Name: Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Öğrenin fare izole perfüze böbrek tekniğini kullanarak ekz vüvada böbrek fonksiyonlarını analiz etmeyi. Bu yöntem sistemik etkileri hariç tutarak akut böbrek hasarı mekanizmalarını araştırmak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, paha biçilmez bilimsel tavsiyeleri için Hans-Joachim Schurek'e teşekkür eder. Yazarlar, mükemmel teknik yardım için Monique Carrel ve Michèle Heidemeyer'e, el yazmasının eleştirel bir okuması için David Penton Ribas ve Nourdine Fessé'ye ve NaPi-2a antikoru için Carsten Wagner ve Jürg Biber'e teşekkür eder. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Araştırma Yetkinlik Merkezi "Kidney.CH" ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan bir proje hibesi (310030_143929/1) tarafından desteklenmiştir.

Bu yazıda anlatılan hayvanları da içeren tüm işlemler İsviçre hukukuna göre ve Zürih, İsviçre Kantonu veteriner idaresi tarafından onaylanmış gerçekleştirilmiştir bulundu. 1. Tampon Hazırlama <ol><li> 4 ve antidiüretik hormon (ADH) çözeltisi (Tablo 1) - çözümleri 1 hazırlayın. </li><li> Diyaliz tamponu (Tablo 1) hazırlayın. NOT: Bu perfüzyon sırasında diyaliz tamponu olarak kullanılmıştır tampondur. Daha sonra, eritrositler son perfüzat oluşturmak için bu tampon içinde seyreltilir. </li><li> Eritrosit hazırlanması. <ol><li> insan eritrosit konsantresi diyaliz tamponu ile 500 ml (yerel kan bankasından elde edilen test materyal) 250 ml sulandırmak. 8 dakika boyunca 2.000 x g&#39;de santrifüjleyin. herhangi eritrositler kaldırmak için dikkatli olmak, tamponu çıkarın. 3x tekrarlayın. </li></ol></li><li> tampon; albümini (BSA sığır serum albümini) hazırlayın. <ol><li> dialysi, 200 mls tamponu, bir karıştırma çubuğu kullanılarak BSA 44 g çözülür. filtre kağıdı ile çözüm Filtre. </li></ol></li><li> perfüzat hazırlayın. <ol><li> BSA tampon içine filtre kağıdı ile adım 1.3.1 den eritrositler Filtre. Diyaliz tamponu ile 800 ml arasında bir toplam hacme kadar doldurun. NOT: Bu son perfüzyon olduğunu. hematokrit Şimdi 8 ile% 12 arasında olmalıdır. Perfüzat 12 saat kadar 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li></ol> 2. başlatılması Diyaliz ve Oksijenizasyon <ol><li> Daha büyük bir tampon rezervuar, daha küçük bir tampon rezervuar ve nemli bir odada 37 ° C (küçük, çift cidarlı sonra böbrek tutmak için 37 ° C ve% 100 bağıl neme getirdi) çevreleyen su banyosu üzerinde çevirin (Şekil 2) . </li><li> Diyaliz tamponu ile daha büyük bir tampon rezervuar ve perfüzat ile birlikte küçük bir doldurun. </li><li> Diyaliz tamponu% 5 CO 2 /% 95 O 2 gaz girişi çevirin. </li><li> diyaliz tamponuna karşı perfüzat sürekli diyaliz açın. Düşük akı diyaliz tüp kullanmak için özen gösterin. Adım 3&#39;e geçin. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> Şekil 2: Perfüzyon Devre şematik çizimi. Şema perfüzyon devresinin ana bileşenleri ve tampon akış yönünü gösterir. lacivert çevrili tüm bileşenler bir su banyosu / termostat ile 37 ° C&#39;de tutulur. 1: perfüzyon tamponu en az 3 kez hacmi Diyaliz tamponu sürekli olarak% 95 O 2/5% CO2 ile köpürtülür. 2: Diyaliz tamponu ve perfüzyon tampon maddesi sürekli bir silindir pompa ile bir diyaliz tüpü içinde birbirlerine karşı diyaliz edilir. 3: Bu diyalize perfüzyon tampon maddesi% 9 O ile zenginleştirilmiştir nedeniyle 2/5% CO2 ve elektrolit seviyeleri tutulur, sabit throughout perfüzyon. 4: Bir silindir pompa böbrek doğru perfüzyon tampon sevkeder. 5: Bir windkessel peristaltik dalgalar kaldırır ve bir baloncuk kapanı gibi davranır. 6: Basınç detektörler (serbest dalgalı akış izin verirken 4. (silindir pompasına bağlı) sürekli baskı tutmak için). 7: perfüzyon boyunca, böbrek% 100 hava nemi ve 37 ° C, böbrek sıcaklığında bir nem odasında tutulur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 3. Cerrahi Prosedür Bölüm 1 (tüm bitişik harfler bir diyagram için, bakınız Şekil 3) Not: 5-0 cerrahi iplik kullanarak tüm bitişik harfler gerçekleştirin. <ol><li> periton içi enjeksiyon ile bir fare (% 0.9 NaCI içinde çözülmüştür vücut ağırlığı, 20 mg / ml ketamin ve 1 mg / ml ksilazin 10 ul / g) anestezisi. Analg yeterli derinliği onaylayınArka ayak reflekslerin yokluğu test ederek esia. </li><li> nemli odasında yatar pozisyonda fare sabitleyin. Veteriner merhem ile gözleri koruyun. lomber damarları yükseltmek için omurga altına 1 ml şırınga yerleştirin. </li><li> makasla ilk sternum açılış cilt, daha sonra karın kasları, kasık tepesinin bir medyan laparotomi gerçekleştirin. </li><li> bağırsak çıkarın ve karın fare yanal sol tarafına yerleştirin. </li><li> bağ dokusu mesaneyi boşaltmak ve üreterler ve üretrayı hem de keşfetmek. </li><li> Sol