Name: Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Keşfedin, modifiye kromatin immunopresipitasyonu ve DNA süperkıvrım deneyleriyle insan hücrelerinde site-spesifik DNA hasarına mimari proteinlerin bağlanmasını ve topolojik değişiklikleri nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem kanser tedavisi için yeni farmakolojik hedefler keşfetmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yararlı tartışmalar için Vasquez laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma [Kmv için CA097175, CA093279] Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü [RP101501] ve. açık erişim ücret karşılığında Fon: National Institutes Sağlık / Ulusal Kanser Enstitüsü [KMV için CA093279].

Plazmid substratlar üzerinde TFO yönelik ICLs hazırlanması 1. <ol><li> 10,11, DNA tripleks bağlanma tamponu [% 50 gliserol, 10 mM Tris (pH 7.6), 10 mM MgC 8 ul psoralen-konjuge TFO AG30 (5 ug plazmid DNA, iyi bir başlangıç noktasıdır) plazmid pSupFG1 eşit molar miktarlarda inkübe 2] ve amber rengi bir tüp içinde 40 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar dH 2 O. Yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın. 12 saat boyunca 37 ° C su banyosunda reaksiyon inkübe edin. </li><li> Tam güç çıkışı sağlamak için UVA lamba ısıtın. parafin filmde tripleks reaksiyonu yerleştirin ve UVA (365 nM) lambası altında buz üzerinde parafin filmi yerleştirin. lamba ve tepki arasındaki bir Mylar filtre yerleştirin. </li><li> UVA 1.8 J / cm2 toplam doz için ışın tedavisi. Daha fazla kullanım için 4 ° C&#39;de örnekleri saklayın. Dikkat: UVA ışınlama ile uygun koruyucu gözlük ve giysiler giyin. </li><li> RE yukarıda hazırlanan plazmid 200 ng Linearizeüreticisi kullanılarak 20 ul toplam hacmi sınırlandırması enzim Eko R1 10x tampon verilir. Isıtma 65 ° C&#39;de 20 dakika süreyle enzim denatüre. 10,000 x g&#39;de 10 dakika süre ile numuneler spin ve 4 ° C&#39;de depolayın. </li><li> 50x alkalin tampon [1.5 M NaOH, 50 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA)] hazırlanır. 50 ml dH 2 O ile agaroz 0.5 mg ekle agaroz çözülür ve 50 ° C su banyosunda yerleştirmek için kaynatın. </li><li> çözündürüldü agaroz ısılar 50 ° C sonra, 50x alkali 1 ml tampon eklemek, karıştırmak ve daha sonra jel tepsiye jel dökün. Jel kullanmadan önce oda sıcaklığında katılaşmaya için zaman tanıyın. </li><li> Doğrusal hale getirilen DNA örneğin 20 ul 0.5 M EDTA 4 ul ilave edilir ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 6x alkali jel yükleme tamponu ekleyin (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, (w /% 18 hacim), yüksek molekül ağırlıklı polisakkarid,% 0.06 bromokresol dH 2 O) örnekleri ve 1 kb DNA merdiveni. NOT: 6x alkali jel yükleme tamponu kullanılması önemlidir, tartışma bakın. </li><li> Yük soğuk oda jel üzerine örnekleri ve cm başına 3.2 volt gecede 1x alkali tampon (12-16 saat) çalıştırın. Örnekler jel girdikten sonra, yüzer önlemek için jel üstünde bir cam plaka yerleştirin. </li><li> nötralizasyon tamponu [1 M Tris-Cl (pH 7.6), 1.5 M NaCI, 3 M sodyum asetat (pH 5.2)], oda sıcaklığında 45 dakika boyunca jel ıslatılmasıyla, örnekleri nötrleştirmek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat süre ile 50 ml su içinde% 1, etidyum bromür (EtBr) 4 ul DNA jel leke. 15 dakika boyunca su ile destain. Bir görüntüleme sistemi ile DNA görselleştirmek. Dikkat: EtBr güçlü bir mutajen ve deri yoluyla absorbe edilebilir. EtBr ile doğrudan temastan kaçının. </li></ol> İnsan hücrelerinde TFO yönelik ICL-içeren plazmidlerin 2. transfeksiyonu ve immüno-çökeltme <ol><li> Plaka 400,000 memeli hücreleri (örneğin, U2OS ODulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 60 mm tabak başına steosarcoma hücre) 24 saat transfeksiyondan önce antibiyotikler olmadan,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece boyunca inkübe hücreleri. </li><li> Bir su banyosu içinde 37 ° C transfeksiyon sıcak büyüme ortamı ve fosfat tamponlu tuz (PBS) önce. Oda sıcaklığına kadar transfeksiyon reaktifi ısıtın. </li><li> 10 dk için 500 1 x büyüme ortamı ul (karışım 1) ve 2 ayrı 14 ml 1 x büyüme ortamı (karışım 2) 500 ul plazmidler ICL içeren TFO yönelik yuvarlak tabanlı tüp ug transfeksiyon reaktifi 30 ul inkübe oda sıcaklığı. </li><li> 2, mix yukarı ve aşağı pipetleme iyice karıştırın karışımı 1 ekleyin. Oda sıcaklığında 25-30 dakika inkübe edilir. </li><li> sıcak PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Hücrelerin plaka boyunca eşit dağıtarak damla damla moda transfeksiyon karışımı ekleyin. plakasına büyüme ortamının 1 ml ilave edilir ve 2 ml nihai hacim getirmek. biz mixll. 4 saat% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör kültür plakaları yerleştirin. </li><li> % 10 FBS ile takviye edilmiş 3 mi büyüme ortamı ile değiştirin ve 16 saat daha inkübe edilir. Antibiyotik kullanmayın. </li><li> yaklaşık olarak% 1 bir son konsantrasyona plaka başına% 37 taze formaldehit 80 ul hücreleri tedavi ve ışıksız ortamda, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Dikkat: Formaldehit toksik ve güvenlik talimatlarına göre ele alınmalıdır. Formaldehit maruziyeti deri, göz ve solunum yollarında zarar verebilir. </li><li> Plaka başına (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) soğutulmuş glisin 300 ul ilave edildikten ve 5 dakika için inkübe edilmesi ile formaldehid çapraz bağlanmasını Quench. Ortamı çıkarın ve soğuk PBS ile iki kez yıkanır ve daha sonra, bir mikrosantrifüj tüpü içine soğutulmuş (4 ° C) PBS, 1 ml kazınarak hücreleri toplamak. her zaman buz üzerinde örnekleri tutun. </li><li> Ve 5 dakika 4 ° C &#39;de santrifüj ile hücre pelletleri hazırlamakBir masa buzdolabında santrifüj kullanılarak 13.400 xg t. Pipet dışarı Süpernatantı ve buz üzerinde hücre pelet yerleştirin. </li><li> Homojen olarak 1 ml soğutulmuş (4 ° C) tampon A (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) pelet tekrar süspansiyon ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Tersine tüp bazen karıştırın. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız). </li><li> Homojen soğutulmuş 1 ml pelet (4 ° C) tampon B (ticari olarak temin edilebilen kitler temin) tekrar süspansiyon ve çevrilmesi ile ara sıra karıştırma ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile Pelet hücreleri (yukarıdaki adım 2.9). </li><li> Tampon B soğutulmuş 200 ul içinde tekrar hücrelerin tekrar micrococcal nükleaz (MNase) 2 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. tüp hafifçe vurarak bazen tepkisini karıştırın. Buz üzerinde tüp yerleştirilmesi ve 40 mM EDTA eklenerek MNase reaksiyonu durdurun. Pelet hücreleri daha önce olduğu gibi (yukarıdaki adım 2.9 bakınız). </li><li> 100 ul 1x kromatin immunopr yeniden süspanse hücreleriproteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş ecipitation tamponu (ChIP) tamponu (piyasada mevcut kitler verilir). </li><li> ince duvarlı mikrofüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin. buz üzerinde 20 sn inkübasyon tarafından takip 20 saniye boyunca su banyosu sonikatör bunları yüzen tarafından örnekleri sonikasyon. Tekrarlayın sonikasyon ~ 800-1,200 bp parçaları üretmek için 9 kez yineleyin. <ol><li> sonike numunelerin 20 ul için vorteks yoluyla iyice 3 ul 5 M NaCl ve 1 ul RNaz A karışımını ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Daha sonra, 2 ul Proteinaz K ekleyip 65 ° C&#39;de 2 saat inkübe edilir. PCR saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri arındırın. % 1 agaroz jel örnekleri çalıştırın ve EtBr ile görselleştirmek. NOT: Elde edilen DNA maksimum yoğunluğu veya 1000 bp altında olmalıdır. </li></ol></li><li> Üç ayrı tüplerde, önceden soğutulmuş bir silikonlu bir tüp içinde lizat 30 ul ve ilave proteaz inhibitörleri ile soğutulmuş 1x ChIP tamponu 70 ul ekle. 1 u eklemeilgili borular anti-immünoglobulin G (IgG) (pozitif kontrol olarak), anti-histon H3, ya da anti-HMGB1 antikor örn. sürekli dönmesi ile soğuk bir odada gece boyunca inkübe edin. </li><li> homojen soğuk odada süspanse protein G boncuk. tüp başına protein G boncuk 4 ul ekleyin ve rotasyon ile soğuk bir odada bir 2-4 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> manyetik raf kullanarak, boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak. pelet proteaz inhibitör kokteyli ile karıştırılmış 200 ul 1x ChIP tamponu ilave edin ve rotasyon ile soğuk bir odada 5 dakika yıkayın. iki kez yıkayın tekrarlayın. </li><li> yüksek tuzlu 1x ChIP tamponu (70 mM NaCl ihtiva eden) sahip bir ek yıkama yapın. </li><li> (Ticari olarak temin edilebilir kitler temin) 160 ul yıkama tamponu ile pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca rotasyon ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> boncuk pelet ve taze bir tüp içinde süpernatant toplamak. 5 M NaCl 6 ul proteinaz K 2 ul ekleyin ve 65 ° C&#39;de gece boyunca inkübe° C. </li><li> Bir PCR ürünü saflaştırma kiti kullanılarak DNA arındırmak ve 50 ul dH 2 O kullanılarak DNA Zehir </li><li> PCR ilgi bölgesi (ler) primer setleri kullanılarak 16 reaksiyonları gerçekleştirmek ve EtBr ile boyanmış bir% 1 agaroz jeli üzerinde ürün çözümler. </li></ol> 3. süperburulma Testi ve 2 boyutlu Agaroz Jel Elektroforez <ol><li> DNA tamir sentez tamponu hazırlayın (45 mM Hepes-KOH, pH 7.8; 70 mM KCI, 7.4 mM MgCl2, 0.9 mM DTT, 0.4 mM EDTA, 2 mM ATP, 20 uM dNTP,% 3.4 gliserin ve 18 ug sığır serum albümini) . -80 ° C&#39;de saklayın. buz ve önceki üzerinde çözülme 40 mM phosphocreatine ve 2.5 ug kreatin fosfokinaz eklemek kullanmak için. </li><li> Oda sıcaklığında 10 x sarılma tamponu [500 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCI, 25 mM MgCI2, 1 mM EDTA] ve mağaza hazırlayın. </li><li> Tamamen 1x 1 ul Vaccinia Topoizomeraz I (5-15 U / ml) kullanılarak süper-plazmid pSupFG1 DNA 300 ng Linearize10 ul reaksiyon tampon maddesi sarılma. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe karışımı. </li><li> Buz üzerinde HeLa hücre içermeyen özü 24 çözülme. tamamen rahat plasmidler için, 25 ul HeLa hücresi serbest özütü ve DNA onarımı sentez tamponu ilave edin. İyice karıştırın. karışımı, Vaccinia topoizomeraz I ilave 1 ul ekleyin ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> sodyum dodesil sülfat (SDS) (% 1 son konsantrasyon) ve proteinaz-K (0.25 mg / ml son konsantrasyon) eklenerek reaksiyonlar sonlandırma. 2 saat boyunca 65 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1x Tris Borat EDTA (TBE) tamponu ile bir% 1 agaroz jeli Dökme. DNA yükleme boyası ekleyin ve en az 4 şerit dışında jel üzerine doğrudan tepkileri yükleyin. topoisomers çözmek için oda sıcaklığında 1 x TBE 2 V / cm (boyut 1) 8-10 st için jel üzerinde çalıştırıldı. Not: Tris bazı, 54 g ekleyerek dH 2 O 1 L 5x TBE stok çözelti hazırlayın. borik asit 27.5 g ve 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 mi. </li><li> 1x 2 L hazırlayın3 ug / ml miktarında klorokuin katılımının-fosfat TBE. 20 dakika için bu çözelti, 200 ml jel bekletin. alüminyum folyo ile jel tepsisi örtün. </li><li> İkinci boyutta jel Electrophorese için, saat yönünde moda, jele 90 ° çevirin ve pozitif ve negatif sarımları çözmek için 1x TBE içeren klorokin 2 V / cm 4-6 saat çalıştırın. </li><li> bir rocker 1 saat süreyle EtBr ile jel Leke. 15 dakika dH 2 O ile jel destain ve daha sonra bir görüntüleyici kullanarak topoisomers termal dağılımını görselleştirmek. </li></ol>

