Name: LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Öğrenin optogenetik araçları akım sitometrisi ile karakterize etme yöntemini. Ramos B lenfositleri kullanarak hücre sinyalizasyonunu gerçek zamanlı analiz edin ve optik kontrollü maddeleri inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cihazı yaptığı için Freiburg Üniversitesi'nden J. Schmidt'e teşekkür ederiz. P. Nielsen ve D. Medgyesi'ye bu el yazmasını destekleri ve eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, SFB746 aracılığıyla Deutsche Forschungsgemeinschaft ve Alman Araştırma Vakfı'nın (GSC-4, Spemann Graduate School) Mükemmellik Girişimi tarafından desteklenmiştir.

1. Tasarımı ve Aygıtı Bina <ol><li> Pilot Deneyler NOT: Belirli bir optogenetic aracı ve hücre tipi için gerekli olan ışık yoğunluğu önemli ölçüde değişebilir. prototip Pilot deneyler gerekli minimum ışık yoğunluğunu tahmin etmek yararlıdır. Aşağıdaki deneyler için kullanılan Optogenetic aracı Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa füzyon konstruktu olup. Dronpa dizisi ticari (Malzeme Listesi) elde edildi. Uzun bir bağlayıcı ifade yapısı, molekül-içi (ve moleküller arası) dimerlerinin oluşturulması için izin vermek için iki Dronpa diziler arasında klonlandı. aşağıda tarif edilen kademeler bir çok Optogenetic araçları veya optik olarak kontrol edilen maddelere adapte edilebilir. <ol><li> ambalaj hücrelerden retroviral-ihtiva eden üst sıvıyı kullanarak transdüksiyonu için üreticinin talimatlarına göre bir Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa ihtiva eden bir yapı Ramos B lenfositleri transdüksiyonu. Bir ön göre Hasat ve sayım hücreleribir önce protokolü 13 yayınladı. </li><li> Bir konsantrasyonda yeniden süspanse hücreler 1 x 10 6 orta / ml (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin, 50 uM 2-merkaptoetanol) ve bir cam tüp FACS aktarabilirsiniz. </li><li> Bir akış sitometresinde içine tüp takın ve Dronpa (GFP kanal) 14,15 floresan yoğunluğu ölçmek. </li><li> muhtemelen zararlı dalga boylarında gözleri korumak için diğer tüm adımlar için koruyucu gözlük kullanın. </li><li> El ile borunun dış 500 nm LED ışık yerleştirin ve Dronpa floresans yoğunluğunu ölçülmesi devam edin. </li><li> Dronpa floresan yoğunluğu azalır kadar LED ışıklar sayısı ve / veya yoğunluğunu arttırmak. </li><li> El ile borunun dış 400 nm LED ışık yerleştirin ve Dronpa floresans yoğunluğunu ölçülmesi devam edin. </li><li> Dronpa fluo kadar LED ışıklar sayısı ve / veya yoğunluğunu arttırmakyoğunluk artar rescence. </li><li> adımlar 1.1.5 ve 1.1.7 de photoswitching gerekli olduğu tahmin olarak cihazı oluşturmak için en az sayıda LED ışıkları kullanın. </li></ol></li><li> cihazı bina NOT: Cihaz bir profesyonel işleme dükkanı, Freiburg Üniversitesi&#39;nden Arbeitsgruppe Technik tarafından yaptırılmıştır. Çoğu parça özel yapılmış ve piyasada mevcut değildir. Her bir parçanın tam boyutları, Şekil 1 ve 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu cihazın düzeneğinin açıklamak için, Ek Video 1 sağlanır ve en önemli adımlar aşağıda tarif edilmiştir. <ol><li> Şekil 1A gösterilen kesin ölçümler ile polivinil klorür (PVC) Mill parça A. </li><li> Parça A delinmiş deliklere LED ışıkları yerleştirin ve su sızıntısını önlemek için PVC yapıştırıcı ile her delik mühür. </li><li> Bir çok kanallı trafosuna LED&#39;leri bağlayın (her dalga boyu ayrı Chann işgal etmelidir0-29 mA ayarlanabilir çıkış gücüne sahip el). </li><li> fiziksel hasardan LED korumak için gösterildiği gibi parça A 3 vida ile dış kılıfı (B) takın. </li><li> Parça A delinmiş deliklere tüp klipleri (C) bir su pompası, tutkal cihazı bağlamak mümkün (Şekil 1a