üreter (bağ I) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu. </li><li> üretra (bağ II) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Kapat onu. </li><li> Bütün mesane (bağ III) etrafında bir &quot;kement&quot; bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> Mesaneyi 1 mm İnsizyon. </li><li> 2 cm PE 50 tüpü ile açıklığa kanüle. </li><li> boru etrafında yakın bağ III. </li><li> bitişik harfler sol üreter ve üretra distalinde kesti. bladder şimdi sadece ve serbestçe hareket sağ üreter takılır. </li><li> Bağ dokusu ve yağ abdominal aorta temizleyin. </li><li> abdominal orta aort bitişik harfleri (bağ IV) yerleştirin. </li><li> superior mezenterik arter ve çölyak gövde (bağ V) arasındaki diyafram altında aort etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> superior mezenterik arter (bağ VI) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> doğrudan aşağıda sağda ve sol renal arter (bağ VII) Yukarıdaki aort bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> kaudal ven paketi (cava) (bağ VIII) etrafında bir bitişik harfleri yerleştirin. Adım 4 ile devam edin. </li></ol><img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> Şekil 3: Cerrahi sırasında yerleştirilen Bitişik Harfler şematik çizimi. Laparotomi sonrası açık karın görünümü. bağırsak sola dışarı taşınır. L ve R, sol ve sağ böbrek göstermektedir.siyah çizgiler ilgili ligature alanını gösterir. Harfler önce yerleştirilmiş ve daha sonra metin içinde verilen sırada, kapatılır. X aort kanülasyon için kesi yerini işaretler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Perfüzyon Devre 4. Hazırlama <ol><li> Döner Pompayı başlatın ve perfüzat ile tüp doldurun. ondan tüm hava kabarcıklarını boşaltmak için özen gösterin. </li><li> perfüzat ile birlikte yaklaşık olarak orta-seviyeye windkessel cihazı doldurun. </li><li> Tüm boru dolu ve akış bu süre içinde böbrek düzeyinde perfüzyon iğne tutun 0&#39;dır olduğunda 0 mm Hg basınç dönüştürücü ayarlayın. </li><li> sabit asgari düzeyde (0.6 ml / dk) akışını tutmak ve Adım 5 geçin. </li></ol> 5. Cerrahi Prosedür Bölüm 2 <ol><li> ligature IV ve sol Rena dallanma arasında bir kelepçe yerleştirinl arter. </li><li> dorsal duvarı kesme özen, bağ IV aort kaudal küçük bir kesi yapmak. </li><li> Bir gemi dilatör ile aort açıklığı dilate. </li><li> Bir iğne ile aort cannulate sadece kelepçe ucu iterek, (2 cm uzunluğunda, PE 50 çekti). </li><li> kelepçesini açın. </li><li> Doğru böbrek arter ve aort kavşak ulaşıncaya kadar iğne cranially ucu itin. </li><li> Kapat bağ VII. </li><li> Kapat bağ IV. </li><li> diyafram diseksiyon ile makas ile göğüs açın. Tek bir kesim ile, aort, vena kava, kalp ve vejetatif sinir ayırın. Bu adımla birlikte, hayvan sürekli derin anestezi altında hızlı kan kaybından yoluyla kurban. </li><li> perfüzyon pompa basınç kontrolü başlatın. 80 ve 100 mmHg arasında ortalama basıncı koruyun. </li><li> Yakın bağ V. </li><li> Kapat bağ VI. </li><li> Kapat bağ VIII. </li><li> Bağ Tissu&#39;dan ücretsiz sağ böbrekE ve makasla adipoz kapsül içine gömme. </li><li> V. ligature için proksimal aort Cut </li><li> VI ligature için distal superior mezenterik arter kesin. </li><li> gemiler kendileri oyulmuş değil özen, böbrek destekleyici damar demeti kesin. </li><li> böbrek bağlantısında karaciğer kesin. böbrek serbest özen gösterin, fakat vena kava onun tarafından açık tutulur, böylece ona karaciğer yapışık küçük bir kısmını bırakın. </li><li> fare dışarı böbrek desteyi alıp. Nemli odasından fareyi çıkarın. </li><li> karaciğer ve böbrek (bağ IX) bağlantısı etrafında bir &quot;kement&quot; bitişik harfleri yerleştirin. </li><li> venöz hat (2 cm PE 50) ile vena kava cannulate. </li><li> Kapat bağ IX. venöz hattı üzerinden venöz çıkış derhal başlamalıdır. </li><li> nemli bir odada kapatın. </li></ol> 6. Alt Analizler <ol><li> Aşağıdaki saat boyunca, sürekli kan akışını ve intravascul izlemekar basıncı 15. Örneğin analizi için kullanılabilir kan çıkışı, renal renin salınımını 7 toplayın. Elektrolit konsantrasyonu ve glomerüler filtrasyon hızı 14 analiz için idrar toplayın. Perfüzyon 1 saat sonra, böbrekler Western blot ek dondurulabilir veya görüntüleme için sabit 16 yaklaşır. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
<li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li>
<li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li>
<li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+albumin+filtration%3A+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li>
<li>Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li>
<li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur ve açıklayacak başka bir şeyi yoktur.