<ol><li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li>
<li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li>
<li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li>
<li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li>
<li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage%2C+DNA+repair%2C+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li>
<li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li>
<li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li>
<li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li>
<li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li>
<li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li>
<li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li>
<li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li>
<li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li>
<li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA%3A+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li>
<li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li>
<li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li>
<li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li>
<li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein%2FTATA+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li>
<li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V%28D%29J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li>
<li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li>
<li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li>
<li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li>
<li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li>
<li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li>
<li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li>
<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

TFO-yönlendirilmiş ICLs etkili bir şekilde oluşumuna iki önemli faktörlere bağlıdır: hedefine TFO bağlanması afinitesine bağlı olarak hedef DNA alt-tabaka ile TFO inkübasyon uygun tampon bileşenleri (örneğin, MgCI2) Birinci ve zaman (bağımlı dubleks ve konsantrasyonlar) kullanılan; ve ikinci, UVA uygun dozu (365 nm) ışınlama verimli psoralen çapraz bağlantılar oluşturmak için. Optimum tripleks oluşumu HPLC ya da jel saflaştırılmış TFOlar kullanılarak elde edilebilir. Tfo kirletici safsızlıklar daha f...

Üçlü-helikal bir yapı oluşturmak için 1-5 Hoogsteen-hidrojen bağlanması yoluyla bir dizi-spesifik şekilde oligonükleotid (TFOlar) bağlama dupleks DNA tripleks-oluşturan. Tripleks teknolojisi, transkripsiyon, DNA hasarı tamir ve gen hedefleme (referanslar 6-8 gözden) olarak biyomoleküler mekanizmalar, çeşitli sorgulamak için kullanılır olmuştur. TFOlar muhabiri plazmidler 9,10 site-spesifik zarar ikna etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Laboratuar ve diğerleri daha önce plazmid pSupFG1 5,10-12 ilgili supF genindeki bölgeye spesifik DNA kol içi çapraz bağlantılar (ICLs) ikna etmek için bir psoralen moleküle gergin bir TFO, AG30, kullandık. ICLs bu lezyonlar kovalent iki DNA ipliklerini çapraz gibi son derece sitotoksik olan ve unrepaired bırakılırsa, gen transkripsiyonunu bloke ve DNA replikasyonu makineleri 13,14 engelleyebilir. Çünkü bunların sitotoksik potansiyel ICL-uyarıcı maddeler tedavisinde kemoterapötik ilaçlar olarak kullanılmış olanKanser ve diğer hastalıkların 15. Bununla birlikte, insan hücrelerinde ICLs işleme ve tamir iyi anlaşılmamıştır. Bu nedenle, insan hücrelerinde ICLs işleme oluşumundaki mekanizmaların daha iyi anlaşılması ICL tabanlı kemoterapik rejimlerin etkinliğinin geliştirilmesi için yardımcı olabilir. TFO kaynaklı ICLs ve onarım ara DNA sarmalının önemli yapısal bozuklukların neden olma potansiyeli var. Bu tür bozulmalar kanonik B formu çift katlı DNA 16-20 daha yüksek afinite ile bozulmuş DNA&#39;ya bağlanan, mimari proteinleri muhtemel hedeflerdir. Burada, kromatin immunoprecipitation (ChIP) psoralen-çapraz plazmidler üzerinde deneyler yoluyla insan hücrelerinde ICLs ile son derece bol bir mimari protein dernek, HMGB1 okudu ve insan psoralen-çapraz plazmid DNA topolojisini modüle HMGB1 bir rol tespit kanser hücre lizatları. HMGB1 son derece bol ve yayg ifade non-onunkanonik B formu DNA 17-20 daha yüksek afinite ile hasar görmüş DNA ve alternatif olarak yapılandırılmış DNA alt tabakaları bağlanan sesi mimari proteini. HMGB1 örneğin transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı 16,21-23 gibi çeşitli DNA metabolik süreçlerde, yer almaktadır. Daha önce HMGB1 yüksek afiniteyle 20 ile in vitro TFO yönelik ICLs bağlanan olduğunu göstermiştir. Dahası, HMGB1 olmaması bir nükleotid eksizyon onarım (EŞ) ko-faktör 23,24 olarak TFO yönelik ICLs mutajenik işleme ve tespit HMGB1 artış olduğunu göstermiştir. Son zamanlarda, HMGB1 insan hücrelerinde TFO yönelik ICLs ilişkili olan ve bu lezyonların olan alım NER protein, DA 16 bağlıdır olduğunu bulduk. DNA negatif süper NER 25 DNA lezyonları randımanlı bir şekilde uzaklaştırılmasını teşvik ettiği gösterilmiştir, ve