Name: Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Öğrenin farelerde IL-22 üreten bağışıklık hücrelerini görselleştirmek için transgenik raportör fare modelini kullanmayı. Bu yöntem, sitokin üretimini in vivo izlemeye ve immün yanıtları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Hayvan teknik yardımı için Kelli Czarra ve Megan Karwan'a, akış sitometrisi yardımı için Kathleen Noer ve Roberta Matthai'ye ve patoloji analizi için Donna Butcher ve Miriam R. Anver'a teşekkür ederiz. Bu proje, Ely ve Edythe Broad Vakfı'ndan (Scott Durum'a) bir hibe ile desteklenmiştir ve tamamen veya kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden federal fonlarla Sözleşme No. kapsamında finanse edilmiştir. HHSN261200800001E (MRA).

Bütün hayvanlar Bakım ve Kanser Araştırma Frederick Ulusal Laboratuvarı Laboratuvar Hayvanları Komitesi Kullanım 2011 Kılavuzu&#39;nda belirtilen deneysel prosedürlere uygun olarak uygun bakım aldı. BAC Recombineering ile IL-22-tdTomato Raportör 1. Farelerin Üretimi NOT: fareler bilinçsiz olmalı ve bir uyarana karşı tepki olarak hareket etmezler. % 70 etanol ile cerrahi alan sterilize ve bir cam boncuk sterilizatör kullanan tüm cerrahi aletler sterilize edin. <ol><li> Bir alkalin ekstraksiyon yöntemi 10, 11 kullanılarak BAC DNA (RP23-401E11, klon uzunluğu 228.391 bps) arındırın. hedef genin doğru boyutu onaylamak için RP23-401E11 5 ug Spel sindirimi ile BAC klonu karakterize eder. NOT: BAC DNA 14 parça halinde sindirildi. </li><li> PLD53SC-A-GFP-B mekik vektörüne Not I / Sal I mevkisine tdTomato raportör gen eklemek11 ve aynı siteye GFP geninin değiştirin. Daha sonra, bir şablon olarak BAC RP23-401E11 kullanılarak, ilk çevrilen ekson homoloji kutularının (A ve B) amplifiye IL-22 (ekson 1) PCR (95 ° C&#39;de 2 dakika ile; 30 dakika süre ile 95 ° C&#39;de 30 döngü sn, 30 saniye için 55 ° C ve 30 saniye için 72 ° C, ve 10 dakika süreyle 72 ° C&#39;de son uzatma). 50 ul PCR reaksiyon sisteminde, ilave 50 ng (1 uL) BAC DNA, primerler, 0.5 ul (10 uM), PCR Supermix yüksek aslına uygunluk 40 ul ve H2O 8 ul 5&#39;T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG ve Ters: İleri Bir kutu NOT: aşağıdaki gibi A ve B kutuları için primerler olan 5&#39;CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; İleri B kutusu: 5&#39;G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA ve Ters: 5&#39;T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. sınırlama enzimleri (Asc I ve Pac I) siteleri altı çizilmiştir. </li><li> Artan I-sindirilmiş A 500 ng ve Pac I-sindirilmiş B fragmanının 500 ng Arterhastalar, 1 saat boyunca 16 ° C&#39;de PLD53SC-ATB (tdTomato) vektörü, 50 ng halinde. </li><li> 37 ° C &#39;de, kloramfenikol (20 ug / ml) ve ampisilin (30 ug / ml) ile agar plakaları Luria-Bertani (LB) BAC-kompetan hücreler 11 ve kültür bunların saflaştırılmış PLD53SC-ATB vektör dönüşümü. İki ya da üç koloniler seçin Ch / Amp master plakalardan eş-entegre. </li><li> 20 ug / ml kloramfenikol ile takviye edilmiş LB 1 ml her bir koloni inoküle ve 37 ° C&#39;de 1 saat ve 225 rpm&#39;de için inkübe. LB-agar plakası üzerine her karışımın 100 ul yayılması (Peptone 140 10 g, maya özütü, ağar, 12 g ve 1 L su içinde 5 g; pH 7.5) kloramfenikol ve sükrozun 4-4.5% ile takviye edilmiştir. 