Perfüze böbrek izole fare çok sayıda sistemik faktörlerin etkisi ile kusurlu olabilir sağlam hayvanlarda in vivo deneyler arasındaki köprü, 1 saat boyunca kontrollü bir ortamda ex vivo böbrek fonksiyonunu incelemek için bir araçtır ve in vitro deneylerde izole nefron segmentleri veya mutlaka fonksiyonu bozulmamış organ yapısı etkisini ihmal kültürlü hücreler. , Yazarların bilgisine, hiçbir alternatif bir teknik bu özel görevi vardır gerçekleştirmek için bir. Böbrek dokusu üzerinde biyokimyasal...

Organların izole perfüzyon onlarca yıl 1 fizyolog arasında sürekli bir çaba konusu olmuştur. tekniği, kan basıncı, hormonlar, ya da sinirler gibi sistemik etkileri olmadan, organın işlevini sağlayan, çalışılacak. Carl Eduard Loebell 1849 2, izole edilmiş böbrek başarıyla perfüzyon tarif eden ilk olarak kabul edilir. O zamandan beri, perfüzyon aparatı önemli arıtma uğramıştır. Frey ve Gruber sürekli perfüzyon 2 oksijenasyon ve pulsatil pompalar için yapay akciğer tanıttı. Erken araştırmacılar özellikle büyük memeliler-yani, domuzlar 2 ve köpekler 3 sıçan böbreklerinde kullanımı -the ilk rapor, Weiss ve ark ait böbrekler okudu iken. Küçük memeli organ perfüzyon 4 çalışmada bir dönüm noktası oldu. Schurek ve ark. Yeterli böbrek tübüler eğer perfüzat memeli eritrosit ekleme gerekliliğini bildirdioksijen 5 elde edilebilir amaçlanmıştır. Uzun vadeli deneyler için kritik Aynı araştırma grubu 6 ile tampon sürekli diyaliz tanıtım oldu. 2003 yılında, Schweda ve ark. Daha sonra Rahgozar ve arkadaşları tarafından rafine fonksiyonel fare izole perfüze böbrek (MIPK) 7, rapor için ilk idi. 18 ve Lindell ve diğ. 14. perfüze böbrek izole sıçan daha teknik olarak daha zor olsa da, MIPK kullanımı genetik olarak değiştirilmiş farelerin geniş bir yelpazede kullanımını sağlayan avantajını taşımaktadır. Bu kağıt 1 saat boyunca izole fare böbrekleri perfüze için yazarların yöntemin ayrıntılarını sunar. yöntem böbrek akış hızı, damar direnci, hormon salınımı, kan gazı analizi, idrar analizi ve ilaçların uygulama sürekli değerlendirme sağlar. prosedür takip edilerek, böbrekler, moleküler ve biyokimyasal analiz için işlenebilir mikroskopi için sabit ya daBir alıcı fare içine nakledilen (Şekil 1). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> Şekil 1: İzole perfüze Böbrek Olası Giriş / Çıkış bakış. BGA: Kan gazı analizi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Birçok yenilikçi uygulamalar ile (veya anti-ret veya genom düzenleme ilaçların uygulama olmadan) 8, 9 nakilden önce uzun süreli normotermik böbrek perfüzyon şafak ile tartışılmaktadır olarak bu tekniğin büyük olasılıkla, 10, önümüzdeki yıllarda artan ilgi alacaksınız , 11, hücresizleştirilmiş iskeleler 12 gelen bütün böbreklerin Bioengineering ve multiphoton görüntüleme 13 floresan boyalar yüksek dozlarda uygulanması </sup&gt;. Ayrıca akut böbrek hasarı 14 sırasında belirli genlerin rolünü araştırmak için ideal bir modeldir. Bir adım-adım protokolü diğer laboratuarlar başarıyla izole fare böbrek perfüzyon gerçekleştirmek için izin verilir. İlk olarak, bileşim, ve tampon hazırlanması belirtilir. Daha sonra, cerrahi ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve kritik adımlar gösterilmektedir. Üçüncü olarak, veri başarılı bir hazırlık temsil ettiğini sunulmuştur: renal kan akımı, damar direnci, glomerüler filtrasyon hızı ve fraksiyonel elektrolit atılımı hepsi perfüze böbreklerin farklı nefron segmentlerinden morfolojisi canlılık-ve transmisyon elektron mikroskobuyla olarak fonksiyonel ölçümler perfüzyon 1 saat sonra sabit.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > Perfüzyon Devresi: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nemli oda 834/8</td><td>Harvard Apparatus / Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Sepetli ve yan portlu kanül</td><td>Harvard Apparatus / Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Termostat TC120-ST5 &nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Makaralı Pompa Reglo Analog</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Tampon çözelti için ceketli rezervuar 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Tampon çözelti için ceketli rezervuar 0,5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Basınç Dönüştürücü APT300 ve nbsp;</td><td>Harvard Apparatus / Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys Dönüştürücü</td><td>Harvard Apparatus / Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys servo kontrolör</td><td>Harvard Apparatus / Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB veri toplama</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Düşük Akı Diyalizör Diacap Polisülfon</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>Aort kanülasyonu için PE-Tüp 1,19 mm İç Çap x 1,70 mm Dış</td> Çap<td>Bilimsel Emtia A.Ş.</td><td>BB31695-PE / 8</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Adı< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Tampon reaktifleri: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aminoplazma% 10</td> <td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamik asit monosodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L- (-) -Malik asit sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum-L-Laktat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>alfa-Ketoglutarik asit sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H < altı > 2 O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl < alt > 2 < / alt > * 6H < altı > 2 < / alt >O ve nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Antidiüretik Hormon dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-İnülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtresi eritrosit filtrasyonu için kullanılır</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analizi:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ABL 80 esnek</td><td>Radyometre Tıbbi ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare İzole perfüze böbrek tekniği

