Mikobakteriler Yarı kantitatif, Orta hacimli Sayımı İçin Kömür Agar Resazurin Testi görselleştirme

CARA'nın genel amacı, bileşiklerin çoğalan ve çoğalmayan mikobakterilere karşı aktivitesinin orta verimli yarı kantitatif bir değerlendirmesini sağlamaktır. Bu tekniğin temel avantajı, bir CFU vekili olarak CARA'nın, bir bileşiğin dozunu ve zamana bağımlılığını hızlı bir şekilde test etmesine izin vermesidir. Bu yöntem, bir bileşiğin çoğalan bakterilere karşı bakteriyostatik mi yoksa bakterisidal mı olduğunu ve çoğalmayan bakterilere karşı bakterisidal olup olmadığını belirlemek gibi tüberküloz ilaç keşfi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Yöntemi göstermek, laboratuvarımızda çalışan Julia Roberts olacak. Bir litrelik cam behere 450 mililitre su veya iki litrelik Erlenmeyer şişesine 900 mililitre su ekleyin. Behere veya şişeye otoklavlanabilir bir karıştırma çubuğu ekleyin.

Ardından, bir Middlebrook 7H11 tozu, %0.4'lük bir nihai konsantrasyona kadar aktif kömür ve %0.2'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için %50'lik bir gliserol çözeltisi ekleyin. Şişenin veya beherin açıklığını alüminyum folyo ile kapatın ve otoklav bandı ile cama tutturun. Ortamı otoklavladıktan sonra, kömürü süspansiyonda tutmak için düşük hıza ayarlanmış manyetik bir karıştırma plakası üzerinde yaklaşık 55 ila 65 santigrat dereceye kadar soğutun.

Manyetik karıştırma plakasına sahip bir biyogüvenlik başlığında aseptik olarak çalışırken, folyoyu ortamdan çıkarın ve sırasıyla iki litrelik şişeye veya bir litrelik behere 100 veya 50 mililitre OADC takviyesi ekleyin ve karıştırmaya devam edin. Sekiz veya 12 filtre ucuna sahip çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir mikroplakayı, agar katılaşmasını ve kabarcık oluşumunu önlemek için hızlı bir şekilde çalışarak, reaktif rezervuarından veya beherden 200 mikrolitrelik 7H11-OADC-odun kömürü ile doldurun. Kurumasını önlemek için CARA mikroplaka yığınlarını yeniden kapatılabilir plastik torbalara yerleştirin ve dört santigrat derecede saklayın.

Sırasıyla dört veya 20 mililitre Middlebrook 7H9-ADN veya 7H9-OADC içeren polipropilen yuvarlak tabanlı veya konik santrifüj tüplerini 0.01 ila 0.1 OD580'de M.smegmatis ile aşılayın. M.smegmatis kültürlerini 37 santigrat derece ve% 20 O2'de çalkalayarak inkübe edin, kültürleri orta log fazına veya yaklaşık 0.5 OD580'e genişletin. Replikasyon ve replike olmayan koşullar altında minimal bir inhibitör konsantrasyon tarzı deneyi kurmak için, 0.01'lik bir OD580'de 7H9-ADN'de 200 mikrolitre hücreyi, açık tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın tüm kuyucuklarına dağıtın.

Reprepasyon yapmayan test için, hücreleri iki kez yıkamak için% 0.02 tyloxapol içeren PBS kullanın. Ve hücreleri yeniden askıya almak için çoğalmayan ortam kullanın. Hücreleri 0.1'lik bir OD580'e seyreltmek için çoğalmayan ortam kullanın ve yeni hazırlanmış bir molar stoktan 0.5 ila 5 milimolar nihai konsantrasyona sodyum nitrat ekleyin.

0.1'lik bir OD580'de 200 mikrolitre hücreyi, açık tabanlı, doku kültürü ile muamele edilmiş 96 oyuklu bir plakanın tüm kuyucuklarına dağıtın. Test ajanlarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, iki mikrolitre test ajanı bir A'dan E'ye kadar olan sıralara ve iki mikrolitre test ajanı iki E'den H'ye kadar olan sıralara ekleyin ve iyice karıştırın. Tahlilleri tekrarlamak için, M.smegmatis mikroplakalarını bir ila 48 saat boyunca 37 santigrat derece,% 20 O2 ve% 5 CO2'de inkübe edin.

CARA'nın okuma olarak kullanılacağı zaman noktalarında, MIC90 tarzı tahlil plakasının kuyu içeriğini beş ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice yeniden askıya almak için 50 ila 75 mikrolitreye ayarlanmış bir p200 çok kanallı pipet kullanın. Ardından, kuyucukların içeriğini dairesel hareketlerle hafifçe döndürmek için pipet uçlarını kullanın. Seyreltilmemiş tahlil kuyusu içeriğinin 10 mikrolitresini, transferler sırasında sıçramayı önleyerek CARA mikroplakasının ilgili kuyucuklarına aktarın, 10 mikrolitrelik alikotun CARA mikroplaka kuyucuklarının ortasına yerleştiğinden emin olun.