37 ° C&#39;de gece boyunca kültür inkübe edin. </li><li> hem büyük ve küçük koloniler seçin ve kloramfenikol ile iki LB-agar plakaları bunları replate. Daha sonra da 30 saniye süre ile, UV ışık olmadan da plakalar ortaya çıkarmak ve daha fazla analiz için UV duyarlı koloniler. </li><li> tdTomato / IL-22 heterozigot primer kullanılarak PCR ile modifiye BAC DNA tespit (İleri: 5 &#39;ACT TGT gCg ATC TCT gat GGT; Ters: 5&#39; TGT AAT CGG ggA TGT CGG C). Termosikler koşulları aşağıdaki gibi olan: 2 dakika boyunca 95 ° C; 30 saniye, 30 saniye için 56 ° C, ve 30 saniye süreyle 72 ° C&#39;de, 95 ° C&#39;de 30 döngü; ve 10 dakika süreyle 72 ° C&#39;de son uzatma. </li><li> Büyük hazırlık BAC DNA 12 direkt BAC dizileme ile BAC modifiye alanının dizisi onaylayın. </li><li> yalancı gebelik olan C57BL / 6C farelere mikro-enjekte zigotların implantasyonu sırasında periton boşluğuna% 0.25 tribromoethanol bir dozu ile bir alıcı fare anestezisi. </li><li> IL-22-tdTomato BAC reaksiyon sisteminin 100 ul kısıtlama endonucleasePi-SceI 5 ul ile sindirme ile (10 ug) oluşturmak ve pronükleer aşama 13 de, C57BL / 6 kadın döllenmiş yumurta içine doğrusallaştırılmış BAC DNA Microinject linearize. ScreStandart prosedürler kullanılarak, kuyruk biyopsilerinden izole edilmiş DNA&#39;nın Southern blot analizi ile transgenik fareler en. </li></ol> Dalaklar, Timus, lenf nodu ve Peyer Patch 2. Tek hücreli Hazırlık Not: IL-22-tdTomato raportör farenin Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI, Frederick, MD) tutuldu. Ötenazi yöntemi Ötenazi En son AVMA talimatlara uygundur. Tüm fareler CO2 inhalasyon 14 kullanılarak ötenazi uygulandı. <ol><li> CO 2 odasında bir IL-22-tdTomato fare Euthanize ve temiz bir ped üzerine koydu. % 70 alkol püskürtülerek karın cildi sterilize ve açık kesti. soldan, dalak ve sternum arkasında timus çıkarın. </li><li> mesentericlymph düğümleri (mezenterik dokusunda bulunur) ve (ince bağırsak ileum bölgede küçük lymphoidnodules) Peyer yamaları hasat, inci beyazı mezenterik t yakın düğümleri almakvücut dışına bütün ince bağırsağı ve kolon kaldırmak sonra ilk ince nokta tırtıklı ipuçları forseps incelemek ve kullanma ince bağırsağın o duvarı. gut boyunca uzatılmış oval lekeler (Peyer yamaları) Bul ve makasla kesti. PBS /% 1 fetal inek serumu (FBS), buz üzerinde tampon içinde tek bir hücre süspansiyonu içine tek tek, iki buzlu slaytlar arasında bu lenfoid dokulardan (lenf düğümleri ve Peyer yamaları) öğütün. </li><li> Adım 2.2 ile aynı yöntemi kullanarak dalak veya timus dokuları kıyma. 500 x g&#39;de 8 dakika 4 ° C dalak süspansiyon santrifüjleyin. Hücre peletlere dalak başına ACK yokedici tampon 1 ml. </li><li> İyice karıştırın ve onları 1 dakika boyunca bekletin. Her bir örnek için steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS), tampon 9 ml ekleyin. Kırmızı kan hücreleri çıkarmak için 500 x g ve 4 ° C&#39;de 8 dakika için santrifüjleme ile dönerler. NOT: timus hücreleri ACK parçalama tampon katmayın. </li><li> PBS ve p 5 ml elde lökositlerin yeniden süspanse100 mikron hücre süzgecinden hücreleri ass. 