HMGB1 TFO yönelik ICL içeren ÜLR&#39;lerde tercihen negatif süper indükler bulmuşlardırBir NER ko-faktör olarak HMGB1 potansiyel rolü (ler) daha iyi anlaşılmasını sağlayan (non-hasarlı plazmidler yüzeylere göre) orta yüzeyler 16. ICLs işleme tamamen insan hücrelerinde anlaşılmamıştır; Bu nedenle, burada tarif edilen moleküler araçlar göre teknikler ve gelişmiş deneyler da kanser kemoterapi rejimleri etkinliğini arttırmak için kullanılabilir farmakolojik hedefler olarak hizmet verebilir ICL onarımında yer alan ilave edilen proteinlerin tanımlanması için yol açabilir. Burada, etkili bir yaklaşım tartışılmıştır agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon ile plazmid DNA TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini değerlendirmek. Bundan başka, TFO-yönlendirilmiş ICLs içeren plasmidler kullanılarak teknikler tarif edilmiştir Chip tahlilleri kullanarak hücresel bir çerçevede ICL hasarlı plazmidler ile HMGB1 ilişkisini belirlemek için. Ayrıca, bir uyduruk bir yöntem th tarafından tanıtıldı topolojik değişiklikleri incelemek içinözellikle insan hücre lizatlarında ICL hasarlı plazmid yüzeylerde e mimari proteini HMGB1, iki boyutlu agaroz jel elektroforez ile sarılma tahlilleri gerçekleştirilerek tespit edilmiştir. tarif edilen teknikler, insan hücrelerinde plazmid hedefli DNA hasarının işleme DNA tamiri ve mimari proteinlerin katılımı anlaşılmasını ilerletmek için de kullanılabilir. Bu plazmid DNA, ve daha sonra plazmid çip ve sırasıyla, DNA topolojisi değiştirebilir lezyonlar ile ilişkilendirmek proteinler ve proteinleri belirlemek için deneyleri sarılma ilgili TFO-yönelimli site özel psoralen ICLs oluşumu için ayrıntılı protokoller tarif eder. Bu deneyler, diğer DNA hasar verici maddeler, TFOlar, plazmid alt tabakalar ve ilgi memeli hücre hatları ile gerçekleştirmek için modifiye edilebilir. Aslında, en azından bir olası benzersiz ve yüksek afiniteli TFO-bağlama bölgesi, insan genomunda 26 her açıklamalı geni içinde olduğunu göstermiştir. NasılBiz Mukherjee ve Vasquez 2016, 16 kullanılan gibi bir zamanda, netlik sağlamak için, insan U2OS hücrelerinde spesifik mutasyon haberci plazmid (pSupFG1) belirli bir psoralen-konjuge TFO (pAG30) kullanımı için bu teknikleri tarif.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Sertifikalı Reaktif Co., Midland, TX</td><td>Özel sipariş</td><td>HPLC (veya jel) saflaştırılmış</td></tr><tr><td>Basit ChIP Enzimatik Kromatin IP Kiti</td><td>Hücre sinyalizasyonu A.Ş.</td><td>9003</td><td>Üretici tarafından önerilen protokol, plazmid IP için değil, kromatin IP için optimize edilmiştir. Kontrol IgG ve H3 antikorlarının yanı sıra Protein G boncukları ve mikrokokal nükleaz üretici tarafından sağlanır.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR ana karışımı</td></tr><tr><td>HMGB1 antikoru</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Sihirbaz Jeli ve PCR temizleme kiti</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Klorokin-difosfat tuzu</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>İki boyutlu agaroz jel elektroforezi</td></tr><tr><td>için EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER transfeksiyon reaktifi</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoizomeraz I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray uzun dalga ultraviyole lamba</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA lambası</td></tr><tr><td>EpiSonic Çok Fonksiyonlu Biyoişlemci 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>Su banyosu sonikatörü</td></tr><tr><td>Mylar filtre</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td>80112939</tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD XRS</td><td>+ sistemi</td><td>DNA görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>%37 Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Çapraz bağlama için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Bromokresol yeşili</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA yükleme boyası</td></tr><tr><td>Silikonize tüpler</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Düşük tutma mikrofüj tüpü</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Borik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fotometre InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA doz ölçümü</td></tr><tr><td><güçlü>Hücre hatları< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsan U2OS osteosarkomu</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Tedarikçiye göre kültürlenmiş s tavsiyesi</td></tr><tr><td>İnsan servikal adenokarsinomu HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Tedarikçiye göre kültürlenmiş s önerisi</td></tr><tr><td>Proksimal ileri astar</td><td>5&prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proksimal ters astar</td><td>5&prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal ileri astar</td><td>5&prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Distal ters astar</td><td>5&prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

