki deriye sekiz milimetrelik bir sol yan kesi yapın. Daha sonra, karın duvarını yukarı kaldırarak küçük bir insizyon gerçekleştirin.

İç organların insizyon bölgesinden uzaklaşması için abdominal boşluğa hava girmesine izin verin. Ardından, abdominal duvar insizyonunu yaklaşık beş milimetreye kadar genişletin. Enjeksiyon için gösterilen adımlar prosedür için kritiktir.

Enjeksiyon sırasında tümör hücrelerinin sızması, hepatik dışı metastazlara yol açabilir. Portal ven trombozunu önlemek için enjeksiyon, 1,5 milyon hücreyi geçmeyecek şekilde, 30 ila 60 saniye boyunca yavaşça gerçekleştirilmelidir. Kesi çevresine pamuklu çubukla nazikçe baskı uygulayarak dalak açığa çıkarılmalıdır.

Gerektiğinde, dalağa zarar vermemek amacıyla, görünürlüğü artırmak için pankreas yağı nazikçe manipüle edilebilir. 27 gauge iğneye sahip bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, 30 ila 60 saniyelik bir süre içinde, açıkta kalan dalak ucuna 100 µL hücre enjekte edin. Enjeksiyon sonunda, enjekte edilen hücre süspansiyonunun sızmasını önlemek için iğneyi çıkarmadan önce dalağa bir mikro klips yerleştirin ve klipsi beş dakika boyunca orada bırakın.

Enjeksiyondan beş dakika sonra, hemostaz için el tipi bir koter cihazı kullanarak splenektomi gerçekleştirin. Damarların proksimal tarafını bitişik yağ dokusuyla birlikte önceden koagüle ederek anterior taraftaki splenik hilumdan başlayın. Enjeksiyon bölgesinde splenik kanama meydana gelebilir.

Tümör hücresi sızıntısını önlemek ve splenik kanamayı kontrol etmek için dalağa mikro klips uygulanır. Hemostaz yöntemleri; koterizasyon, üç ila beş dakika boyunca basınç uygulamak ve gerekirse sütur ligasyonunu içerebilir. Karın duvarını 5.0 emilebilir örgü sütur ve tek bir yatay dikiş kullanarak kapatın.

Ardından, cildi kapatmak için 4.0 emilmez monofilaman sütür kullanarak tek bir yatay dikiş atın. Metin protokolüne uygun olarak, operasyon sonrası hayvanı takip edin. Biyolüminesans görüntüleme yapmak için, fareleri metin protokolüne göre anestezi altına aldıktan sonra, hayvanlara intraperitoneal olarak önceden hazırlanmış 150 µL ateş böceği lusiferin enjekte edin.

Fareleri, yan yana olan hayvanlara sinyal geçişini en aza indirmek için aralarına ara parçalar yerleştirerek sırtüstü pozisyonda bir IVIS cihazına yerleştirin. Lusiferin enjeksiyonundan üç dakika sonra, IVIS cihazını başlatıp lüminesan seçeneğini, bir saniyelik pozlama süresini ve orta düzey binning ayarını seçin. Görüntülemenin lusiferin enjeksiyonundan tam üç dakika sonra tutarlı bir şekilde gerçekleştirildiğinden emin olarak görüntülemeyi başlatmak için Acquire düğmesine tıklayın.

Görüntü alındıktan, bir görüntü penceresi ve araç paleti göründükten sonra, ROI araçlarına tıklayın ve daire simgesinden görüntülenen fare sayısına karşılık gelen bir ila beş arasında bir sayı seçin. ROI'leri tanımlamak için, farenin karın boşluğundaki lüminesans sinyalinin sinyal alanını daire içine alın ve ardından ROI'nin ölçümlerini keyfi bir radyans birimi olarak tıklayın. Arka plan için ek bir ROI dairesi ekleyin.

Enjeksiyondan dört hafta sonra, difüz lüminesans görüntüleme tomografisi (DLIT) gerçekleştirmek için, IVIS'i başlattıktan sonra Imaging Wizard, Bioluminescence seçeneklerini belirleyin ve Next'e tıklayın. DLIT seçeneğini belirleyin ve Next'e tıklayın. Firefly Probes seçeneğini belirleyin ve Next'e tıklayın.