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj ile hücre pelletleri toplayın. </li><li> RPMI ortam veya FACS tampon, 5 ml hücrelerin tekrar ve% 0.4 tripan mavi boya / PBS çözeltisi kullanılarak canlı hücreler sayılır. </li></ol> Barsaklardan İntraepitelyal lenfositler ve Lamina Propria Hücreleri 3. İzolasyon <ol><li> Sağ anüs üzerinde, (yakın ekine) ileum ve tüm kolon duodenum dan (bir sonraki mide), adım 2.1 gibi karın cildi açın ince bağırsak kesti. Ekstra adipoz ve mezenterik doku kullanarak forseps çıkarın. buz soğukluğunda PBS hemen bağırsak koyun. </li><li> ince bağırsağın distal bölge boyunca Peyer yamaları (küçük, sert nodüller) arayın. forseps andopen makas kullanılarak uzunlamasına bağırsak kullanarak kitleleri çıkarın. İyice buz soğukluğunda 10 ml PBS ile bağırsak yıkayın. </li><li> Ön sindirim tamponu (5 mM EDTA, 20 ml doku inkübeve bir çalkalayıcı yavaş dönme (50 rpm) 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)) içinde 1 mM ditiotreitol. 2 inkubasyon her birinden sonra, yoğun vorteks (12,000 rpm&#39;de 30 sn) tarafından, intraepitelyal lenfositler (IELS) içeren epitel hücre tabakasını kaldırmak ve 100 mikron hücre süzgecinden tüm dokuları geçmektedir. </li><li> 37 ° C&#39;de 30 dakika süre ile ikinci bir inkübasyon için dokuya yeni bir EDTA çözeltisi 20 ml ekleyin. 100 mikron hücre süzgecinden IEL kesirler geçirin ve önceki fraksiyonları ile havuz. buz üzerinde kalan bağırsak parçaları tutmak adım 3.9 tedavi edilmesi. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de toplanmış IEL fraksiyonlar santrifüjleyin. HBSS /% 5 FBS, 10 ml ile bir yerde toplanır IEL su fraksiyonları ile 800 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C aşağı döndürün. </li><li> % 44 koloidal silis ortamı 15 8 mL hücrelerin tekrar ve 5 ml 67% koloidal silis ortamı ile kapla. % 44/67 santrifüjOda sıcaklığında 20 dakika 1500 x g .5% hücre karışımı gradyanı. </li><li> arayüzünde gruptan IEL hücreleri toplamak. İlk olarak, 1 mL pipet kullanılarak süpernatan (yaklaşık 5 mi) üst tabakayı kaldırmak. Sonra, kolloidal silika orta degrade interfaz hasat IELS. </li><li> RPMI ortamında 10 ml ekleyerek IELS yıkayın. 800 x g&#39;de 5 dakika ve 4 ° C hücreleri aşağı doğru döndürün. Adım 3.15 RPMI 5 ml IELS süspanse edin. </li><li> Lamina propriya lenfositlerinin izolasyonu (LPLs) için (1 mm) bir makas kullanılarak küçük parçalar halinde adım 3.4 bağırsak doku parçaları kıyma ve (kollajenaz 0.05 g, DNasel 0.05 g sindirim tamponu 10 ml parçalar sindirmek, ve 37 ° C&#39;de 15-20 dakika boyunca RPMI /% 5 FBS içinde dispase II) 0,3 gr. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden karışımı Filtre. akış süpernatant serbest LPL içerir. </li><li> Tamamen normal (adımları 3.9-3.10 tekrarlayarak bağırsak parçaları sindirmek, onlar olmalı) 3 kez tekrar edilmiştir. Her zaman, LPLs içeren süpernatantlar havuz. </li><li> 1,500 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj ile hücreler toplamak ve RPMI /% 5 FBS içinde tekrar süspansiyon pelet. 