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. Bu izole organ ve perfüzyon böbrek biyomühendislik için Decellularization veya anti-reddi veya asal böbrek yüksek dozlarda genom düzenleme ilaç uygulaması da dahil olmak üzere gelecekte mümkün olabilir pek çok yenilikçi uygulamalar için fizyolojisi eğitimi için bir ön koşuldur nakli için. perfüzyon süre boyunca, böbrek, böbrek fonksiyonu değerlendirilebilir, manipüle ve çeşitli ilaç tatbik edilebilir. İşlemden sonra, böbrek nakledilen veya moleküler biyoloji, biyokimya analizi, ya da mikroskopi için işlenir. Bu yazıda perfüzat ve fare böbrekler ex vivo perfüzyon için gerekli cerrahi teknik anlatılmaktadır. perfüzyon aparatı detayları verilen ve veri v gösteren sunulmuşturböbreğin hazırlama iability: morfolojik okumalar ve moleküler okuma farklı nefron bölümlerinin taşıyıcı proteinlerin Western blotlar farklı nefron bölümlerinin işlevsel transmisyon elektron mikroskobuyla böbrek kan akışı, vasküler direnç ve idrar verileri.

yöntem tarif ile, izole edilmiş fare böbrekleri, en az 1 saat boyunca canlı kalabilir. Fonksiyonel (böbrek kan akımı ve damar direnci, venöz çıkış, glomerüler filtrasyon hızı, idrar fraksiyonel Na + ve K + atılımını kan gazı analizi ve idrar osmolalitesi) ve morfolojik (iletim elektron sürekli perfüzyon 1 saat sonra doku canlılığını test vahşi tip C57BL / 6 fareden oluşan dört böbreklerde mikroskobu, TEM) yöntemleri. Ayrıca, farklı tübül bölümlerinin apikal markör p...