Görüntü Konusu için Mouse, Pozlama Parametresi için Auto, Görüş Alanı için C-13 Centimeter ve Konu Tipi olarak 0.5 Centimeter seçeneğini belirleyin ve Next düğmesine tıklayın. Ardından görüntülemeyi başlatmak için Acquire düğmesine tıklayın. Bir görüntü elde ettikten sonra, Analyze sekmesindeki DLIT 3D Reconstruction sekmesini seçin ve 3D rekonstrüksiyon görüntüsünü oluşturmak için Reconstruct düğmesine tıklayın.

Araçlar (Tools) ve 3D Animasyon (3D Animation) seçeneklerine tıklayın. Ardından, 3D Animasyon penceresinde, Y-Ekseninde Saat Yönünün Tersine Döndür (Spin CCW on Y-Axis) seçeneğini belirleyin. Dosyayı mov formatında kaydetmek için Kaydet (Record) ve Sakla (Save) butonlarına tıklayın.

Ex vivo floresan görüntüleme yapmak için, metin protokolüne uygun olarak farelerden karaciğerleri toplayıp diseke ettikten sonra, IVIS kullanarak her bir tümör kolonisi için floresan yoğunluklarını ölçün. Fluorescence, dört saniye Exposure Time, Medium Binning, F/Stop için 2, eksitasyon filtresi için 535 ve emisyon filtresi için 580 seçeneklerini belirleyin. Görüntülemeyi başlatmak için Acquire düğmesine tıklayın.

Görüntü elde edildikten sonra, Araç Paleti'ndeki Görüntü penceresini bulun. ROI Araçları'na tıklayın ve daire simgesinden 1'i seçin. ROI'leri tanımlamak için görüntü üzerindeki münferit tümör kolonilerinin sinyal alanlarını daire içine alın.

Arka plan için ek bir ROI çemberi belirleyin ve ardından radyansın keyfi bir birimi olarak ROI Ölçümleri'ne tıklayın. Arka plan için ek bir ROI çemberi daha belirleyin. Son olarak, metin protokolüne göre hesaplamaları gerçekleştirin.

Burada biyolüminesans ile gösterildiği üzere, dalak enjeksiyonundan üç hafta sonra, HCT116 L2T klonları P1 ve P2, O1 ve O2 klonlarına kıyasla daha yüksek bir tümör yüküne sahipti. Bu veriler, O1 ve O2 klonlarının oligometastatik hastalığı taklit edebildiğini, P1 ve P2'nin ise karaciğerin agresif ve yaygın metastatik kolonizasyonunu temsil ettiğini göstermiştir. Dalak enjeksiyonundan dört hafta sonra karaciğerin ex vivo floresans miktarının belirlenmesi, P1 ve P2'nin O1 ve O2 karaciğerlerine göre daha yüksek floresan yoğunluklarına sahip olduğunu doğrulamıştır. Tümör klonlarının floresan etiketlemesi, karaciğerdeki münferit metastatik kolonilerin sayısını ve boyutlarını belirlemiştir.

Genel olarak, ex vivo floresan görüntüler makroskobik bulgularla tutarlıydı, ancak yüzeyin altında gizli kalan küçük koloniler floresan görüntüleme ile daha iyi tespit edildi. Burada gösterildiği gibi, her bir karaciğerdeki metastatik kolonilerin sayıları ve boyutları sayıldı ve ölçüldü; ayrıca her bir monoklon için her metastatik koloni üzerinde ex vivo floresan görüntüleme yapıldı. Bu grafiklerde gösterildiği üzere, P1'deki toplam metastaz sayısı P2, O1 ve O2'ye kıyasla daha yüksekti, buna karşın bireysel kolonilerin ortalama boyutu P2'de, P1, O1 ve O2'den daha büyüktü. Modelimiz, metastazın moleküler heterojenliği ile ilişkili yeni ikna genlerinin belirlenmesi için bir yaklaşım sunmaktadır.

Bu genler, metastaz tedavisine yönelik yeni yaklaşımlar için hedef olarak kullanılabilir. Modelimiz, güncel geniş klinik veri tabanlarından ortaya çıkan ancak metastatik hastalık bağlamında henüz fonksiyonel olarak tanımlanmamış farklı protein kodlayan ve kodlamayan genlerin doğrulanması için de kullanılabilir. Genel olarak, hayvan cerrahisinin hassasiyeti nedeniyle bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır.

Bununla birlikte, pratik yaparak kısa sürede iyi sonuçlar elde edilebilir. Bu prosedürü uygularken, hayvan cerrahisi kılavuzlarına uymayı, kanamayı dikkatle kontrol etmeyi ve tümör hücresi süspansiyonunun sızıntısını önlemeyi hatırlamak önemlidir.