LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren
December 30th, 2016
Optik olarak kontrol edilen maddeler, sinyal yollarını incelemek için güçlü araçlardır. Olası deneylerin spektrumunu genişletmek için, akış sitometrisi kullanarak optik olarak kontrol edilen maddeleri gerçek zamanlı olarak incelemek için bir cihaz geliştirdik: LED Thermo Flow.
Bu yöntemin genel amacı, akış sitometrik ölçümleri sırasında optik olarak kontrol edilen maddeleri uyarmaktır. Bu yeni cihaz, optik olarak kontrol edilen maddelerin gücünü akış sitometrisi ile birleştirerek hücre sinyalizasyonu alanındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. İlk kez, optogenetik araçlar akış sitometrisi kullanılarak karakterize edilebilir ve analiz edilebilir.
Bugüne kadar karşılaştırılabilir yerleşik bir yöntem mevcut değildi. Başlamak için, transdüksiyona uğramış Ramos B lenfositlerini mililitrede bir milyon hücre konsantrasyonunda askıya alın ve bunları bir cam FACS tüpüne aktarın. Ardından, akış sitometresinin siyah O-halkasını kauçuk bir O-ring ile değiştirin ve daha iyi bir sızdırmazlık sağlamak için silikon gres uygulayın.
Cam tüpü bir akış sitometresine yerleştirin ve LED prototipini ışıklar kapalıyken tüpün etrafına yerleştirin. GFP kanalındaki Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçün. Prosedürün en kritik adımı cam tüplerin işlenmesidir.
Cam FACS tüpleri çok kırılgandır ve bu nedenle, deneyler yapmadan önce cam tüplerin sitometreye yerleştirilmesi tavsiye edilir. Ardından, tüpün dışındaki 500 nanometre LED ışığını açın ve Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçmeye devam edin. Dronpa-Linker-Dronpa proteininin foto geçişini ölçmek için gereken minimum ışık yoğunluğunu tahmin etmek için Dronpa floresan yoğunluğu azalana kadar LED ışıkların yoğunluğunu artırın.
Ardından, tüpün dışındaki prototipin 400 nanometre LED ışığını açın ve Dronpa'nın floresan yoğunluğunu ölçmeye devam edin. Dronpa floresan yoğunluğu artana kadar 400 nanometre LED ışıkların ışık yoğunluğunu artırın. Fotoğraf anahtarlama LED cihazının iç ve dış katmanlarını imal etmek için ekteki metin protokolündeki tasarım ve üretim talimatlarını izleyerek başlayın.
400 ve 500 nanometre dalga boyundaki LED'leri cihazın kanallarına yerleştirin. Bunları yerlerine yapıştırın ve belirtildiği gibi bağlayın. Bu spesifik dalga boyları, Dronpa-Linker-Dronpa füzyon proteinlerini karanlık ve parlak durumları arasında değiştirmek için kullanılacaktır.
Ardından, transformatörü çalıştırmadan önce sızıntıyı önlemek için cihazı monte edin ve su geçirmez olduğundan emin olun. Cihaz montajını takiben, Ramos B lenfositlerini hasat edin ve bunları mililitre başına üç ila on milyon hücre yoğunluğunda askıya alın. Hücrelerin 600 mikrolitresini bir cam FACS tüpüne aktarın.
Onları buzun üzerine yerleştirin ve ölçülene kadar hücreleri ışıktan koruyun. Monte edilmiş cihazı ısıtılmış bir su pompasına bağlayın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, cam FACS tüpünü dikkatlice cihaza yerleştirin ve akış sitometresine bağlayın.
Dronpa floresan yoğunluğunu GFP kanalına kaydedin. Bu optogenetik cihazların tasarımı, numunenin sıcaklığını sabit bir değerde tutmak için dolaşımdaki bir su kaynağına bağlanabilen bir oda içerir. Cihaz üç farklı dalga boyu yayarken, FACS örneğinde cihazdan 37 santigrat derece su akarken sadece marjinal bir sıcaklık artışı görüldü.
Dronpa-Linker-Dronpa füzyon yapısı klonlandı ve Ramos B hücrelerine dönüştürüldü. 500 nanometrelik bir ışık kaynağı tarafından monomer durumuna yönlendirildiğinde, emisyon yoğunluğu azalır. Daha sonra, ışık kaynağı 400 nanometre ışığa geçtiğinde, Dronpa monomeri hızla dimer durumuna geçer ve yoğunluk hızla artar.
Bu cihazı kullanarak, sitozolik Dronpa-Linker-Dronpa füzyon proteini birden çok kez foto-switch yapılabildi. Karanlık duruma geçiş yavaş gerçekleşirken, aydınlık duruma geçiş neredeyse anında gerçekleşir. Dronpa'nın karanlıkta spontan floresan geri kazanımı, parlak forma verimli foto geçişin özel bir aydınlatma gerektirdiğini ve sadece yavaş yavaş kendiliğinden gerçekleştiğini gösterir.