araçlar helix bozan, site-spesifik dna içi çapraz bağlantılar işlenmesi mimari protein hmgb1 rolü eğitim için

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Yüksek mobilite grubu kutusu 1 (HMGB1) proteini, transkripsiyon, DNA replikasyonu ve DNA onarımı gibi genomunda çok önemli fonksiyonları, düzenlenmesinde görev olmayan bir histon mimari proteindir. HMGB1 standart B-DNA&#39;ya daha yüksek afinite ile yapısal olarak bozuk DNA&#39;ya bağlanır. Örneğin, biz HMGB1 DNA sarmalının bozulmalarına neden kovalent DNA iki ipliklerini bağlamak çapraz bağlantılar (ICLs), zincirler arası ve bırakılırsa unrepaired hücre ölümüne neden olabilir bağlanan bulundu. Bağlı sitotoksik potansiyel birçok ICL-uyarıcı maddeler, şu anda klinik olarak kemoterapötik maddeler olarak kullanılmaktadır. ICL oluşturucu maddeler belli baz dizilerine (örneğin, &#39;-TA-3 5&#39;psoralen için tercih edilen çapraz site) için tercihleri gösterirken, büyük ölçüde gelişigüzel bir şekilde DNA hasarına neden. Ancak, kovalent olarak dizi-spesifik DNA&#39;ya bağlanan bir üçlü oluşturan oligonükleotid (TFO), ICL-indükleme maddesinin birleştirilmesi suretiyleşekilde, hedef DNA hasarı elde edilebilir. Burada, bir araç olarak kullanmak için bir mutasyon raportör plasmid üzerinde bir site-spesifik ICL oluşturmak için kovalent 8-Trimethylpsoralen (HMT) psoralen 5 &#39;Bir 4&#39;-hidroksimetil-4,5&#39; ucuna üzerine konjuge edilmiş bir TFO kullanımı insan hücrelerinde HMGB1 karmaşık DNA lezyonlarının mimari değişiklik, işleme ve onarım incelemek için. Biz deneysel teknikler muhabiri plazmidler üzerinde TFO yönettiği ICLs hazırlamak ve kromatin immünopresipitasyon deneyleri kullanılarak bir hücresel bağlamda TFO yönettiği ICLs ile HMGB1 ilişkisini sorgulamak için açıklar. Buna ek olarak, HMGB1 ile psoralen çapraz bağlı plazmid üzerinde kişiye süpersarmal dönüş miktarı ölçülerek hasarlı DNA spesifik mimari modifikasyonu değerlendirmek için, DNA sarılma analizler açıklanmaktadır. Bu teknikler, TFO-yönlendirilmiş ICLs veya ilgi duyulan herhangi bir hücre hattı için diğer hedef DNA hasarının işlem ve onarımında yer alan diğer proteinler rollerini incelemek için kullanılabilir.

