LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren
30 Aralık 2016
Optik olarak kontrol edilen maddeler, sinyal yollarını incelemek için güçlü araçlardır. Olası deneylerin spektrumunu genişletmek için, akış sitometrisi kullanarak optik olarak kontrol edilen maddeleri gerçek zamanlı olarak incelemek için bir cihaz geliştirdik: LED Thermo Flow.
Bu yöntemin genel amacı, akış sitometrik ölçümleri sırasında optik olarak kontrol edilen maddeleri uyarmaktır. Bu yeni cihaz, optik olarak kontrol edilen maddelerin gücünü akış sitometrisi ile birleştirerek hücre sinyalizasyonu alanındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İlk kez, optogenetik araçlar akış sitometrisi kullanılarak karakterize edilebilir ve analiz edilebilir.
Bugüne kadar karşılaştırılabilir yerleşik bir yöntem mevcut değildi. Başlamak için, transdüksiyona uğramış Ramos B lenfositlerini mililitrede bir milyon hücre konsantrasyonunda askıya alın ve bunları bir cam FACS tüpüne aktarın. Ardından, akış sitometresinin siyah O-halkasını kauçuk bir O-ring ile değiştirin ve daha iyi bir sızdırmazlık sağlamak için silikon gres uygulayın.
Cam tüpü bir akış sitometresine yerleştirin ve LED prototipini ışıklar kapalıyken tüpün etrafına yerleştirin. GFP kanalındaki Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçün. Prosedürün en kritik adımı cam tüplerin işlenmesidir.
Cam FACS tüpleri çok kırılgandır ve bu nedenle, deneyler yapmadan önce cam tüplerin sitometreye yerleştirilmesi tavsiye edilir. Ardından, tüpün dışındaki 500 nanometre LED ışığını açın ve Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçmeye devam edin. Dronpa-Linker-Dronpa proteininin foto geçişini ölçmek için gereken minimum ışık yoğunluğunu tahmin etmek için Dronpa floresan yoğunluğu azalana kadar LED ışıkların yoğunluğunu artırın.
Ardından, tüpün dışındaki prototipin 400 nanometre LED ışığını açın ve Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçmeye devam edin. Dronpa floresan yoğunluğu artana kadar 400 nanometre LED ışıkların ışık yoğunluğunu artırın. Fotoğraf anahtarlama LED cihazının iç ve dış katmanlarını imal etmek için ekteki metin protokolündeki tasarım ve üretim talimatlarını izleyerek başlayın.
400 ve 500 nanometre dalga boyundaki LED'leri cihazın kanallarına yerleştirin. Bunları yerlerine yapıştırın ve belirtildiği gibi bağlayın. Bu spesifik dalga boyları, Dronpa-Linker-Dronpa füzyon proteinlerini karanlık ve parlak durumları arasında değiştirmek için kullanılacaktır.
Ardından, transformatörü çalıştırmadan önce sızıntıyı önlemek için cihazı monte edin ve su geçirmez olduğundan emin olun. Cihaz montajını takiben, Ramos B lenfositlerini hasat edin ve bunları mililitre başına üç ila on milyon hücre yoğunluğunda askıya alın. Hücrelerin 600 mikrolitresini bir cam FACS tüpüne aktarın.
Onları buzun üzerine yerleştirin ve ölçülene kadar hücreleri ışıktan koruyun. Monte edilmiş cihazı ısıtılmış bir su pompasına bağlayın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, cam FACS tüpünü dikkatlice cihaza yerleştirin ve akış sitometresine bağlayın.
Dronpa floresan yoğunluğunu GFP kanalına kaydedin. Bu optogenetik cihazların tasarımı, numunenin sıcaklığını sabit bir değerde tutmak için dolaşımdaki bir su kaynağına bağlanabilen bir oda içerir. Cihaz üç farklı dalga boyu yayarken, FACS örneğinde cihazdan 37 santigrat derece su akarken sadece marjinal bir sıcaklık artışı görüldü.