40 mikron hücre süzgecinden onları geçmek. </li><li> Bir 40:80 koloidal silis, orta gradyanı% 40 fraksiyonunun 10 ml hücre pelletleri yeniden süspanse edin ve 15 ml&#39;lik bir tüp içinde 80% fraksiyon 5 ml ile kapla. </li><li> 1,500 xg ve oda sıcaklığında 15 20 dakika boyunca santrifüj ile yoğunluk gradyan ayırma gerçekleştirir. </li><li> Adım 3.7&#39;de tarif edildiği gibi, LPLs toplayın. 10 ml PBS ile bir kez yıkayın ve PBS /% 1 FBS tampon ya da RPMI ortamı, 1 ml pelet tekrar süspansiyon. </li><li> % 0.4 tripan mavi boya / PBS çözeltisi kullanılarak canlı hücreleri (IELS ve LPLs ikisi) sayın. </li></ol> Kolit, IL-22-tdTomato 4. ekspresyonu <ol><li> 1 x 10 bir konsantrasyonda IL-22-tdTomato farelerden tek dalak hücre süspansiyonları hazırlamak &lt;destek&gt; 7 hücreleri adımda 2.1-2.4 tarif edildiği gibi steril PBS / ml. </li><li> Fare CD4 hücre Negatif İzolasyon yöntemi 10 kullanılarak CD4 + T hücreleri arındırmak. Ve anti-CD45RB-FITC (klon 16A (PBS /% 1 FBS tamponu içinde, klon RM4-5 0.5 ul / 1 x 10 6 hücre), anti-CD4-APC ile PBS içinde 0.5 ml / 1 x 10 6 hücre etiketlemek 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübasyon ile /% 1 FBS tamponu). </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika ve 4 ° C hücreleri aşağı doğru döndürün. PBS /% 1 FBS tamponu, 2 ml hücreleri yıkayın ve PBS /% 1 FBS lekeleme tampon maddesi 1 ml bunları tekrar süspansiyon. </li><li> Makinenin 16 sitometri bir akış etiketli T hücrelerini çalıştırın. Kapısı T-hücre popülasyonu üzerindeki hücreler ve sıralama CD4 + CD45RB yüksek çift pozitif hücreler (488 nm ve 633 nm lazerler tespit dalga boyu). </li><li> 500 x g&#39;de 5 dakika 4 ° C&#39;de santrifüj ile kriteri hücreler hasat edilir. 1 x 10 6, steril PBS tamponunda yeniden süspanse hücre pelletleri </sup&gt; hücre / ml. / - - Alıcı fare Rag1 ¬ lerde periton içine hücreleri (0.5 x 10 6) enjekte edilir. </li><li> Çeşitli zaman noktalarında CO 2 altında alıcı fareler Kurban. adımlarda 2.1 ve 2.2 açıklandığı gibi, mezenterik lenf nodları ve küçük ve büyük bağırsakları hasat. dokuları düzeltmek için bir gecede, her mezenterik lenf düğümü koyun ve kesme açık bağırsağa (kağıt / bağırsak / kağıt sandviç)% 4 paraformaldehid (davlumbaz altında ele PFA). 16-24 saat süreyle% 18 sakaroz ile PFA değiştirin ve sonra kesit için dokular dondurma. </li><li> Doku 17, 18, 19 kesmek için kriyostat makinesi kullanın. yaklaşık 60 dakika boyunca oda sıcaklığına kadar doku bölümleri ısıtın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca aseton içinde yerleştirin. yaklaşık olarak 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya. </li><li> , Aşan FBS ekle pipet çıkarın ve 1 anti-RFP ekleyin: 200 seyreltme 0.1% BSA / 1x PBS. 60 dakika boyunca 37 ° C &#39;de antikor inkübe edin. </li><li> 10 dakika süre ile 1 x PBS bölümleri durulayın ve doku tekabül eden ikincil antikor (keçi anti-tavşan 568) uygulanır, suyla 1: 300,% 1 BSA / 1X PBS, oda sıcaklığında 30 dakika karıştırıldı. </li><li> 10 dakika 1x PBS slaytlar durulayın onları kuru silin ve lamelleri ekleyin. </li><li> 40X objektif kullanılarak: (uyarma filtresi 540-580 nm RFP) tutarlı aydınlatma altında bir floresan mikroskop ile tüm örnekleri gözünüzde canlandırın. </li></ol>