Fare izole edilmiş perfüze böbrek (MIPK) perfüze edildi ve 1 saat için fonksiyonel ex vivo koşullar altında bir fare böbrek tutmak için kullanılan bir tekniktir. tamponlar ve cerrahi teknik ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Bu protokolün genel amacı, ex vivo perfüze edilmiş fare böbreğinde izole böbrek fonksiyonlarını analiz etmektir. Bu yöntem; kan basıncı, hormonlar veya otonom sinir sisteminin etkisini dışlayarak Nefroloji'nin temel sorularına yanıt aranmasına yardımcı olabilir.İzole organ fonksiyonu hakkında bilgiler sağlayan ve akut böbrek hasarını incelemek için zarif bir araç görevi gören bu yöntem; IPK'nın temel avantajı, organ fonksiyonunun sistemik etkiler olmaksızın incelenmesidir. Fareyi cerrahi işlem için hazırladıktan sonra, makas kullanarak pubik krestten sternuma kadar orta hat laparotomisi gerçekleştirin.Önce deri, ardından abdominal kaslar açılır. Sonra, bağırsaklar çıkarılıp abdomenin lateralinde, farenin sol tarafına yerleştirilir. Şimdi, mesane bağ dokudan serbest bırakılarak her iki üreter ve üretra açığa çıkarılır.Bu prosedürler için, tüm ligatürleri 5-0 sütürler kullanarak yerleştirin. Yerleştirilecek ilk ligatür sol üreterin etrafına olmalıdır. Burayı çift cerrahi düğümle sıkıca kapatın.Ardından, aynı tekniği kullanarak üretra etrafına bir ligatür yerleştirin. Daha sonra, tüm mesane etrafına bir kement ligatür yerleştirin ancak bunu bağlamadan bırakın. İlk üç sütür yerleştirildikten sonra, mesaneye bir milimetre uzunluğunda bir insizyon yapmak için göz makası kullanın.Bu insizyonun içine, iki santimetre PE-50 tüpten yapılmış bir kanül yerleştirin. Şimdi, kanülü sabitlemek için mesaneyi çevreleyen ligatürü kapatın. Mesane kanüle edildikten sonra, sol üreteri ve üretrayı ligatürlerin distal kısmından kesin.Mesane artık sadece sağ üretere bağlı olmalı ve serbestçe hareket edebilmelidir. Ardından, abdominal aortayı çevreleyen bağ dokuları ve yağları temizleyin. Daha sonra, açığa çıkan aortanın orta noktasına ve diyaframın hemen altına, superyor mezenterik arter ile çölyak trunkus arasına ligatürler yerleştirin.Bunların her birini aynı şekilde gevşek bırakın. Ardından, superior mezenterik artere bir ligatür yerleştirin. Şimdi, sağ renal arterin hemen altına ve sol renal arterin üzerine aorta çevresine üçüncü bir ligatür yerleştirin.Bu, yedinci ligatürdür. Son olarak, kaudal ven paketinin etrafına bir ligatür yerleştirin. Şimdi, yedinci ligatür ile sol renal arterin dallanma noktası arasına bir klempe yerleştirin.Ardından, dorsal duvarı kesmemeye dikkat ederek, yedinci ligatürün kaudal tarafında aortada küçük bir insizyon yapın ve açıklığı bir damar dilatörü ile genişletin. Açıklığa, ucunu sadece klembin içine itecek şekilde, iki santimetre çekilmiş bir PE-50 kanül yerleştirin. Sonra, klembi açın.Ardından, iğnenin ucunu sağ böbrek arteri ile aortun birleşme noktasına ulaşana kadar kraniyale doğru itin. Şimdi yedinci ligatürü kapatın ve ardından abdominal