tasvir, kesit Y: 9 mm ve 61.5 mm) PVC yapıştırıcı kullanarak. </li><li> Bir 58.5 mm uzunluğunda pleksiglas tüp (D1) kesin. </li><li> Şekil 2&#39;de tasvir edildiği gibi Pleksiglastan adet D2 ve D3 imalatı. </li><li> Pleksiglas yapıştırıcı ile D1 altına Tutkal parçası D3. </li><li> parça D2 bir lastik O-ring takın ve pleksiglas yapıştırıcı ile D1 üstüne tutkal. NOT: adet D1, D2 ve D3 birlikte parça D formu </li><li> 3 vida ile parça A&#39;ya parça D yerleştirin. </li><li> transformatör güç uygulamadan önce su kaçağı cihazı test edin. </li></ol></li></ol> 2. Bir optogenetic Aracı Kinetiği Ölçme <ol&gt; <li> hücreleri hazırlayın <ol><li> RPMI-aracı madde içinde kültür Ramos B hücreleri (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FCS, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin, 100 U / ml streptomisin, 50 uM 2-merkaptoetanol) 3- yoğunluğunda 10 x 10 6 hücre / ml 37 ° C de ve% 5 CO2. </li><li> 350 xg 5 dakika boyunca 4 ° C&#39;de santrifüj ile hasat Ramos B hücreleri. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir Neubauer sayım odası kullanılarak hücrelerin sayısı ve 600 uL ortamında 1-5 x 10 6 hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Bir cam FACS tüpüne hücreleri aktarmak ölçüme kadar ışıktan buz üzerine koydu ve onları korumak. </li></ol></li><li> Flowsitometri ve cihazı hazırlayın. <ol><li> ısıtılmış su pompasına aygıtı bağlayın ve 37 ° C sıcaklığını ayarlamak. </li><li> Cam FACS tüpler kullanırken, sitometresinde bir lastik O-ring ile akış siyah O-ring değişimi ve buna ek olarak silikon gr uygulamakkolaylaştırmak. </li></ol></li><li> Ölçüm <ol><li> Dikkatle cihazın içine cam FACS tüp takın ve (Şekil 3) akış sitometresi bağlayın. </li><li> ölçümünü başlatmak ve Dronpa floresan yoğunluğu (GFP kanalı) kaydedin. </li><li> sırasıyla 400 nm veya 500 nm ışık ile hücre örneği aydınlatın ve Dronpa floresan (GFP kanalı) kaydedin. </li></ol></li><li> Veri analizi <ol><li> Yazılımın sitometresi uygun akış ile deneysel verileri analiz edin. yana dağılım ve kapısı canlı hücreler karşı komplo ileri dağılım. zamanla Dronpa floresan çizilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of intracellular signaling pathways.</a> Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+protein+clustering+and+signaling+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells.</a> Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).</li>
<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+transmembrane+receptors+through+optogenetic+Cry2+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering.</a> Nat Commun. 6, 6898(2015).</li>
<li>Strickland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TULIPs%3A+tunable%2C+light-controlled+interacting+protein+tags+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology.</a> Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nat Commun. 5, 4925(2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+photoactivatable+antigen+system+to+examine+B-cell+probing+termination+and+the+B-cell+receptor+sorting+mechanisms+during+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).</li>
<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

LED Thermo Akış bir akış sitometresinin içinde optogenetic araçları incelemek için yenilikçi bir cihazdır. Şimdiye kadar, optogenetic numuneler sadece mikroskopi lazerler veya el feneri cihazlarla 11,12 ile aydınlatılan edilmiştir. örnek el feneri açısı ve mesafeye bağlı olarak, aydınlatma miktarında önemli değişkenlik deneyler arasında bekleniyor. Ayrıca, tek bir kişi bir deney çalışabilir fenerleri sayısında bir sınır yoktur. Bu deneysel repertuar ve tekrarlanabilirlik kısıtlar....