<ol><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+IL-23+receptor+gfp+reporter+mice+reveal+distinct+populations+of+IL-17-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells.</a> J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).</li>
<li>Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marking+and+quantifying+IL-17A-producing+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo.</a> PLoS One. 7, e39750(2012).</li>
<li>Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+interleukin-10+in+intestinal+lymphocytes+detected+by+an+interleukin-10+reporter+knockin+tiger+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse.</a> Immunity. 25, 941-952 (2006).</li>
<li>Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+patrol%3A+regulation+of+immunity%2C+inflammation+and+tissue+homeostasis+at+barrier+surfaces+by+IL-22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22.</a> Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).</li>
<li>Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor+%28IL-TIF%29%2C+a+novel+cytokine+structurally+related+to+IL-10+and+inducible+by+IL-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9.</a> J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).</li>
<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+natural+killer+cell+subset+provides+an+innate+source+of+IL-22+for+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity.</a> Nature. 457, 722-725 (2009).</li>
<li>Sanos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+and+commensal+microflora+are+required+for+the+differentiation+of+mucosal+interleukin+22-producing+NKp46%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells.</a> Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mazzucchelli, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+identification+of+IL-7+producing+cells+in+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice.</a> PLoS One. 4, e7637(2009).</li>
<li>Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22-Expressing+Murine+Lymphocytes+Display+Plasticity+and+Pathogenicity+in+Reporter+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice.</a> Front Immunol. 6, 662(2015).</li>
<li>Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+%28BACs%29+using+novel+shuttle+vectors+containing+the+R6Kgamma+origin+of+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication.</a> Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).</li>
<li>Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+modify+BACs+to+generate+large+recombinant+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments.</a> Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).</li>
<li>Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic mice.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11(2009).</li>
<li>Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+and+practical+implications+of+using+carbon+dioxide+mixed+with+oxygen+for+anesthesia+or+euthanasia+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).</li>
<li>Omata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+coccidian+enteroepithelial+stages+of+Toxoplasma+gondii+from+the+intestinal+mucosa+of+cats+by+Percoll+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation.</a> Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).</li>
<li>Kumar, N., Borth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometry+and+cell+sorting%3A+an+efficient+approach+to+investigate+productivity+and+cell+physiology+in+mammalian+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories.</a> Methods. 56, 366-374 (2012).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991(2008).</li>
<li>Hilbe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+automated+cellular+imaging+system+and+manual+microscopy+for+immunohistochemically+stained+cryostat+sections+of+lung+cancer+specimens+applying+p53%2C+ki-67+and+p120%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120.</a> Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).</li>
<li>Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+porcine+trappin-2+%28SKALP%2Felafin%29+in+trachea+and+large+intestine+by+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry.</a> Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).</li>
<li>Wolk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+increases+the+innate+immunity+of+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IL-22 increases the innate immunity of tissues.</a> Immunity. 21, 241-254 (2004).</li>
<li>Brand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+is+increased+in+active+Crohn%27s+disease+and+promotes+proinflammatory+gene+expression+and+intestinal+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).</li>
<li>Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+activates+STAT3+and+induces+IL-10+by+colon+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells.</a> Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).</li>
<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Andoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22%2C+a+member+of+the+IL-10+subfamily%2C+induces+inflammatory+responses+in+colonic+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).</li>
<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75, 274-282 (1993).</li>
<li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+the+intestine%3A+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li>
<li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