aortun orta noktasındaki ligatürü kapatın. Diyaframı diseke ederek göğüs kafesini makasla açarak işleme devam edin.Ardından, tek bir kesiyle aortayı, vena cava'yı, kalbi ve vejetatif sinirleri ayırın. Şimdi, perfüzyon pompasının basınç kontrolünü başlatın ve ortalama basıncı 80 ile 100 mmHg arasında tutun. Şimdi, aorta ve kaudal ven paketinin etrafındaki bağlanmamış kalan üç ligatürü kapatın.Makas kullanarak sağ böbreği çevreleyen bağ dokusundan ayırın ve yağ kapsülünden kurtarın. Aortayı, superior mezenterik arter ile çölyak trunkus arasındaki ligatürün proksimalinden kesin. Ardından, superior mezenterik arteri, superior mezenterik arter etrafındaki ligatürün distalinden kesin.Şimdi, damarların kendisini kesmemeye dikkat ederek böbreği destekleyen damar demetini çıkarın. Ardından, karaciğeri böbrekle bağlantılı olduğu yerden kesin, ancak vena cava'nın açık kalmasını sağlamak için karaciğerin küçük bir kısmını böbreğe bağlı bırakın. Bir sonraki adım, böbrek demetini fareden çıkarmaktır.Şimdi, böbreği hazne içerisinde bırakın ve fareyi çıkarın. Karaciğer ile böbrek arasındaki bağlantı noktasına bir kement bağlama aparatı (lasso ligature) yerleştirin. Ardından, vena cava'yı venöz bir hat ile kanüle edin ve kement bağlama aparatını kapatın.Böbrek artık kutuda sabit bir şekilde durmalıdır. Venöz hat üzerinden venöz çıkış hemen başlamalıdır. İdrar çıkışı yaklaşık üç dakika sonra başlayacaktır.Üreter peristaltizmi hemen başlamalı ve en az bir saat boyunca stabil kalmalıdır. Kutuyu kapatın. Preparat artık tamamlanmıştır ve en az bir saat boyunca canlılığını korumalıdır.Tanımlanan yöntem C57 black 6 farelerine uygulandıktan sonra, bir saatlik sürekli perfüzyonun ardından dört böbreğin doku canlılığı test edildi. Basınç, sürekli 100 millimeters of mercury seviyesinde tutuldu. Perfüzat akışı ve vasküler direnç, dört böbreğin tamamında sabit kaldı.Glomerüler filtrasyon hızı, zamanla artması beklenen ancak anlamlı düzeyde artmayan FITC inülin klirensi kullanılarak değerlendirildi. Sodyum ve potasyumun fraksiyoner ekskresyonu, 55 dakikalık perfüzyondan sonra değerlendirildi. Bu parametreler, in vivo duruma kıyasla artış gösterdi.55 dakika sonra, idrar molalitesi venöz çıkışın osmolalitesinin üzerine çıkmadı. Ardından böbrekler fikse edildi ve ultrastrukürleri TEM ile değerlendirildi. Proksimal tübüllerin S1 segmentlerindeki glomerüller büyük ölçüde değişmemiş görünüyordu.Vasküler demetlere yakın olmayan kalın çıkan kollardaki proksimal tübüllerin S2 ve S3 segmentlerinin bazıları, ancak tamamı değil, organ hasarı belirtileri gösterdi. Daha yakından incelendiğinde, distal kıvrımlı tübüller ve toplama kanallarında nekroz belirtilerine rastlanmadı. Genel olarak böbrekler, izole perfüze sıçan böbrekleri için bildirilenlerle benzerlik gösterdi.Bu prosedürün ardından, daha fazla bilgi edinmek amacıyla doku üzerinde görüntüleme veya FACTS ile takip eden protein veya RNA analizi gibi analiz yöntemleri uygulanabilir.