TFO-yönlendirilmiş ICL&#39;in oluşumu insan hücrelerinde ICL işleme mimari proteinlerin rolleri sorgulamak için kullanılan plazmid bazlı deneyler için önemlidir. agaroz jel elektroforezi ile denaturasyon TFO-yönlendirilmiş ICL oluşumu etkinliğini belirlemek için, basit bir yöntemdir. TFO-yönlendirilmiş ICLs barındıran plasmidleri un çapraz bağlanmış kontrol plazmid (Şekil 1A, şerit 2) ile karşılaştırıldığında agaroz jel matrisi (Şekil 1A, yol 3) ile daha...

Hedeflenen DNA hasarı, DNA'ya zarar veren bir ajanın tripleks oluşturan bir oligonükleotite (TFO) bağlanmasıyla elde edilebilir. Modifiye TFO'lar kullanılarak, DNA hasarına özgü protein ilişkisi ve DNA topolojisi modifikasyonu, burada açıklanan modifiye kromatin immünopresipitasyon testleri ve DNA süper sarma testlerinin kullanılmasıyla insan hücrelerinde incelenebilir.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Modifiye kromatin immünopresipitasyon ve DNA süper kıvrımlanma deneylerinin genel amacı, insan hücrelerinde kemoterapötik veya kanserojen ajanların neden olduğu bölgeye özgü DNA hasarı üzerinde, yapısal proteinlerin indüklediği ilişkiyi ve ardından gelen topolojik modifikasyonları incelemektir. Bu metodoloji, kanser tedavisi için yeni farmakolojik hedeflerin keşfini kolaylaştıracak olan DNA hasarı ve onarımı hakkındaki temel soruları ele almamıza olanak sağlayacaktır. Teknolojimiz, bölgeye özgü DNA hasarını yönlendirmemize imkan tanır ve insan kanseriyle ilgili kritik DNA onarım süreçlerinin değerlendirilmesini kolaylaştırır.Başlangıç olarak, transfeksiyondan 24 saat önce, antibiyotik içermeyen %10 FBS ile desteklenmiş DMEM içeren 60 milimetrelik petri kaplarına kap başına 400.000 memeli hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit altında gece boyunca inkübe edin. 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüp içerisinde, oda sıcaklığındaki 30 µL transfeksiyon ajanını, 37 °C'ye ısıtılmış 500 µL 1X büyütme ortamı ile birleştirin.İkinci bir tüpte, 500 mikrolitre 1X büyüme ortamı içerisinde iki mikrogram TFO-yönlendirmeli ICL içeren plazmidi birleştirin. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Birinci karışım ile ikinci karışımı birleştirin ve iyice karışması için pipetle yukarı-aşağı hareketler yapın.Ardından çözeltiyi oda sıcaklığında 25 ila 30 dakika inkübe edin. Sonrasında, hücreleri iki kez yıkamak için ılık PBS kullanın. Daha sonra, transfeksiyon karışımını damla damla ekleyerek çözeltiyi hücre plağına eşit şekilde dağıtın.Plakaya bir mililitre büyüme besiyeri ekleyin ve final hacmi iki mililitreye tamamlayın. İyice karıştırın ve kültür plaklarını 37 °C ve %5 karbondioksit ortamına yerleştirin. Dört saat sonra, besiyerini %10 FBS içeren üç mililitre büyüme besiyeri ile değiştirin ve 16 saat daha inkübe edin.İnkübasyonun ardından, hücrelere her plak için 80 µL taze %37 formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında, karanlıkta 10 dakika boyunca inkübe edin. Her plak için 300 µL soğutulmuş glisin ekleyerek formaldehit çapraz bağlanmasını sonlandırın ve beş dakika inkübe edin. Ardından ortamı uzaklaştırın ve plakları iki kez yıkamak için soğutulmuş PBS kullanın.Ardından, 1 mm soğutulmuş PBS ekledikten sonra, numuneleri her zaman buz üzerinde tutarak hücreleri sıyırıcı ile buz üzerindeki bir mikro santrifüj tüpüne toplayın. 13.400 ×g'de ve 4 °C'de beş dakika santrifüj ederek hücre peletlerini hazırlayın. Daha sonra süpernatanı uzaklaştırın ve peletleri buz üzerine yerleştirin.Pelletleri homojen şekilde yeniden süspand etmek için bir mililitre soğutulmuş Buffer A kullanın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Ardından, hücreleri daha önce yapıldığı gibi pelletleyin. Şimdi, bir mililitre soğutulmuş Buffer B ile pelletleri homojen şekilde yeniden süspand edin ve ara ara ters çevirerek karıştırarak 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Ardından hücreleri daha önce yapıldığı gibi pelletleyin. Hücreleri soğutulmuş 200 µL Buffer B içinde tekrar süspanse ettikten sonra, iki µL mikrokokal nükleaz (MNase) ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, tüpleri buza yerleştirerek ve 40 mM EDTA ekleyerek MNase reaksiyonunu durdurun.Mikrokokal nükleaz ile sindirim seviyesi oldukça kritiktir; çünkü aşırı sindirim sinyal kaybına yol açabilirken, yetersiz sindirim çok fazla spesifik olmayan arka plan gürültüsüne neden olabilir. Hücreleri çöktürdükten sonra, peletleri proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş 100 µL kromatin immünopresipitasyon veya ChIP tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücre süspansiyonunu ince duvarlı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Örnekleri bir benmari sonikatöründe 20 saniye boyunca yüzdürerek sonikasyona tabi tutun, ardından 20 saniye boyunca buz üzerinde bekletin. Yaklaşık 800 ila 1.200 baz çifti uzunluğunda fragmanlar oluşturmak için sonikasyon adımlarını dokuz kez tekrarlayın. Sonikasyona tabi tutulmuş 20 µL örneğe, üç µL beş molar sodyum klorür ve bir µL RNase A ekleyin. Tüpleri vortekslleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, iki µL proteinaz K ekleyin ve 65 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Yazılı protokole göre örnekleri saflaştırdıktan sonra, %1'lik agaroz jelde yürütme işlemini gerçekleştirin ve etidyum bromür ile görselleştirin. Önceden soğutulmuş üç ayrı silikonize tüpe, 30 µL lizat ve proteaz inhibitörleri eklenmiş 70 µL soğuk 1X ChIP tamponu ekleyin.