IL-22 doğal konukçu savunma ve dokuların yeniden yapılandırılmasında önemli bir rol oynar. IL-22 üreten hücreler hücre içi boyama ile ex vivo olarak tespit edilmiştir. Ancak, hala normal durumda ya da iltihabi durumların ya, in situ, IL-22 ifadesini izlemek için zordur. Bu protokol, in vivo olarak raportör-ifade eden hücreleri lokalize sağlıyor bir IL-22 raportör fare modeli geliştirmek için yeni bir metot açıklanır. haberci gen kodlayan tdTomato sinyal dizisini bozan bir bölgede IL-22 lokusun...

haberci genlerin hücre tipi spesifik ifade aktif homeostatik ve tedirgin halleri altında dokularda hedef ifade eden hücreleri belirlemek için yararlıdır. Bu ayrıca diğer özelliklerini incelemek için, canlı kalır, bu hücrelerin, saflaştırılması için izin verir. Raportör farenin özgü sitokinlerin transkripsiyon faktörleri ve düzenleyici elemanlar için eylem mekanizmasını açıklamaya kullanılabilecektir. Önceki stratejiler 1, 2, 3, büyük ölçüde fare kromozomu, zaman alıcı ve masraflı prosedürde hedef yörüngesi içine muhabiri vurma yararlanmıştır. Bu nedenle, raportör farelerin üretimi için daha basit bir yönteme ihtiyaç vardır. Sitokinler hücrelerarası sinyalizasyon ile immün yanıtları düzenleyen küçük, salgılanan proteinler / peptidlerin geniş bir sınıfıdır. İnterlökin 22 (IL-22), birçok ile sitokin bariyer fu dahil aktiviteler bildirilmiştirnction, doku tamiri ve inflamasyon 4. IL-22 ilk olarak bir T-hücre ürün 5 ile tespit edilmiştir, ancak, daha sonra rapor insanlarda 6 ve fareler 7 ve doğuştan gelen lenfositlerin 8 diğer sınıfları doğal öldürücü (NK) hücreleri içinde ekspresyonu gösterdi. Antikorlarla lekelere IL-22, daha önce gerekli olan ex vivo stimülasyonu ve geçirgenliği ve geniş bir IL-22 üreten hücrelerin gözlem, görselleştirme rağmen. Bu nedenle, yeni IL-22 raportör fareler homeostatik ve patojenik süreçlerde IL-22 fonksiyonunu araştırmak için çok yararlı bir araç olacaktır. Burada, in vivo ve in vitro olarak IL-22 üreten hücreleri gözlemlemek için basitleştirilmiş bir transgenik raportör fare modeli geliştirilmiştir. BAC Recombineering yöntemi 9 kullanarak, IL-22 loc olarak Poli A sinyal parçalarını tdTomato cDNA dizisini takılıUS ve mümkün olduğu kadar IL-22 doğal düzenleme taklit mi zira diğer dönüştürülmemiş bölgeleri, eksonlan ve düzenleyici elemanları, tedirgin değil ekson 1 yerini aldı. bildirici ekleme yeri IL-22 kendisi hızlı bir şekilde salgılanır aksine üreten hücrelerin içindeki muhabir birikmesine yol açar, sinyal dizisini bozar. Bu yeni yöntem, diğer salgılanan proteinler için haberci farelerin üretimi için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11 BAC</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>RPCI23. C</td><td>Gen Kimliğine ihtiyacınız var: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Maya Özü, 5 g sodyum klorür&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-fare CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızı</td><td>Thermo yok Fisher Bilimsel</td><td>14175145</td><td>KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glikoz</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK parçalama tamponu</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE sağlık yaşam bilimleri</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (nötr proteaz, derece II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70 ters floresan mikroskobu</td><td>Olympus</td><td></td><td>Fiyat teklifi isteyin</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 80i mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Fiyat teklifi isteyin</td></tr><tr><td>Dynal shaker</td><td>Elektron Mikroskobu Bilim</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Fiyat teklifi isteyin</td></tr><tr><td>LSRII SORP/akış sitometrisi</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td></td><td>Fiyat teklifi isteyin</td></tr></tbody></table>

