Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Bu yöntemin genel amacı, ince tabaka kromatografisi ve HPLC kullanarak nötrofil hücre dışı tuzakların salınması sırasında nötrofillerin lipid bileşimindeki değişiklikleri araştırmaktır. Bu yöntem, nötrofil hücre dışı tuzakların oluşumunda veya kısaca NET oluşumunda rol oynayan mekanizmalar hakkında daha ayrıntılı bilgi edinmek için kullanılabilir. Bu prosedürün temel avantajı, takip etmesi kolay bir protokol kullanarak lipitlerin nötrofillerin genel işlevindeki rolü hakkında bilgi sağlamasıdır.

İnsan kanından elde edilen hücrelerin izolasyonu, laboratuvarımızın eski bir doktora öğrencisi olan Ariane Neumann tarafından gösterilecektir. Ve ona Friederike Reuner yardım edecek. Lipid analizi için hücrelerin hazırlanması, laboratuvarımda doktora sonrası Graham Brogden ve biyokimya programında yüksek lisans öğrencisi olan Diab Husein tarafından gösterilecektir.

İnsan kanından elde edilen nötrofilleri izole etmek için, yaklaşık 20 mL kanı, karıştırmadan bir alevin yakınında 20 mL sodyum diatrizoat / dekstran çözeltisi üzerine katmanlayın. Frenleme yapmadan 470 kez g'de 30 dakika santrifüjleyin. Kan fazını çözeltideki yoğunluk derecesi ile karıştırmamak çok önemlidir.

Santrifüjleme aşamasından sonra, hücrelerin kontaminasyonunu veya spesifik olmayan aktivasyonunu önlemek için mononükleer hücrelerin dikkatlice çıkarılması gerekir. Mononükleer hücreleri ve sarımsı plazma tabakasını çıkarın. Polimorfonükleer hücreyi veya PMN fazını 50 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve 1X fosfat tamponlu salin ile 50 mL'ye kadar doldurun.

Numuneyi frenleme ile 470 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve eritrositleri parçalamak için peleti 5 mL steril suda beş saniye boyunca tekrar süspanse edin. Tüpü hemen 1X PBS ile 50 mL'ye kadar doldurun ve numuneyi santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet beyaz olmalıdır. Hala kırmızıysa, bu adımları tekrarlayın. Daha sonra peleti 1000 mikrolitre Roswell Park Memorial Institute veya RPMI ortamında yeniden askıya alın.

Tripan Blue boyama ve ışık mikroskobu altında bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın. RPMI'de mL başına iki milyon hücre konsantrasyonunda bir hücre süspansiyonu hazırlayın. 20 mL kandan yaklaşık 25 milyon nötrofil toplanabilir.

Lipid analizi için nötrofilleri farmakolojik olarak tedavi etmek için hazırlanan hücrelerin 15 milyonunu kullanın. Numuneleri reaksiyon tüplerinde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat inkübe edin. Numunelerin santrifüjlenmesini takiben, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 300 mikrolitre HBSS'de yeniden süspanse edin.

Numuneyi aynı parametreleri kullanarak tekrar santrifüjledikten sonra, hücre peletini 1 mL 1: 1 kloroform: metanol çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Ardından, numuneyi 1 mL'lik bir şırınganın içine ve dışına 10 kez iterek yeniden süspanse edilmiş peleti 26 gauge kanül ile homojenize edin. Lipitleri insan periferik kanından türetilen nötrofillerden izole etmek için hazırlanan nötrofilleri alın ve buzun üzerine yerleştirin.

Nötrofilleri PTFE contalı 15 mL vidalı kapaklı bir cam tüpe pipetleyin ve bir dakika çalkalayarak homojen hale getirin. Daha sonra 2 mL metanol ve ardından bir dakika sonra 1 mL kloroform ekleyin. Bir dakika daha çalkaladıktan sonra, cam tüpleri oda sıcaklığında ve 50 rpm'de 30 dakika döndürün.

Daha sonra, çözeltiyi 10 dakika boyunca 7 santigrat derecede ve 1.952 kez g'de santrifüjleyerek protein fraksiyonunu peletleyin. Süpernatanı, protein içeren peleti geride bırakarak 15 mL'lik yeni bir cam vidalı kapaklı tüpe dikkatlice boşaltın. Gelecekteki miktar tayini için peleti 20 santigrat derecede saklayın.

1 mL kloroform ekleyin ve bir dakika bekleyin. Ardından, 1 mL çift damıtılmış su ekleyin ve numune ile birlikte cam vidalı kapağı 30 saniye ters çevirin. Numuneyi daha önce olduğu gibi santrifüjledikten sonra, üst fazı bulanık tabaka dahil değil, en az ona kadar çıkarın ve atın.

Numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcıda 60 santigrat derecede kurutun ve gerekli olana kadar 20 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, ilgili cam haznede her çözeltiden 5 mL'ye kadar doldurun. Her haznedeki çalışma hızını artırmak için herhangi bir filtre kağıdı ekleyin.

