Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Bu fare genetik modifikasyon prosedürünün genel amacı, IL-22 üreten bağışıklık hücrelerini tanımlamak, saflaştırmak ve karakterize etmektir. Bağışıklık sistemi hücreleri, bizi bakteri gibi yabancı maddelere karşı savunmak ve hasarlı dokuları restore etmekten sorumlu olan sitokin adı verilen aracıları serbest bırakır. IL-22 böyle bir sitokindir ve doku onarımından patolojiye kadar birçok aktivite atfedilmiştir.

Ve bağışıklık sistemindeki bir dizi farklı hücre tipinin bunu üretebildiği bildirilmiştir. Bu nedenle, hangi hücrelerin gerçekten IL-22 ürettiğini açıklığa kavuşturmak için yeni bir IL-22 raportör faresi geliştirdik. Bu, ilgili IL-22 üreticilerini in vivo olarak normal koşullar altında farelerde ve inflamatuar bir bağırsak hastalığı modelinde tanımlamamızı sağladı.

Ayrıca, diğer özelliklerini belirlemek için IL-22 ekspresörlerini saflaştırmak için raportör hücreleri kullandık. Raportör fare oluşturma yöntemi kısaca özetlenmekte ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, ekspresörleri tanımlamak ve daha fazla karakterizasyon için canlı eksprese eden hücreleri saflaştırmak amacıyla diğer genlere uygulanabilir.

Bu yöntem, immünoloji alanında IL-22'nin biyolojik aktiviteleri ve onu üreten hücrelerin özellikleri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Prosedürü benimle birlikte göstermek, bir biyolog olan Julie Hixon, bir doktora sonrası Caroline Andrews ve Dr. Durham'ın laboratuvarından bir personel bilim adamı olan Wenqing Li olacak. tdTomato raportör genini bir mekik vektörüne yerleştirdikten sonra, GFP genini aynı bölge içinde değiştirdikten sonra, A ve B homoloji kutularını 50 mikrolitrelik bir PCR reaksiyon sisteminde IL-22'nin ilk çevrilmiş ekzonuna yükseltmek için uygun bakteriyel yapay kromozomu veya BAC şablonunu kullanın.

Daha sonra saflaştırılmış vektörleri 37 santigrat derecede kloramfenikol ve ampisilin içeren Luria-Bertani veya LB agar plakaları üzerinde BAC yetkin bakteri hücrelerine dönüştürün. Kuluçka süresinin sonunda, 37 santigrat derece ve 225 rpm'de kloramfenikol ile takviye edilmiş bir mililitre LB suyunda iki ila üç koloniyi aşılayın. Bir saat sonra, her karışımdan 100 mikrolitreyi, 37 santigrat derecede bir gece kültürü için kloramfenikol ve sükroz ile takviye edilmiş bir LB agar plakasına yayın.

Ertesi sabah, büyük kolonileri kloramfenikol içeren yeni bir LB agar plakasına ve küçük kolonileri başka bir LB agar plakasına yeniden plakalayın ve plakaları 30 saniye boyunca UV ışığına maruz bırakın. Daha sonra UV'ye duyarlı bir koloni seçin ve PCR ile modifiye edilmiş BAC DNA'nın varlığını doğrulamak için bir tdTomato IL-22 heterozigot primer kullanın. Dalak ve timusu çıkardıktan sonra, ince bağırsağın duvarına yakın inci beyazı mezenterik lenf düğümlerini toplamak için ince uçlu tırtıklı diseksiyon forsepsleri kullanın.

Ardından, tüm ince bağırsağı ve kolonu çıkarın ve bağırsak boyunca genişletilmiş oval Peyer yamalarını çıkarmak için makas kullanın. Tüm lenf dokuları toplandığında, mezenterik lenf düğümlerini ve Peyer yamalarını, buz üzerinde FBS ile desteklenmiş PBS'de iki buzlu slayt arasında bir araya getirin. Aynı şekilde bireysel dalak ve timus tek hücreli süspansiyonlar ürettikten sonra, dalak hücrelerini santrifüjleyin ve ardından bir mililitre ACK Lysing Buffers dalağı ile splenik Kırmızı Kan Hücresi Lizizini takip edin.

Bir dakika sonra, dokuz mililitre PBS ile izotonisiteyi geri yükleyin ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. Peleti beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin ve hücreleri 100 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve tripan mavisi dışlaması ile sayım için peleti beş mililitre RPI ortamında yeniden süspanse edin.

İnce bağırsağı duodenumdan ileuma kadar tüm kolonla birlikte çıkardıktan sonra, fazla yağ ve mezenterik dokuyu bağırsaktan çıkarmak için forseps kullanın ve bağırsak dokusunu hemen buz gibi soğuk PBS'ye yerleştirin. Peyer yamalarını ince bağırsağın distal bölgesi boyunca hasat etmek için forseps kullanın. Daha sonra bağırsağı uzunlamasına açmak için makas kullanın ve dokuyu 10 mililitre buz gibi PBS ile iyice yıkayın.