Dronpa-Linker-Dronpa füzyon yapısı klonlandı ve Ramos B hücrelerine dönüştürüldü. 500 nanometrelik bir ışık kaynağı tarafından monomer durumuna yönlendirildiğinde, emisyon yoğunluğu azalır. Daha sonra, ışık kaynağı 400 nanometre ışığa geçtiğinde, Dronpa monomeri hızla dimer durumuna geçer ve yoğunluk hızla artar.
Bu cihazı kullanarak, sitozolik Dronpa-Linker-Dronpa füzyon proteini birden çok kez foto-switch yapılabildi. Karanlık duruma geçiş yavaş gerçekleşirken, aydınlık duruma geçiş neredeyse anında gerçekleşir. Dronpa'nın karanlıkta spontan floresan geri kazanımı, parlak forma verimli foto geçişin özel bir aydınlatma gerektirdiğini ve sadece yavaş yavaş kendiliğinden gerçekleştiğini gösterir.
Kinetik analiz, foto anahtarlama hızının genel olarak çok tekrarlanabilir olduğunu ve karanlıkta uzun bir inkübasyondan sonra bile, floresansın sadece yaklaşık yüzde onunun foto anahtarlama olmadan geri kazanıldığını göstermektedir. Bu prosedürü takiben, seçtiğiniz optogenetik aletin işlevselliğini keşfetmek için kalsiyum akışı ölçümleri de dahil olmak üzere herhangi bir akış sitometrik analizi gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, optogenetik alanındaki araştırmacıların hücre sinyal yollarının kablolarını keşfetmelerinin önünü açacaktır.
Bu videoyu izledikten sonra, özel optogenetik aracınız için bir foto anahtarlama protokolünün nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. UV ışığının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, akış sitometrisi kullanılarak optik olarak kontrol edilen maddelerin gerçek zamanlı incelenmesi için tasarlanmış yeni bir cihaz sunmaktadır. Optogenetik araçların akış sitometrik ölçümlerle entegre edilmesi sayesinde araştırmacılar, hücre sinyalizasyonundaki temel soruları keşfedebilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre sinyalleşmesi
- Optogenetik
- Akış sitometrisi
Arka Plan
- Optik olarak kontrol edilen maddeler, sinyal yolaklarının incelenmesi için değerlidir.
- Akış sitometrisi, hücre popülasyonlarının analizine olanak tanır.
- Önceki yöntemler, bu iki güçlü tekniği birleştirmiyordu.
- Bu çalışma, bu entegrasyonu sağlayan bir cihaz tanıtmakta
Çalışmanın Amacı
- Akış sitometrisi ölçümleri sırasında optik olarak kontrol edilen maddeleri stimüle etmek için.
- Akış sitometrisi kullanarak optogenetik araçları karakterize etmek ve analiz etmek için.
- Hücre sinyalizasyonunu araştırmak için yeni bir yöntem sunmak için.
Kullanılan Yöntemler
- Mililitre başına bir milyon hücre konsantrasyonunda süspansiyon halindeki transduk edilmiş Ramos B lenfositleri.
- Hücreler cam bir FACS tüpüne aktarıldı.
- Akış sitometresinin siyah O-ringi kauçuk bir O-ring ile değiştirildi.
- Daha iyi bir sızdırmazlık sağlamak için silikon gres uygulandı.
Temel Sonuçlar
- Cihaz, optogenetik stimülasyonu akış sitometrisi ile başarıyla entegre eder.
- Hücre sinyal yolaklarının gerçek zamanlı analizine olanak tanır.
- Optogenetik araçların ilk kez karakterizasyonuna imkan sağlar.
- Hücre sinyalizasyonunun incelenmesine yönelik mevcut metodolojilerdeki bir boşluğu doldurur.
Sonuçlar
- Bu yeni cihaz, hücre sinyalizasyonu çalışmalarında önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir.
- Optik olarak kontrol edilen maddelerin kullanıldığı araştırmalar için yeni yollar açmaktadır.
