Araçlar Helix bozan, site-spesifik DNA içi çapraz bağlantılar işlenmesi Mimari Protein HMGB1 Rolü Eğitim için

Modifiye kromatin immünopresipitasyon ve DNA süper sarma deneylerinin genel amacı, insan hücrelerinde kemoterapötik veya kanserojen ajanlar tarafından indüklenen bölgeye özgü DNA hasarı üzerinde mimari proteinler tarafından indüklenen ilişkiyi ve müteakip topolojik modifikasyonları incelemektir. Bu metodoloji, kanser tedavisi için yeni farmakolojik hedeflerin keşfedilmesini kolaylaştırması gereken DNA hasarı ve onarımı ile ilgili temel soruları ele almamıza izin verecektir. Teknolojimiz, bölgeye özgü DNA hasarını yönlendirmemize olanak tanır ve insan kanseriyle ilgili kritik DNA onarım süreçlerinin değerlendirilmesini kolaylaştırır.

Başlamak için, transfeksiyondan 24 saat önce, DMEM'deki 60 milimetrelik çanak başına 400.000 memeli hücresi plaka, antibiyotiksiz% 10 FBS ile desteklenmiştir. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 14 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpte, 30 mikrolitre oda sıcaklığında transfeksiyon maddesini, 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış 500 mikrolitre 1X büyüme ortamı ile birleştirin.

İkinci bir tüpte, iki mikrogram TFO'ya yönelik ICL içeren plazmitleri 500 mikrolitre 1X büyüme ortamında birleştirin. Tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Birinci karışımı ikinci karışımla birleştirin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Daha sonra çözeltiyi oda sıcaklığında 25 ila 30 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri iki kez yıkamak için ılık PBS kullanın. Daha sonra, transfeksiyon karışımını damla şeklinde ekleyin ve çözeltiyi hücre plakası boyunca eşit olarak dağıtın.

Plakaya bir mililitre büyüme ortamı ekleyin ve son hacmi iki mililitreye getirin. İyice karıştırın ve kültür plakalarını 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite yerleştirin. Dört saat sonra, ortamı %10 FBS'li üç mililitre büyüme ortamı ile değiştirin ve 16 saat daha inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, hücrelere plaka başına 80 mikrolitre taze% 37 formaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Plaka başına 300 mikrolitre soğutulmuş glisin ekleyerek formaldehit çapraz bağını söndürün ve beş dakika inkübe edin. Ardından ortamı çıkarın ve plakaları iki kez yıkamak için soğutulmuş PBS kullanın.

Daha sonra, bir milimetre soğutulmuş PBS ekledikten sonra, hücreleri buz üzerinde bir mikrosantrifüj tüpüne kazıyarak toplayın ve numuneleri her zaman buz üzerinde tutun. Beş dakika boyunca 13, 400 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek hücre peletlerini hazırlayın. Sonra, süpernatanı çıkarın ve peletleri buzun üzerine yerleştirin.

Peletleri homojen bir şekilde yeniden süspanse etmek için bir mililitre soğutulmuş Tampon A kullanın ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri daha önce olduğu gibi peletleyin. Şimdi, bir mililitre soğutulmuş Tampon B ile peletleri homojen bir şekilde yeniden süspanse edin ve ara sıra ters çevirerek karıştırarak 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra hücreleri daha önce olduğu gibi peletleyin. Hücreleri tekrar askıya aldıktan sonra, 200 mikrolitre soğutulmuş Tampon B'de, iki mikrolitre mikrokokal nükleaz veya MNaz ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, tüpleri buzun üzerine yerleştirerek ve 40 milimolar EDTA ekleyerek MNase reaksiyonunu durdurun.

Mikrokokal nükleaz ile sindirim seviyesi çok kritiktir, çünkü aşırı sindirim sinyal kaybına neden olabilirken, yetersiz sindirim çok fazla spesifik olmayan arka plana neden olabilir. Hücreleri peletledikten sonra, peletleri proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiş 100 mikrolitre kromatin immünopresipitasyon veya ChIP tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, hücre süspansiyonunu ince duvarlı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Numuneleri bir su banyosu sonikatörü üzerinde 20 saniye yüzdürerek, ardından buz üzerinde 20 saniye boyunca sonikleştirin. Yaklaşık 800 ila 1.200 baz çifti parçası oluşturmak için sonikasyon adımlarını dokuz kez tekrarlayın. Sonikasyonlu örneklerin 20 mikrolitresine, üç mikrolitre beş molar sodyum klorür ve bir mikrolitre RNase A. Vorteks ekleyin, tüpleri girin ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, iki mikrolitre proteinaz K ekleyin ve iki saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Numuneleri metin protokolüne göre saflaştırdıktan sonra, %1 agaroz jel üzerinde çalıştırın ve etidyum bromür ile görselleştirin. Üç ayrı, önceden soğutulmuş silikonize tüpte, 30 mikrolitre lizat ve ilave proteaz inhibitörleri ile 70 mikrolitre soğutulmuş 1X ChIP tamponu ekleyin.

İlgili tüplere bir mikrogram anti-IgG, anti-histon H3 veya anti-HMGB1 antikorları ekleyin. Sürekli rotasyonlu soğuk bir odada gece boyunca inkübe edin. Soğuk odada, Protein G boncuklarını yeniden süspanse ettikten sonra, her bir reaksiyon tüpüne dört mikrolitre boncuk ekleyin ve iki ila dört saat daha rotasyonla soğuk bir odada inkübe edin.