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Iskemi nedeniyle akut böbrek hasarı için kesin bir fare modeli (AKI), akut böbrek hasarı incelemek ve muhtemelen böbrek hasarı tedavi etmek için tedavi araçları bulmak için önemli bir araçtır. Asılı ağırlık sistemi, böbrek tıkanıklığı neden olmadan, hızlı ve güvenilir renal arter oklüzyonu ve reperfüzyon bir araç sunuyor.

İzole Renal Arter Tıkanıklığı Asılı ağırlık Sistemi

Bu videoda, farenin retroperitoneal boşluğundan böbrek çıkarma prosedürünü açıklıyoruz. Çıkarılan böbrek, böbrek kapsülü ve çevresindeki yağ tabakası olmadan sağlam bir böbrek elde etmek için ayrıca mikrodiseke edilebilir.

Fareden Sağlam Böbreğin Çıkarılması: Murin Modellerinden Böbrek Kapsülü Olmadan Böbrek Elde Etme Tekniği

Bu videoda, fare böbreklerinden sağlam glomerülleri izole etme yöntemi açıklanmaktadır. Bu şekilde elde edilen kapsüllenmiş ve kapsüllenmiş glomerüller, murin böbreğinden parietal epitel hücre büyümelerini kültürlemek için de kullanılabilir.