Onlar yolları 1-4 sinyal kablolarını deşifre etmek için kullanılabilir, çünkü optogenetic araçlar kısmen, popülerlik kazanmaktadır. Işıkla aydınlatıldığında, kendi yapısını ve bağlanma afinitesini değiştirme fotoaktıfleştırılebılır proteinlerin yeteneğine dayanmaktadır. Sinyalizasyon elemanları bu proteinlerin kaynaştırarak karmaşık hücre içi sinyal yollarının 5-12 içinde tek bir oyuncunun belirli düzenlenmesi için izin verir. Sonuç olarak, bir sinyal yolu yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile ele alınabilir. Çoğu hücre bazlı Optogenetic çalışmalarda biyokimyasal analiz 11,12 ardından ışık varlığında kültürlenmesi ile birlikte mikroskopi dayalı yöntemler kullanmaktadır. Bunun aksine, akış sitometresi kılcal boyunca hücrelerin singularizes ve hücre boyutu, boyutu ve floresan yoğunlukları ölçülür. Bu yöntem thousan analiz yeteneği dahil olmak üzere mikroskopi veya biyokimyasal yöntemlerle üzerinde önemli avantajlara sahiptirÇok kısa bir süre içinde tek hücreli çözünürlükte yaşayan hücrelerin DS. Bu nedenle, akış sitometrisi ile optogenetics birleştirilmesi arzu edilir. Bildiğimiz kadarıyla, optogenetic flow sitometri için kurulan protokol yoktur. Bir yaygın olarak kabul prosedür el feneri cihazları ile reaksiyon tüpü dışından hücreleri aydınlatmaktır. Bununla birlikte, akış kılavuzu aydınlatma sitometresi canlı hücre görüntüleme, bir silindirik, ısıtılmış su odası, reaksiyon borusu içinden geçen ve ışık gerektirir. Bu önemli bir ışık saçılması ve ışık kaybına neden olur. Ayrıca, manuel aydınlatma tarafından sağlanan ışık yoğunluğu (vb açı, mesafe,) deneyler arasında tekrarlanabilir değildir ve bir deneyde dalga boylarının sayısı için pratik bir sınır yoktur. LED Thermo Akış cihazı inşa ederek, bu sınırlamaları aşmak için başardık. Bu cihaz sayesinde, hücreler, bir sıcaklığı belirli dalga boyları ile aydınlatılabilirkısa süreli olarak kontrol edilen akış sitometrik ölçümleri sırasında bir şekilde. Bu mesafede olan ve deneyler arasında ışık hassas ve tekrarlanabilir miktarda sağlar. In vivo olarak, bizim cihazın kullanılmasını göstermek için, photoswitching sırasında Ramos B hücrelerinde Dronpa floresan sinyali kaydedilmiştir. Ramos B hücreleri, bir insan Burkitt lenfoma türetilir. Dronpa bir monomer, dimer ya da tetramer olarak var olan bir fluoresan proteindir. monomerik formda, bu ışıltısızdır. 400 nm ışık ile aydınlatma dimerizasyonu ve tetramerizasyonu uyarır ve Dronpa protein floresan vermektedir. Bu süreç, 500 nm ışık ile aydınlatma ile ters olabilir. Dronpa protein proteinler 4,13 sinyal fonksiyonu ve yerini kontrol etmek için kullanılmaktadır. Burada, bir akış sitometresinde Dronpa arasında photoswitching çalışma Ramos B hücrelerinde Dronpa-Bağlayıcı-Dronpa proteini ifade etmiştir. Bizim cihaz kullanarak, başardık verimli vegerçek zamanlı olarak floresan yoğunluğu kayıt sırasında tekrarlanabilir Dronpa photoswitch. Bu yöntem, manuel aydınlatma ile mevcut aydınlatma protokolleri üzerinden önemli avantajlar sağlamaktadır ve önemli ölçüde optogenetic araçları ve kafes bileşikleri için deneysel repertuarı genişletir. önemli ölçüde basitleştirmek ve yeni Optogenetic araçlarının keşif ve gelişimini hızlandıracak bizim aygıtının kullanılması.