raportör fareler kullanılarak il-22 eksprese eden lenfositlerin görselleştirme

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Raportör farenin geniş hedef genlerin ekspresyonu lokalizasyonunu gözlemlemek için kullanılmıştır. Bu protokol, yeni bir transgenik muhabiri fare modeli kurmak için bir strateji üzerinde duruluyor. Biz bu sitokin inflamasyon ile hasarlı dokuların tamir katkıda bağırsak, önemli etkinlikleri de olduğundan interlökin (IL) 22 gen ifadesini görselleştirmek için seçti. Haberci sistemler arasında, in vivo olarak ürünlerin belirlenmesi için diğer yöntemlere göre önemli avantajlar sunmaktadır. IL-22 olması durumunda, diğer çalışmalar, ilk doku hücreleri izole olan ve daha sonra in vitro olarak hücrelerin yeniden uyarılır. IL-22, normal olarak salgılanır, bir ilaç ile hücre içinde sıkışıp edildi ve hücre içi boyama görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem, IL-22 üretebilen hücreleri tanımlayan, ancak in vivo olarak bunu yaparken olup olmadığını o karar vermez. raportör tasarımı, WA, IL-22 geni bir floresan proteini (tdTomato) bir gen sokulması içerirfloresan protein nedenle salgılanır ve edilemez Y in vivo üreten hücrelerin içinde sıkışıp kalmaktadır. Floresan üretici daha sonra doku kesitlerine ya da akış sitometrisi ile ex vivo olarak analiz ile görselleştirilebilir. muhabir gerçek inşaat süreci, IL-22 geni içeren bir bakteriyel yapay kromozom Recombineering dahil. Bu işlenmiş kromozom sonra fare genomu içine verilmiştir. Homeostatik IL-22 raportör ekspresyonu Akışkan sitometri analizi ile dalak, timus, lenf düğümleri, Peyer ve bağırsak dahil olmak üzere, farklı fare dokularda gözlenmiştir. Kolit T hücresi (CD4 + CD45RBhigh) transferiyle uyarılır, ve raportör ekspresyonu gözlendi. Pozitif T hücreleri mezenterik lenf düğümleri ilk mevcuttu, ve sonra onlar distal ince bağırsak ve kolon dokularının lamina propria içinde birikmiş. BAC&#39;ler kullanarak strateji, IL-22 Expres kıyasla iyi sadakat muhabiri ifade verdision ve knock-in prosedürleri daha basittir.

Bir murin IL-22 raportör transgen IL-22 yerini taşıyan bakteriyel suni bir kromozom değiştirmek için Recombineering kullanılarak oluşturuldu. Şekil 1 sacBII geni, bir pozitif seçim markeri ve kloramfenikol antibiyotik dirençli bir gen ihtiva eden 11 pBACe3.6 vektörünün bir diyagramını göstermektedir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, ekson 1 içine tdTomato sokulması sonra, sinyal peptid dizisi, kesintiye uğramıştır. Bu nedenl...

Burada, farklı fare dokuları içindeki IL-22 üreten hücreleri görselleştirmek için bir transgenik raportör fare modelini açıklıyoruz. Bu yöntem, faredeki diğer sitokinlerin veya salgı proteinlerinin yerini izlemek için kullanılabilir.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Bu fare genetik modifikasyon prosedürünün genel amacı, IL-22 üreten bağışıklık hücrelerini tanımlamak, saflaştırmak ve karakterize etmektir. Bağışıklık sistemi hücreleri, bizi bakteri gibi yabancı maddelere karşı savunmak ve hasarlı dokuları restore etmekten sorumlu olan sitokin adı verilen aracıları serbest bırakır. IL-22 böyle bir sitokindir ve doku onarımından patolojiye kadar birçok aktivite atfedilmiştir.Ve bağışıklık sistemindeki bir dizi farklı hücre tipinin bunu üretebildiği bildirilmiştir. Bu nedenle, hangi hücrelerin gerçekten IL-22 ürettiğini açıklığa kavuşturmak için yeni bir IL-22 raportör faresi geliştirdik. Bu, ilgili IL-22 üreticilerini in vivo olarak normal koşullar altında farelerde ve inflamatuar bir bağırsak hastalığı modelinde tanımlamamızı sağladı.Ayrıca, diğer özelliklerini belirlemek için IL-22 ekspresörlerini saflaştırmak için raportör hücreleri kullandık. Raportör fare oluşturma yöntemi kısaca özetlenmekte ve analiz yöntemleri açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, ekspresörleri tanımlamak ve daha fazla karakterizasyon için canlı eksprese eden hücreleri saflaştırmak amacıyla diğer genlere uygulanabilir.Bu yöntem, immünoloji alanında IL-22'nin biyolojik akti

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu prosedür, tespiti ve izolasyonu stimülasyon üzerine IL-17 aktif salgılar fare Th17 lökositlerin açıklamaktadır.