Glomerül İzolasyonu: Murin Böbrek'ten Sağlam Glomerül Elde Etme Tekniği

Biz fareler tabi olan orta ve ağır iskemi-reperfüzyon bağlı böbrek hasarı modelleri tanımlamak tek taraflı renal pedikül sırasıyla, eş zamanlı veya gecikmeli taraf nefrektomi takip sıkma. Bu modeller sürekli böbrek fonksiyon bozukluğu ve post-yaralanma fibrozis yol, ancak yaralanma şiddeti ve yaşam fare arka plan, yaş ve cerrahi ekipman bağlıdır.

Farelerde Akut Böbrek Hasarı ve Post Yaralanma Fibrozis iskemi-reperfüzyon Model

Böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için güvenilir ve verimli teknikler, sonraki uygulamalar için gereklidir. Bu, az sayıda böbrek bağışıklık hücresinin yüzey antikoru etiketlemesini gerektirir. Burada, görünüşte bu amaca ulaşan böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için özlü bir yöntem açıklıyoruz.

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve daha sonra böbrek biyolojik fonksiyonları ex vivomitokondriyal bioenergetics de dahil olmak üzere, değerlendirmek için alt kültürlü fare birincil renal tübüler hücreler karakterize için düşük maliyetli bir yaklaşım sağlar.

Yalıtım, karakterizasyonu ve yüksek işlem hacmi ekstraselüler akı analiz fare birincil Renal tübüler epitel hücresi

Burada fare vivo biotin ile glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu protokolü nasıl fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirmek yönergeler içerir.

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Antikor etiketleme, optik temizleme ve gelişmiş ışık mikroskobu kombinasyonu, tam yapıların veya organların üç boyutlu analizini sağlar. Burada açıklanan, kalın böbrek dilimleri immünolabeling birleştirmek için basit bir yöntemdir, etil cinnamate ile optik Temizleme, ve üç boyutlu böbrek yapıların görselleştirme ve kantifikasyon sağlayan konfoköz görüntüleme.

Optik temizleme ve Immünolabeled böbrek dokusu görüntüleme

Bu makale, araştırmacıların, uzun süreli üreter tıkanıklığının tersine çevrilmesinden sonra uzun vadeli yapısal ve fonksiyonel sonuçların analizine izin veren standart bir model kullanarak farelerde geri dönüşümlü tek taraflı üreter tıkanıklığı gerçekleştirmelerini sağlamak için ayrıntılı talimatlar sağlar.

Uzun Süreli Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Tersine Çevrilmesinden Sonra Uzun Vadeli Yapısal ve Fonksiyonel Sonuçları Değerlendirmek İçin Bir Fare Modeli

Bu makale, örnek toplamadan bir gün önce yapılan kontralateral nefrektomi ile tek taraflı böbrek IRI kullanan iskemik CKD modelini sunmaktadır; bu protokol, serum tabanlı fonksiyonel değerlendirme, yüksek sağkalma ve tekrarlanabilir KBD patolojisini 28 ve 42 gün içinde mümkün kılarak mekanik ve girişimsel çalışmalar için çok yönlü bir platform sağlar.

Böbrek Iskemisi/Reperfüzyon Yaralanması Nedeniyle Akut Böbrek Hastalığına Geçişin Fare Modeli

Farelerde sağ böbreğin rezeksiyonundan sonra tek taraflı böbrek iskemi-reperfüzyon sırasında böbrek mikrovasküler kan akışındaki değişiklikleri izlemek için lazer lek kontrast görüntüleme sistemi kullanıldı.

Farelerde Renal Iskemi-Reperfüzyon Yaralanması sırasında Lazer Lek Kontrast Görüntüleme ile Mikrovasküler Perfüzyon İzlenen

Öğrenin fare izole perfüze böbrek tekniğini kullanarak ekz vüvada böbrek fonksiyonlarını analiz etmeyi. Bu yöntem sistemik etkileri hariç tutarak akut böbrek hasarı mekanizmalarını araştırmak için değerli bir araçtır.

Fare İzole perfüze Böbrek Tekniği

Daha fazla video keşfet