<table><tbody><tr><td>Cam FACS tüpü</td><td>Thermo Fisher Scientific; Waltham, ABD</td><td>14-961-26</td><td>Borosilikat cam tüpler 12x75 mm</td></tr><tr><td>Akış Sitometresi</td><td>BD Bioscienceg; Heidelberg, Almanya</td><td>Fortessa II</td><td>Özel Sipariş</td></tr><tr><td>Dronpa: pcDNA3-mNeptün2-N</td><td>Addgene; Cambridge, ABD</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, ABD</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 nm</td><td>Avago Teknolojileri; Boeblingen, Almanya</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 nm</td><td>Avago Teknolojileri; Boeblingen, Almanya</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>Pleksiglas tüp 15 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Almanya</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>Pleksiglas 3 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Almanya</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>Pleksiglas 2,5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Almanya</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>Pleksiglas 1,5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Almanya</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>PVC karo 5 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Almanya</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>PVC karo 6 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Almanya</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>PVC blok 50 mm</td><td>Maertin; Freiburg, Almanya</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Yaşam Teknolojileri; Darmstadt, Almanya</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>EMD; Almanya</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biyoteknoloji; Aidenbach, Almanya</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Strptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>İnvitrojen, Yaşam Teknolojileri; Darmstadt, Almanya</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acrifix pleksiglas yapıştırıcı</td><td>Evonic industries, Essen, Almanya</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Tangit PVC-U yapıştırıcı</td><td>Henkel, D&uuml; Sseldorf, Almanya</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

led thermo akışı - akım sitometrisi ile optogenetics birleştiren

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetik araçlar, karmaşık sinyal yolakları içindeki hemen hemen her sinyal molekülünün izole, işlevsel araştırmalarına izin verir. Önemli bir engel, ışığın hücre örneğine kontrollü bir şekilde verilmesidir ve bu nedenle optogenetik çalışmalar için en popüler araçlar mikroskopi tabanlı hücre analizleri ve in vitro deneylerdir. Akış sitometresi, tek hücre çözünürlüğünde binlerce hücreyi hızlı bir şekilde ölçme yeteneği de dahil olmak üzere mikroskoba göre büyük avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, optogenetikte henüz yaygın olarak kullanılmamaktadır. Burada, optogenetik ve akış sitometrisinin gücünü birleştiren bir cihaz sunuyoruz: LED Thermo Flow. Bu cihaz, akış sitometrik ölçümleri sırasında hücreleri belirli dalga boylarında, ışık yoğunluklarında ve sıcaklıklarda aydınlatır. Düşük maliyetle inşa edilebilir ve en yaygın akış sitometreleri ile kullanılabilir. Faydasını göstermek için, Dronpa proteinlerinin foto anahtarlama kinetiğini in vivo ve gerçek zamanlı olarak karakterize ettik. Bu protokol hemen hemen tüm optik olarak kontrol edilen maddelere uyarlanabilir ve olası deney setini önemli ölçüde genişletir. Daha da önemlisi, yeni optogenetik araçların keşfini ve geliştirilmesini büyük ölçüde basitleştirecektir.

Bir Akış Sitometre LED Thermo Flow kullanarak Cihazın bir işlevsel çekirdek ışıkları içe bakan dairesel bir biçimde düzenlenir LED silindirik bir bölme olabilir. Bu bölme ışıklarının sıcaklığı, hem de hücre örneği kontrol edilmesi için izin veren bir su ve pompa bağlanabilir. LED'ler bir transformatör bağlı ve dolayısıyla her dalga boyu için ışık yoğunluğu ayrı ayrı kontrol edilebilir. Cihazın merkezi çoğu standart akış sitometr...

Optik olarak kontrol edilen maddeler, sinyal yollarını incelemek için güçlü araçlardır. Olası deneylerin spektrumunu genişletmek için, akış sitometrisi kullanarak optik olarak kontrol edilen maddeleri gerçek zamanlı olarak incelemek için bir cihaz geliştirdik: LED Thermo Flow.

LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Bu yöntemin genel amacı, akış sitometrik ölçümleri sırasında optik olarak kontrol edilen maddeleri uyarmaktır. Bu yeni cihaz, optik olarak kontrol edilen maddelerin gücünü akış sitometrisi ile birleştirerek hücre sinyalizasyonu alanındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İlk kez, optogenetik araçlar akış sitometrisi kullanılarak karakterize edilebilir ve analiz edilebilir.Bugüne kadar karşılaştırılabilir yerleşik bir yöntem mevcut değildi. Başlamak için, transdüksiyona uğramış Ramos B lenfositlerini mililitrede bir milyon hücre konsantrasyonunda askıya alın ve bunları bir cam FACS tüpüne aktarın. Ardından, akış sitometresinin siyah O-halkasını kauçuk bir O-ring ile değiştirin ve daha iyi bir sızdırmazlık sağlamak için silikon gres uygulayın.Cam tüpü bir akış sitometresine yerleştirin ve LED prototipini ışıklar kapalıyken tüpün etrafına yerleştirin. GFP kanalındaki Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçün. Prosedürün en kritik adımı cam tüplerin işlenmesidir.Cam FACS tüpleri çok kırılgandır ve bu nedenle, deneyler yapmadan önce cam tüplerin sitometreye yerleştirilmesi tavsiye edilir. Ardından, tüpün dışındaki 500 nanometre LED ışığını açın ve Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçmeye devam edin. Dronpa-Linker-Dronpa proteininin foto geçişini ölçmek için gereken minimum ışık yoğunluğunu tahmin etmek için Dronpa floresan yoğunluğu azalana kadar LED ışıkların yoğunluğunu artırın.Ardından, tüpün dışındaki prototipin 400 nanometre LED ışığını açın ve Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçmeye devam edin. Dronpa floresan yoğunluğu artana kadar 400 nanometre LED ışıkların ışık yoğunluğunu artırın. Fotoğraf anahtarlama LED cihazının iç ve dış katmanlarını imal etmek için ekteki metin protokolündeki tasarım ve üretim talimatlarını izleyerek başlayın.400 ve 500 nanometre dalga boyundaki LED'leri cihazın kanallarına yerleştirin. Bunları yerlerine yapıştırın ve belirtildiği gibi bağlayın. Bu spesifik dalga boyları, Dronpa-Linker-Dronpa füzyon proteinlerini karanlık ve parlak durumları arasında değiştirmek için kullanılacaktır.Ardından, transformatörü çalıştırmadan önce sızıntıyı önlemek için cihazı monte edin ve su geçirmez olduğundan emin olun. Cihaz montajını takiben, Ramos B lenfositlerini hasat edin ve bunları mililitre başına üç ila on milyon hücre yoğunluğunda askıya alın. Hücrelerin 600 mikrolitresini bir cam FACS tüpüne aktarın.Onları buzun üzerine yerleştirin ve ölçülene kadar hücreleri ışıktan koruyun. Monte edilmiş cihazı ısıtılmış bir su pompasına bağlayın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, cam FACS tüpünü dikkatlice cihaza yerleştirin ve akış sitometresine bağlayın.Dronpa floresan yoğunluğunu GFP kanalına kaydedin. Bu optogenetik cihazların tasarımı, numunenin sıcaklığını sabit bir değerde tutmak için dolaşımdaki bir su kaynağına bağlanabilen bir oda içerir. Cihaz üç farklı dalga boyu yayarken, FACS örneğinde cihazdan 37 santigrat derece su akarken sadece marjinal bir sıcaklık artışı görüldü.Dronpa-Linker-Dronpa füzyon yapısı klonlandı ve Ramos B hücrelerine dönüştürüldü. 500 nanometrelik bir ışık kaynağı tarafından monomer durumuna yönlendirildiğinde, emisyon yoğunluğu azalır. Daha sonra, ışık kaynağı 400 nanometre ışığa geçtiğinde, Dronpa monomeri hızla dimer durumuna geçer ve yoğunluk hızla artar.Bu cihazı kullanarak, sitozolik Dronpa-Linker-Dronpa füzyon proteini birden çok kez foto-switch yapılabildi. Karanlık duruma geçiş yavaş gerçekleşirken, aydınlık duruma geçiş neredeyse anında gerçekleşir. Dronpa'nın karanlıkta spontan floresan geri kazanımı, parlak forma verimli foto geçişin özel bir aydınlatma gerektirdiğini ve sadece yavaş yavaş kendiliğinden gerçekleştiğini gösterir.Kinetik analiz, foto anahtarlama hızının genel olarak çok tekrarlanabilir olduğunu ve karanlıkta uzun bir inkübasyondan sonra bile, floresansın sadece yaklaşık yüzde onunun foto anahtarlama olmadan geri kazanıldığını göstermektedir. Bu prosedürü takiben, seçtiğiniz optogenetik aletin işlevselliğini keşfetmek için kalsiyum akışı ölçümleri de dahil olmak üzere herhangi bir akış sitometrik analizi gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, optogenetik alanındaki araştırmacıların hücre sinyal yollarının kablolarını keşfetmelerinin önünü açacaktır.Bu videoyu izledikten sonra, özel optogenetik aracınız için bir foto anahtarlama protokolünün nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. UV ışığının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