İlk çalışan çözeltide 20x10 cm'lik bir HPTLC silika jel 60 cam plakayı önceden inkübe edin. Çalışan çözelti plakanın üst kısmına ulaştığında, 110 santigrat derecede 10 dakika kurutun. Daha önce bir vakum yoğunlaştırıcı ile kurutulduktan sonra elde edilen lipit peletini istenen hacimde 1: 1 kloroform: metanol çözeltisi içinde çözün ve çözünmesi için 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Ardından, istenen sayıda numune ve en az bir standart için yükleme noktalarını işaretlemek için bir cetvel ve yumuşak bir kalem kullanın. Koşu mesafesini ilk koşu çözümü için yaklaşık 4 cm ve ikinci koşu çözümü için yaklaşık 6 cm olarak işaretleyin. Numuneleri yüklemek için, her yeni numuneyi yüklemeden önce 10 mikrolitrelik şırıngayı 1: 1 kloroform: metanol içinde üç kez yıkayın.

Numuneyi mümkün olduğunca küçük bir alana konsantre etmeye çalışarak her numuneden 10 mikrolitre damla damla yükleyin. Plakayı, çalışan çözelti bir ile ilk hazneye dikey olarak yerleştirin. Düzgün bir migrasyon hızı elde etmek için plakanın cam haznenin duvarına paralel olduğundan emin olun.

Lipitlerin verimli bir şekilde ayrılmasını sağlamak için plakaların cam odaların arka duvarına paralel olarak yerleştirilmesine ve solvent cephelerinin çok fazla ilerlememesine dikkat edin. Çözücü hattı ilk işarete ulaştığında, plakayı çıkarın, kurutun ve ikinci çözeltiye yerleştirin. İkinci ve üçüncü çalışan çözümler için benzer adımları yineleyin.

Çözücü cephesi plakanın üst kısmına ulaşana kadar plakayı çözelti içinde bırakın. Ardından plakayı çıkarın ve oda sıcaklığında bir dakika kurutun. Plakayı yedi saniye boyunca bakır sülfat çözeltisine yerleştirin.

Plakayı iyice kuruduktan sonra 170 derecelik fırında yedi dakika pişirin. Plakayı fırından çıkarın ve soğumaya bırakın. HPLC'yi gerçekleştirmek için, sütunu cihazdaki bir koruma kartuşuna takın ve 32 santigrat dereceye ısıtın.

Dakikada 1 mL akış hızında ve 65 bar'da mobil faz olarak metanol kullanın. Her numunedeki kolesterol miktarını ölçmek için UV dedektörünü 202 nanometrede ölçüm yapacak şekilde ayarlayın. Numuneleri analiz etmeden önce HPLC makinesini iyice yıkayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi bir kolesterol standart eğrisi oluşturun.

Son olarak, numuneleri HPLC cihazına yüklemeden önce 500 mikrolitre 1: 1 kloroform: metanol içinde kehribar renkli 1.5 mL cam şişelerde vidalı kırmızı PTFE / beyaz silikon kapaklı olarak yeniden askıya alın. Burada gösterilen, bir HPTLC plakasındaki nötrofillerin lipid profilidir. Lipitler, migrasyon mesafeleri standartla karşılaştırılarak tanımlanabilir.

Ayrıca iki büyük tepe noktası gösteren bir HPLC kromatogramı da gösterilmiştir. İki dakikadan hemen önceki ilk zirve kloroformdur. Beş dakikadaki ikinci büyük zirve kolesteroldür.

Burada HPLC ve HPTLC tarafından belirlenen kolesterol standart eğrileri gösterilmiştir. HPLC ile elde edilen standart eğri, HPTLC standart eğrisine kıyasla daha geniş bir konsantrasyon aralığında doğrusaldır. Bu videoyu izledikten sonra, insan kanından elde edilen nötrofillerin nasıl izole edileceğini ve ardından lipit bileşimlerini nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, ellerinizi tehlikeli kloroform: metanol maruziyetine karşı korumak için nitril eldiven giymeyi ve ayrıca bir davlumbaz altında çalışmayı unutmamak önemlidir. Gelecekteki deneyler, NET oluşumunda yer alan mekanizmalar ve hala tam olarak anlaşılmamış olan genel nötrofil fonksiyonları hakkında daha fazla bilgi sağlayacaktır. Birincil insan kanından elde edilen hücrelerle çalışmanın, insan patojenlerine riske maruz kalmaktan kaçınmak için ilgili bir biyo-güvenlik laboratuvarında çalışmak gibi uygun güvenlik önlemlerinin yanı sıra etik izin gerektirdiğini unutmayın.

Son olarak, çalışmamızın amacı, doğuştan gelen bağışıklık sistemine dayalı bir enfeksiyona karşı yeni terapötik hedefler bulmaktır ve özellikle lipit bileşimi, nötrofilin bir enfeksiyona karşı neden antimikrobiyal davrandığını anlamamıza yardımcı olacağı için bizim için çok ilginçtir.