- Gelecekteki çalışmalar, karmaşık sinyal yolaklarını incelemek için bu yöntemden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Optogenetik kontrolün akış sitometrisi ile entegrasyonu, sinyalizasyon dinamiklerinin gerçek zamanlı ve tek hücre çözünürlüğünde analiz edilmesini sağlayarak, hedef validasyonu için mekanistik risk azaltmada kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu yaklaşım, canlı hücrelerdeki foto-anahtarlama kinetiğinin kantitatif ve tekrarlanabilir değerlendirmesine olanak tanıyarak öngörü güvenini artırır ve erken keşif kararlarını destekler. Düşük maliyetli ve uyarlanabilir tasarım, optogenetik araç geliştirme süreçlerinde kurumsal düzeyde yeniden kullanıma kolaylık sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Canlı hücrelerde optogenetik araçların gerçek zamanlı fotokeyitlemesi yoluyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yolak dinamiklerini netleştirmek ve mekanistik belirsizliği azaltmak için kantitatif floresan okumaları sağlar.
- Öngörücü Değer: Fizyolojik olarak ilgili koşullar altında optogenetik araç performansını karakterize ederek hedef güvenini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tekrarlanabilir optogenetik kontrol sağlayarak, aşağı akış taramaları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Akış sitometrik ölçümler sırasında ışık yoğunluğu, dalga boyu ve sıcaklığın hassas kontrolü ile analizlerin standartlaştırılmasına olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Saniyede binlerce hücrenin yüksek kapasiteli analizini destekleyerek tarama hazırlığını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonal Süreklülük: Hastalıkla ilgili sistemlerde fonksiyonel değerlendirmeyi mümkün kılarak, keşif aşamasındaki optogenetik karakterizasyonu preklinik doğrulamaya bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Optogenetik araçların fonksiyonelliğinin karmaşık sinyal yolaklarında araştırılmasına izin vererek, geç aşamadaki biyolojik riski azaltır.
- Öngörücü Güven: Hedef ilerletme süreçlerindeki devam/durdur kararlarına temel oluşturacak kantitatif kinetik veriler üretir.
İş Akışı ve İşlem Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken keşif ve öncü bileşik tanımlama aşamalarının kesişim noktasında yer alarak, optogenetik araç değerlendirmesi için hipotez testi ve analiz hazırlığına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Canlı hücrelerde optik olarak kontrol edilen maddelerin gerçek zamanlı manipülasyonuna ve ölçümüne olanak tanıyarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Tek hücre çözünürlüğünde standartlaştırılmış, tekrarlanabilir fotosviçleme ölçümleri aracılığıyla analiz hazır hale getirir.
- Analizler: Koşulları karşılaştırmak ve araç performansını değerlendirmek için kantitatif floresan yoğunluğu okumaları ve kinetik analizler sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Optogenetik araçları akışla uyumlu, fizyolojik olarak ilgili bir formatta karakterize ederek preklinik süreklilik sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli optogenetik araçlara ve deneysel tasarımlara uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir ve düşük maliyetli bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Optogenetik araç fonksiyonunda öngörülebilir güven, sinyal yolaklarındaki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: Hücre popülasyonları genelinde foto-anahtarlama ölçümlerinin standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: İyileştirilmiş devam/durdur kararları, araç geliştirmede sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Kantitatif kinetik profillere dayalı olarak optogenetik adayların riske göre ayarlanmış önceliklendirmesi.
Uygulama Hususları
- Optogenetik, akış sitometrisi ve temel cihaz montajı konularında uzmanlık gerektirir.
- Bir akış sitometresine, LED ışık kaynaklarına ve su pompası aracılığıyla sıcaklık kontrolüne erişim gereklidir.
- Tutarlı ışık iletimi, sıcaklık kontrolü ve örnekleme işlemleri için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Farklı hücre tipleri, optogenetik araçlar ve dalga boyu gereksinimleri için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Cam tüplerin kırılganlığı ve koruyucu önlemler gerektiren UV ışığı riskleri gibi pratik kısıtlamaları kapsar.