Plaka bandı ile CARA mikro plaka yığınlarını bağlayın ve ardından bunları yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun. M.smegmatis CARA mikroplakalarını 37 santigrat derecede% 20 O2 ile çoğaltan plakalar için bir ila iki gün ve replike etmeyen plakalar için iki ila üç gün inkübe edin. Negatif kontrol kuyucuklarında bir bakteri üremesi filmi veya daha büyük makroskopik koloniler görüldüğünde, kuyucukların kenarına 40 mikrolitre steril PBS dağıtmak için çok kanallı bir pipet ile tek bir 12 p200 uç seti kullanın ve PBS'nin agar / bakteriyel mikro kolonilerin tepesine dağılmasına izin verin.

PBS'de beş miligram resazurin ve 50 mililitre% 5 Tween80'i karıştırarak CARA geliştirme reaktifini hazırlayın. CARA mikroplakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre taze hazırlanmış CARA geliştirme reaktifi ekleyin. Ardından, reaktifin her bir oyuktaki agar ve bakteri matı boyunca dağıtılmasına yardımcı olmak için plakaları birkaç kez ileri geri sallayın.

Plakaları yeniden kapatılabilir bir plastik torbaya koyun ve M.smegmatis için en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Floresan okumadan önce, CARA mikroplakalarını, kapakları çıkarılmış olarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir biyogüvenlik başlığına yerleştirin. BSL3 spektrofotometrelerini bir biyogüvenlik kabininin dışında kullanırken, plakanın üzerine optik kalitede bir PCR etiketi yapıştırın ve çıkartma yüzeyine hafifçe bastırarak sıkıca kapatmak için yumuşak bir kağıt havlu kullanın.

530 nanometrede uyarma ve 590 nanometrede emisyon ile üstten okuma yoluyla floresansı belirleyin. Plakayı boşaltmak gerekli değildir. Verileri analiz etmek için, X ekseninde inhibitör konsantrasyonunu log10 ölçeği olarak ve Y ekseninde floresansı doğrusal bir ölçekte çizin.

Daha fazla ayrıntı için metin protokolüne bakın. CARA floresansının arka plan seviyelerinin üzerine çıkamamasına neden olan test ajanının konsantrasyonu, burada gösterilen 99'a eşit olan CARA-MBC'dir. 99'a eşit olan büyük alt simge, CARA-MBC'nin tahmini bir test ajanı konsantrasyonu sağladığını ve bu da iki log10 bakteri öldürmesine eşit olandan daha büyük bir miktara yol açtığını gösterir.

Bileşiklerin, MIC ve CARA eğrileri arasında sağa dört kattan daha büyük bir kayma olarak tanımlanan statik bir pencere göstermeleri durumunda antibiyotik sonrası bir etki gösterdiğinden şüphelenilmektedir. Statik pencere, M. tuberculosis'in replikasyonuna karşı aktif olan bir molekülün bakterisidal yerine bakteriyostatik olabileceğini gösterir. Güçlü bir antibiyotik sonrası etkiye sahip moleküller için, statik pencereleri gözlemlemek zor olabilir ve bunlar ancak burada görüldüğü gibi CARA floresansı için genişletilmiş bir Y ekseninin incelenmesinden sonra belirgindir.

MIC90 ve CARA tarafından test edilen replike eden ve olmayan aktif moleküller burada gösterilmektedir. İzoniazid ve linezolid, MIC90 testi ile replike olmayan bakterilere karşı aktiviteye sahip gibi görünse de, CARA, test edilen replike olmayan koşullar altında inaktif olduklarını öne sürmektedir. Bu CARA deneyinde, M.smegmatis'in artan rifampisin konsantrasyonlarına maruz bırakılması, bir saat gibi kısa bir sürede bir etki ortaya çıkardı ve üç ila 24 saat arasında artan bakterisidal aktivite gösterdi ve 24 saat boyunca mililitre başına yaklaşık 10 mikrogramda iki ila üç log10'a eşit derecede daha fazla öldürdü.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik plakaları hazırlamak için yaklaşık iki saatte, hücreleri CARA plakalarına aktarmak için bir saatten az ve düzgün yapılırsa CARA plakalarının floresansını geliştirmek ve ölçmek için yaklaşık bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bir bileşiğin çoğalan veya çoğalmayan mikobakterilere karşı bakterisidal veya bakteriyostatik aktiviteye sahip olup olmadığını belirlemek için CARA'yı öngörücü bir test olarak kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, bir CARA'nın nasıl kurulacağını ve verileri bir bileşiğin aktivite türünü tahmin etmeye yardımcı olacak şekilde nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.