led-thermo-flow-combining-optogenetics-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, GFP eksprese eden transgenik farelerden elde edilen 3D bağırsak organoidlerindeki ROS seviyelerini ölçmek için bir akış sitometrisi testini göstermektedir. Bu yöntem, test bileşiklerinin ROS üretimi üzerindeki etkinliğini araştırmak için in vitro deneysel bir model sağlar.

Oksidatif Stresi Ölçmek için Akış Sitometrisi Deneyi: Florojenik Problar Kullanarak Bağırsak Organoidlerindeki Reaktif Oksijen Türlerini Ölçmek İçin Bir Test

Bu video, bir fare gözünde intravitreal doğumdan sonra floresan biyopartiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir. Akış sitometrisi, CD11b'yi eksprese eden canlı hücreleri tespit eder ve yeşil floresan sergileyen fagositik mikroglia hücrelerini, Ly6C eksprese eden monositler ve Ly6G eksprese eden nötrofiller dahil olmak üzere diğer miyeloid hücrelerden ayırır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

Video, biyolojik örneklerden izole edilen protein agregatlarının tohumlama aktivitesini tespit etmek için bir floresan rezonans enerji transferi (FRET) akış sitometrisi testini göstermektedir. Tau raportör proteinlerini eksprese eden memeli hücreleri, tau tohumları içeren lipozom transdüksiyon kompleksleri ile inkübe edilir. Bu tohumlar, raportör proteinlerin toplanmasına aracılık ederek akış sitometresinde bir FRET pozitif sinyalinin üretilmesine yol açar.

Tau-Tohum İndüklenen Raportör Protein Agregasyonunu Tespit Etmek için Bir FRET Akış Sitometrisi Tekniği

Bimoleküler Floresan tamamlama akış sitometrik analizi protein-protein etkileşimleri incelemek için bir yüksek kapasiteli nicel yöntem sağlar. Bu metodoloji, eşleme protein bağlama siteleri ve protein-protein etkileşimleri düzenleyen faktörler taranması için uygulanabilir.

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Biz tarafından salgılanan PSM ve diğer toksinlerin etkisini araştırmak için yöntemler...

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Bu protokol, ultrafast mikroakışkan akışta tek hücreli görüntüleme için asimetrik tespit zamanlı streç optik mikroskopi sisteminin uygulanmasını ve görüntüleme akış sitometrisi uygulamalarını anlatmaktadır.

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu optimize etmek için 3D baskılı bir LED dizisi kullanan yüksek verimli deneyler için bir yöntemi açıklamaktadır.

Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

Öğrenin optogenetik araçları akım sitometrisi ile karakterize etme yöntemini. Ramos B lenfositleri kullanarak hücre sinyalizasyonunu gerçek zamanlı analiz edin ve optik kontrollü maddeleri inceleyin.

LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren

Daha fazla video keşfet