İlgili tüplere bir mikrogram anti-IgG, anti-histone H3 veya anti-HMGB1 antikorları ekleyin. Sürekli rotasyonla soğuk odada gece boyunca inkübe edin. Soğuk odada, Protein G boncuklarını yeniden süspanse ettikten sonra, her bir reaksiyon tüpüne dört mikrolitre boncuk ekleyin ve rotasyonla soğuk odada iki ila dört saat daha inkübe edin.Boncukları çöktürmek için tüpleri bir manyetik raka yerleştirin ve süpernatantı uzaklaştırın. Çökeltilere, proteaz inhibitör kokteyli içeren 200 microliters 1X ChIP tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca soğuk ortamda rotasyonla yıkayın. Ardından, yüksek tuzlu 1X ChIP tamponu ile ek bir yıkama işlemi gerçekleştirin.Ardından, peletleri yeniden süspanse etmek için 160 µL elüsyon tamponu kullanın ve 37 °C'de rotasyonla 30 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları çöktürün ve süpernatantı yeni bir tüpe toplayın. Altı µL 5 M sodyum klorür ve iki µL proteinaz K ekleyin ve 65 °C'de gece boyunca inkübe edin.DNA'yı metin protokolüne göre saflaştırdıktan sonra, ilgilenilen bölge veya bölgelere yönelik primer setlerini kullanarak PCR reaksiyonlarını gerçekleştirin ve ürünleri etidyum bromür ile boyanmış %1'lik agaroz jelde çözümleyin. Kullanmadan önce, önceden hazırlanmış DNA onarım sentezi tamponunu buz üzerinde çözün ve 40 millimolar fosfokreatin ile 2,5 micrograms kreatin fosfokinaz ekleyin. 10X süper kıvrımlama tamponunu metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, 300 nanograms süper kıvrımlı plazmit PCA FG1'i lineerize etmek için 10 mikrolitre hacmindeki bir reaksiyonda 1X süper kıvrımlama tamponu ile bir mikrolitre vaccinia topoisomerase 1 kullanın.Gevşemiş plazmidlere, yeni çözünmüş 25 µL HeLa hücre ekstraktı ve DNA sentez tamponu ekleyin. İyice karıştırın, ardından reaksiyona 1 µL vaccinia topoisomeraz 1 ekleyin ve 37 °C'de bir saat inkübe edin. Reaksiyonları %1 SDS ve 0,25 mg/mL proteinaz K ekleyerek sonlandırın ve 65 °C'de iki saat inkübe edin.1X TPE tamponu ile %1'lik agaroz jel hazırlandıktan sonra, reaksiyonlara DNA yükleme boyası ekleyin ve örnekleri jel üzerine en az dört kuyucuk arayla doğrudan yükleyin. Topoizomerleri ayrıştırmak için ilk boyutta jeli, oda sıcaklığında 1X TBE içerisinde santimetre başına iki volt ile sekiz ila 10 saat boyunca çalıştırın. Mililitre başına üç mikrogram klorokin fosfat içeren iki litre 1X TBE hazırlayın.Jeli, 200 mililitre çözelti içinde, alüminyum folyo ile kapatılmış halde 20 dakika boyunca bekletin. Jeli ikinci boyutta elektroforez yapmak için, jeli saat yönünde 90 derece döndürün ve pozitif ve negatif süperkıvrımları ayırmak için klorokin içeren 1X TBE içerisinde, santimetre başına iki volt gerilimde dört ila altı saat boyunca çalıştırın. Elektroforez tamponundaki ve jeldeki klorokin miktarının yanı sıra, ikinci boyut için jelin çok düşük voltajda çalıştırılması, pozitif ve negatif süperkıvrımların ayrılması açısından oldukça kritiktir.Metin protokolüne uygun olarak jeli boyayıp boyasız hale getirdikten sonra, topoizomerlerin termodistribüsyonunu görselleştirmek için bir görüntüleme cihazı kullanın. Bu jelde görüldüğü üzere, TFO yönlendirmeli ICL'ler içeren plazmidlerin yaklaşık %79'u, çapraz bağlanmamış kontrol plazmidleri ile karşılaştırıldığında agaroz jel matrisi boyunca daha yavaş bir mobilite ile göç eder. Kontrol plazmidi veya TFO yönlendirmeli ICL'ler içeren plazmidler ile transfekte edilmiş insan U2OS hücresi lizatları üzerinde gerçekleştirilen ChIP analizleri, anti-HMGB1 antikoru ile immünopresipite edildiğinde, kontrol bölgesine kıyasla P-ICL bölgesinde HMGB1 zenginleşmesi olduğunu göstermektedir.HMGB1, siRNA tedavisi ile hücrelerden tüketildiğinde, P-ICL'ye özgü zenginleşme azalmıştır. Aynı örnekler anti-IgG antikoru kullanılarak immünopresipite edildiğinde, minimum PCR amplifikasyonu saptanmıştır. Son olarak, bu şekildeki iki boyutlu agaroz jel elektroforezi, HeLa hücre ekstraktlarında HMGB1 tarafından TFO yönlendirmeli ICL içeren plazmidlerin negatif süper kıvrımlama şeklinde mimari modifikasyonunu göstermektedir.Bu teknik uzmanlaşıldığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık beş günde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, oda sıcaklığındaki yıkamaların arka plan sinyalini artırabileceği nedeniyle tüm yıkama işlemlerinin soğuk odada yapılması gerektiğini unutmak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen proteinin DNA onarımına dahil olup olmadığı gibi soruları yanıtlamak amacıyla, siRNA aracılı protein depleksyonu ve ardından mutasyon tarama analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Yoksa bu işlem sırasında mutasyon spektrumlarını önemli ölçüde değiştiriyor mu? Bu teknik, proteinler ile bölgeye özgü DNA hasarı arasındaki ilişkiyi incelemenin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, mimari proteinlerin hedef DNA çapraz bağlarına olan etkileşiminin nasıl inceleneceği ve ardından bu etkileşimin DNA topolojisi üzerindeki etkisinin nasıl belirleneceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.Etidyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu nedenle, bu deneyi gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu ekipman giyilmelidir.