Numuneyi, 37 santigrat derece ve 50 rpm'de 30 dakikalık iki inkübasyon için 20 mililitre ön sindirim tamponuna aktarın, dokuyu 12.000 rpm'de 30 saniye boyunca girdaplayın, dokuyu 12.000 rpm'de 30 saniye boyunca vorteksleyin ve tüm parçaları 100 mikronluk bir hücre süzgecinden presleyerek her inkübasyonun sonunda epitel hücre tabakasını toplayın. Daha sonra, 37 santigrat derecede çalkalanarak 30 dakikalık bir inkübasyon için hücre bulamacına 20 mililitre taze EDTA çözeltisi ekleyin, inkübasyonun sonunda bağırsak epitel hücrelerini az önce gösterildiği gibi filtreleyin ve soğutun. Kalan bağırsak parçalarını buzun üzerine yerleştirin ve havuzlanmış bağırsak epitel hücrelerini santrifüjleme ile toplayın, ardından FBS ile takviye edilmiş 10 mililitre HBSS'de yıkayın.

Yıkanmış peleti sekiz mililitre %44 kolloidal silika ortamında yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu beş mililitre %67 kolloidal silika ortamı ile kaplayın. Hücreleri santrifüjleme ile ayırın ve hücre ayırma ortamının ilk beş mililitresini çıkarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra hücreleri arayüzde toplayın ve bağırsak epitel hücrelerini 10 mililitre RPMI ortamında yıkayın, peleti beş mililitre taze RPMI'de yeniden süspanse edin.

Az önce gösterildiği gibi IL-22 td-Domates farelerinden tek dalak hücreli süspansiyonları hazırladıktan sonra. Hücreleri steril PBS'de mililitre konsantrasyonunda bir kez 10 ila yedinci hücrelerde yeniden süspanse edin ve CD4 pozitif T hücrelerini saflaştırmak için fare CD4 hücre negatif izolasyon yöntemini kullanın. Daha sonra, T hücrelerini dört santigrat derecede 30 dakika boyunca anti-CD4 ve anti-CD45RB antikorları ile etiketleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve ardından FBS ile takviye edilmiş iki mililitre PBS'de bir yıkama yapın. Yıkanmış peleti bir mililitre taze PBS ve FBS içinde yeniden süspanse edin ve etiketli T hücrelerini CD4 ve CD45RB birlikte ekspresyonlarına göre akış sitometrisi ile sıralayın. Tüm hücreler sıralandığında, bunları santrifüjleme ile toplayın ve hücrelerin RAG1 nakavt fare alıcılarına enjeksiyonu için peleti steril PBS'de mililitre başına 10 ila altı hücre konsantrasyonunda bir kez yeniden süspanse edin.

Murin IL-22 raportörünü oluşturmak için, aynı zamanda pozitif bir seçim markörü ve bir kloramfenikol antibiyotik direnç geni içeren IL-22 çekirgesini taşıyan bakteriyel bir yapay kromozomu modifiye etmek için transgen yeniden birleştirme kullanıldı. tdToma'yı ekson1'e soktuktan sonra, sinyal peptit dizisi bozuldu, tdTomato raportörünü IL-22 eksprese eden hücrelerin içine hapsetti ve akış sitometrisi ile tespit edilmelerini ve izolasyonlarını sağladı. IL-22 raportörlerinin doğruluğunu test etmek için, in vitro olarak üretilen splenositler, hem akış sitometrisi hem de floresan mikroskobu ile görülebilen IL-22 tdTomato ekspresyonu ile Th22 veya nötr koşullar altında kültürlenebilir.

İn vivo, IL-22 raportörleri, homeostatik koşullar altında farklı fare dokularında tespit edildi, sinyalin çoğu bağırsaktan gelen lamina propria hücrelerinde gözlendi, ancak aksiller lenf nodu, dalak veya timusta gözlenmedi. Raportör CD4 pozitif CD45RB yüksek T hücrelerinin RAG1 nakavt farelere aktarılmasıyla indüklenen bir fare kolit modelinde, tdTomato raportörleri ilk olarak mezenterik lenf düğümlerinde görselleştirilir, ancak nihai birikimleri distal ince bağırsak ve kolon dokularının lamina propriasında görülür. Bu prosedürü denerken, doğru BAC klonunu seçmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, IL-22'nin konak savunması ve doku onarımındaki rolü hakkında ek soruları yanıtlamak için bu raportör fare kullanılarak akciğer veya cilt enfeksiyonu modellerinin oluşturulması gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, bunun gibi bir fare modeli kullanarak düşük bir ifade gösteren salgılanan proteinlerin işlevini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, transgenik bir raportör farenin nasıl oluşturulacağını ve IL-22 raportör genlerinin in vitro ve in vivo olarak nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.