Kinetik analiz, foto anahtarlama hızının genel olarak çok tekrarlanabilir olduğunu ve karanlıkta uzun bir inkübasyondan sonra bile, floresansın sadece yaklaşık yüzde onunun foto anahtarlama olmadan geri kazanıldığını göstermektedir. Bu prosedürü takiben, seçtiğiniz optogenetik aletin işlevselliğini keşfetmek için kalsiyum akışı ölçümleri de dahil olmak üzere herhangi bir akış sitometrik analizi gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, optogenetik alanındaki araştırmacıların hücre sinyal yollarının kablolarını keşfetmelerinin önünü açacaktır.
Bu videoyu izledikten sonra, özel optogenetik aracınız için bir foto anahtarlama protokolünün nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız. UV ışığının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman koruyucu gözlük gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, akış sitometrisi kullanılarak optik olarak kontrol edilen maddelerin gerçek zamanlı olarak çalışması için tasarlanmış yeni bir cihazı sunmaktadır. Araştırmacılar, optogenetik araçları akış sitometrik ölçümleri ile entegre ederek hücre sinyallemesindeki önemli soruları araştırabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre sinyallemesi
- Optogenetik
- Akış sitometrisi
Arka Plan
- Optik olarak kontrol edilen maddeler, sinyal yollarının incelenmesi için değerlidir.
- Akış sitometrisi, hücre popülasyonlarının analizini sağlar.
- Önceki yöntemler bu iki güçlü tekniği birleştirmedi.
- Bu çalışma, bu entegrasyonu sağlayan bir cihazı tanıtmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Akış sitometrik ölçümler sırasında optik olarak kontrol edilen maddeleri uyarmaktır.
- Akış sitometrisi kullanarak optogenetik araçları karakterize etmek ve analiz etmek.
- Hücre sinyallemesini araştırmak için yeni bir yöntem sağlamaktır.
Kullanılan Yöntemler
- Transdüklenmiş Ramos B lenfositlerini bir miliyon hücre/mililitre konsantrasyonunda süspanse etti.
- Hücreleri bir cam FACS tüpüne aktarıyor.
- Akış sitometresinin siyah O-halkasını kauçuk bir O-halka ile değiştirdi.
- Daha iyi bir sızdırmazlık sağlamak için silikon gres uyguladı.
Ana Sonuçlar
- Cihaz, optogenetik stimülasyonu akış sitometrisi ile başarıyla entegre ediyor.
- Hücre sinyal yollarının gerçek zamanlı analizini sağlar.
- İlk kez optogenetik araçların karakterize edilmesini sağlar.
- Hücre sinyallemesini incelemek için mevcut metodolojilerdeki bir boşluğu giderir.
Sonuçlar
- Bu yeni cihaz, hücre sinyallemesinin çalışmasında önemli bir ilerlemeyi temsil ediyor.
- Optik olarak kontrol edilen maddeler kullanarak araştırma için yeni yollar açıyor.
- Gelecekteki çalışmalar bu yöntemi kullanarak karmaşık sinyal yollarını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Integrating optogenetic control with flow cytometry enables real-time, single-cell resolution analysis of signaling dynamics, addressing a critical gap in mechanistic de-risking for target validation. This approach enhances predictive confidence by allowing quantitative, reproducible assessment of photoswitching kinetics in live cells, supporting early discovery decisions. The low-cost, adaptable design facilitates enterprise reuse across optogenetic tool development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time photoswitching of optogenetic tools in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative fluorescence readouts to clarify pathway dynamics and reduce mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by characterizing optogenetic tool performance under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible optogenetic control.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise light intensity, wavelength, and temperature control during flow cytometric measurements.
- Scalability: Supports high-throughput analysis of thousands of cells per second, facilitating screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase optogenetic characterization to preclinical validation by enabling functional assessment in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows exploration of optogenetic tool functionality in complex signaling pathways, reducing late-stage biological risk.
- Predictive Confidence: Generates quantitative kinetic data to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis testing and assay readiness for optogenetic tool evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing real-time manipulation and measurement of optically controlled substances in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible photoswitching measurements at single-cell resolution.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence intensity readouts and kinetic analysis to compare conditions and assess tool performance.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by characterizing optogenetic tools in a flow-compatible, physiologically relevant format.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, low-cost platform adaptable to diverse optogenetic tools and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in optogenetic tool function, reduction of mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of photoswitching measurements across cell populations.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in tool development, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of optogenetic candidates based on quantitative kinetic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, flow cytometry, and basic device assembly.
- Needs access to a flow cytometer, LED light sources, and temperature control via water pump.
- Demands cross-team standardization for consistent light delivery, temperature control, and sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, optogenetic tools, and wavelength requirements.
- Includes practical limitations such as glass tube fragility and UV light hazards requiring protective measures.