Boncukları peletlemek için tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Peletlere proteaz inhibitörü kokteyli ile 200 mikrolitre 1X ChIP tamponu ekleyin ve soğukta beş dakika döndürerek yıkayın. Daha sonra, yüksek tuzlu 1X ChIP tamponu ile ek bir yıkama yapın.

Daha sonra, peletleri yeniden askıya almak için 160 mikrolitre elüsyon tamponu kullanın ve 30 dakika döndürerek 37 santigrat derecede inkübe edin. Boncukları peletleyin ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. Altı mikrolitre beş molar sodyum klorür ve iki mikrolitre proteinaz K ekleyin ve gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.

DNA'yı saflaştırdıktan sonra, metin protokolüne göre, ilgilenilen bölgeye veya bölgelere primer setleri kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin ve ürünleri, etidyum bromür ile boyanmış% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çözün. Kullanmadan önce, önceden hazırlanmış DNA onarım sentezi tamponunu buz üzerinde çözdürün ve 40 milimolar fosfokreatin ve 2.5 mikrogram kreatin fosfokinaz ekleyin. Metin protokolüne göre 10X süper sarma tamponu hazırladıktan sonra, 300 nanogram süper sarmal plazmid, PCA FG1'i doğrusallaştırmak için 10 mikrolitrelik bir reaksiyonda 1X süper sarma tamponu ile bir mikrolitre aşı topoizomeraz 1 kullanın.

Gevşemiş plazmitlere 25 mikrolitre taze çözülmüş HeLa hücre özü ve DNA sentezi tamponu ekleyin. İyice karıştırın, daha sonra reaksiyona bir mikrolitre vaccinia topoizomeraz 1 ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. % 1 SDS ve mililitre proteinaz K başına 0.25 miligram ekleyerek reaksiyonları sonlandırın ve iki saat boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin.

1X TPE tamponu ile %1'lik bir agaroz jeli döktükten sonra, reaksiyonlara DNA yükleme boyası ekleyin ve numuneleri en az dört şerit arayla doğrudan jelin üzerine yükleyin. Topoizomerleri çözmek için oda sıcaklığında ilk boyut için jeli 1X TBE'de santimetre başına iki voltta sekiz ila 10 saat çalıştırın. Mililitre klorokin fosfat başına üç mikrogram ile iki litre 1X TBE hazırlayın.

Jeli, 20 dakika boyunca alüminyum folyo ile kaplanmış 200 mililitre çözeltiye batırın. Jeli ikinci boyutta elektroforez etmek için, jeli saat yönünde 90 derece çevirin ve pozitif ve negatif süper bobinleri çözmek için 1X TBE içeren klorokin içinde santimetre başına iki voltta dört ila altı saat çalıştırın. Elektroforez tamponundaki ve jeldeki klorokin miktarı çok kritiktir, ayrıca jeli ikinci boyut için çok düşük bir voltajda çalıştırmak, pozitif ve negatif süper bobinleri ayırmak için çok kritiktir.

Jeli boyadıktan ve lekesini çıkardıktan sonra, metin protokolüne göre, topoizomerlerin termo dağılımını görselleştirmek için bir görüntüleyici kullanın. Bu jelde görüldüğü gibi, TFO'ya yönelik ICL'leri barındıran plazmitlerin yaklaşık% 79'u, çapraz bağlı olmayan kontrol plazmitlerine kıyasla agaroz jel matrisi boyunca daha yavaş bir hareketlilik ile göç eder. Kontrol plazmidi veya TFO'ya yönelik ICL'ler içeren plazmitler ile transfekte edilmiş insan U2OS hücrelerinden elde edilen lizatlar üzerinde gerçekleştirilen ChIP testleri, anti-HMGB1 antikoru ile immünopresipite edildiğinde kontrol bölgesine kıyasla P-ICL bölgesinde HMGB1'in zenginleştiğini gösterir.

HMGB1, siRNA tedavisi ile hücrelerden tükendiğinde, P-ICL'ye özgü zenginleştirme azaldı. Aynı numuneler bir anti-IgG antikoru kullanılarak immünopresipite edildiğinde, minimal PCR amplifikasyonu tespit edildi. Son olarak, bu şekilde, iki boyutlu agaroz jel elektroforezi, TFO'ya yönelik ICL içeren plazmitlerin, HeLa hücre ekstraktlarında HMGB1 tarafından negatif süper sarma olarak mimari modifikasyonunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa yaklaşık beş gün içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, oda sıcaklığındaki yıkamalar arka plan sinyalini artırabileceğinden, tüm yıkamaların soğuk odada yapılması gerektiğini unutmamak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, siRNA aracılı protein tükenmesi ve ardından mutasyon tarama testleri gibi diğer yöntemler, ilgilenilen proteinin DNA onarımında rol oynayıp oynamadığı gibi soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Yoksa süreç sırasında mutasyon spektrumlarını önemli ölçüde değiştiriyor mu? Bu teknik, proteinler ve bölgeye özgü DNA hasarı arasındaki ilişkiyi incelemenin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, bir DNA çapraz bağlarını hedeflemek için mimari proteinlerin ilişkisini nasıl inceleyeceğiniz ve daha sonra bu ilişkinin DNA'nın topolojisi üzerindeki etkisini nasıl belirleyeceğiniz konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.

Etidyum bromür ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu nedenle bu deneyi gerçekleştirirken her zaman uygun koruyucu giysilerin giyilmesi gerektiğini unutmayın.