Canlı Fare IL-17 salgılayan T Hücreler Algılama ve İzolasyonu

Karaciğerdeki immün hücrelerin stabil intravital yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi zordur. Burada, yoğun bakım monitörizasyonu ile birlikte intravital multifoton lazer tarama mikroskobu ile fare karaciğerindeki bağışıklık hücrelerinin göçünü ve hücre-hücre etkileşimlerini uzun süreler boyunca (yaklaşık 6 saat) incelemek için oldukça hassas ve güvenilir bir yöntem sunuyoruz.

CXCR6.Gfp Muhabir Fare kullanma Sağlıklı ve hastalıklı Karaciğer Bağışıklık Hücreleri Uzun Vadeli intravital multiphoton Mikroskopi Görüntüleme

Burada açıklanan yöntem, non-invaziv biyolüminesans görüntüleme (BLI) yoluyla farelerin akciğerlerinde IL-8 promotöre bağlı inflamasyon aktivasyonunun görselleştirilmesine olanak tanır. Aynı hayvan lusiferaz muhabiri yapısının teslim edildiği andan itibaren iki aya kadar birden fazla kez BLI'ye tabi tutulabilir.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Bu iletişim kuralı tanımlamak ve reseptör-ligand etkileşimleri ölçmek için kullanılan bir muhabir sistem kurmak açıklar.

Reseptör-Ligand etkileşimleri çalışmak için bir BW muhabir sistemi

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Burada, duvar ikincil lenfoid organlarda sitokin Interferon gama salgılama hücrelerin içinde situ lokalizasyonu görselleştirmek için basit bir Konfokal görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu protokol, farklı dokularda diğer sitokinlerin görselleştirilmesi için uzatılabilir.

Listeria monocytogenes enfeksiyonu sonrasında Mouse dalağında In situ Interferon gama üretiminin görüntülenmesi

Biz GFP etiketli γδ IELS görselleştirmek için bir yöntem açıklamak, ters dönen disk konfoksel mikroskobu tarafından murine ince bağırsak intravital görüntüleme kullanarak. Bu teknik, 4 h 'ye kadar mukoza içindeki canlı hücrelerin takibini sağlar ve çeşitli bağırsak immün-epitelyal etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Murine Ince bağırsak INTRAEPİTELYAL lenfosit intravital görüntüleme

Tip 2 inflamasyonda rol oynayan Grup 2 doğuştan gelen lenfoid hücreler (ILC2'ler), esas olarak helmint enfeksiyonuna, alerjik hastalıklara, metabolik homeostaza ve doku onarımına yanıt olarak katılır. Bu çalışmada, ILC2'leri murin burun mukozasından izole etmek ve CD226 ekspresyonunu saptamak için bir prosedür gösterilmiştir.

CD226 Ekspresyonunu Saptamak için Grup 2 Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin Fare Burun Mukozasından İzolasyonu

IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

Evlat edinen hücre transferi için farelerden alınan tümör infiltre lenfositleri (TIL'ler) akış sitometrisi yoluyla kullanmak için bir yöntem tanımladık. Bu protokol, sinjeneik pankreas kanseri fare modelinde tümörlere karşı TIL'lerin spesifik sitotoksisitesini doğrulamayı ve pankreas kanseri için evlat edinen hücre tedavilerinin geliştirilmesine ilişkin içgörüler sağlamayı amaçlamaktadır.

Pankreas Kanserinin Bir Fare Modelinde Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerin Flow Sitometri Tabanlı İzolasyonu ve Terapötik Değerlendirmesi

Öğrenin farelerde IL-22 üreten bağışıklık hücrelerini görselleştirmek için transgenik raportör fare modelini kullanmayı. Bu yöntem, sitokin üretimini in vivo izlemeye ve immün yanıtları anlamaya yardımcı olur.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Daha fazla video keşfet