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

DNA hasar onarım Kinetik eğitim lezyonlar tanımlanmış alt nükleer bölgeler itibariyle ikna etmek için bir sistem gerektirir. Biz bir yöntem bir 405 nm lazer ile donatılmış lazer tarama confocal mikroskop kullanarak yerelleştirilmiş çift iplikçikli kesmeleri oluşturmak ve tamir faktörler bu lezyonlar, dinamikleri ölçmek için otomatik yordamlar sağlar açıklar.

Soruşturma 405 Nm lazer mikro-ile kullanarak DNA lezyonlar için Protein alımı

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Doğal γH2A.X kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yoluyla yaygın kırılgan bölge kırılmalarını tespit etmek için hızlı ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşım, geleneksel γH2A.X ChIP tahlilleriyle ilişkili hem zamanı hem de işçiliği önemli ölçüde azaltırken, sonuçların yüksek tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini korur.

Doğal γH2A ile yaygın kırılgan bölge kırılmalarının yakalanması. X ChIP

Keşfedin, modifiye kromatin immunopresipitasyonu ve DNA süperkıvrım deneyleriyle insan hücrelerinde site-spesifik DNA hasarına mimari proteinlerin bağlanmasını ve topolojik değişiklikleri nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem kanser tedavisi için yeni farmakolojik hedefler keşfetmeye yardımcı olur.

Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

Daha fazla video keşfet