TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, TEM analizini verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirmek için düşük hücre sayılarına sahip numuneler hazırlamaktır. Bu yöntem, gerçek hücrelerin tüm yapılarını ortaya çıkarmaya ve biyomedikal alanda daha iyi bir fizyolojik ortam sağlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, düşük hücre sayılarından tekrarlanabilir şekilde hem kalitatif hem de kantitatif sonuçlar elde edilebilmesidir.

Başlamak için, 10.000 hematopoietik kök hücreyi veya HSC'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne sıralamak için gerçekleri kullanın. 600 mikrolitre izokoy içeren% 10 FBS ile modifiye edilmiş dulbecco ortamı. Açılır kovalı bir santrifüj kullanarak, sıralanan HSC'leri 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de döndürün.

Ortamın 200 mikrolitresi hariç tümünü çıkarmak için gentil aspirasyon kullanın. Hücreleri sabitlemek için 0.2 mL taze hazırlanmış iki X fiksatif solüsyon ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra hücreleri yıkamak için 600 mikrolitre 0.1 molar kakodilat tamponu ekleyin.

Hücreleri tekrar, bu sefer 30 santigrat derecede santrifüjleyin. Daha sonra santrifüjlemeden ve 200 mikrolitre tampon hariç tümünü çıkardıktan sonra, kakodilat tamponunda mililitre evans mavisi başına 200 mikrolitre iki miligram ekleyin ve hücreleri lekelemek için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Hücreleri üç kez yıkamak için 600 mikrolitre 0.1 molar kkodilat tamponu kullanın.

Daha sonra, hücrenin süspansiyonunu 0.5 mL'lik bir tüpe aktarmadan önce kalan 200 mikrolitre tampondaki hücreleri yeniden askıya alın. Bu adımda, pelet tüpte görünür olmalıdır. Masa üstü santrifüj ile hücreleri 10 dakika boyunca 1.000 kez G'de döndürün.

Ardından, şu anda görünür olan küçük hücre peletini bozmadan tamponu nazikçe çıkarın ve tüpte 50 mikrolitre tampon bırakın. 15 mL'lik bir tüpte beş mililitre 0.1 molar kakodilat tamponuna 200 miligram düşük erime noktalı agaroz ekleyerek% 4'lük bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Tüpü 100 mL'lik bir cam şişede kaynar suya aktararak agarozu eritin.

Hücre süspansiyonunun tüpüne 200 mikrolitre agaroz çözeltisi ekleyin. Hemen 1.000 kez G ve 30 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Hücrelerin tüpün dibindeki yarı katı agaroza peletlendiğini doğruladıktan sonra, agarozu katılaştırmak için tüpü hemen 20 dakika boyunca dört santigrat dereceye veya buza aktarın.

27 gauge bir iğne kullanarak, hücre peletini içeren katılaşmış agarozu, 0.1 molar koidilat tamponu içeren 35 mL'lik bir plastik petri kabına dikkatlice aktarın. Bir neşter ile, hücre peletini içeren katılaşmış agarozu yaklaşık bir ila iki milimetrelik tek bir parçaya bölün. Ardından 1,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.

600 mikrolitre 0.1 molar kakodilat tamponu ekleyin ve tamponu eklemek ve çıkarmak için bir pipet kullanarak agaroz hücre peletini yıkayın. Tamponu agaroz hücre peletinden çıkarın ve bir çeker ocakta, koruyucu giysi ve eldiven giyerken, bir mililitre% 1 osmiyum tetroksit çözeltisi ekleyin. Hücre peletini bir saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, numuneyi üç kez yıkayın. Bir kapaklı 20 mL'lik bir cam parıldama şişesine aktarın. Daha sonra, bir etanol serisi kullanarak numuneyi kurutun.

Daha sonra, her seferinde 60 dakika boyunca iki kez% 100 reçine içinde inkübe etmeden önce numuneyi etanol içinde artan konsantrasyonlarda LX 112 reçine ile sızdırın. Forseps kullanarak, numuneyi piramit ucu şeklindeki bir kauçuk kalıbın altına dikkatlice aktarın ve kalıbı doldurmak için numunenin üzerine saf reçine ekleyin. Reçineyi polimerize etmek için numuneyi 60 santigrat derecede 72 saat inkübe edin.

Reçine polimerize olduğunda, kauçuk kalıbı bükerek kalıplardan çıkarın. Polimerize reçine piramidinde küçük bir siyah hücre kümesi görünmelidir. Polimerize reçine piramidini kesitleme için bir montaj silindirine tutturmak için siyanoakrilat kullanın.

Bloğu bir ultramikrotom üzerine monte ettikten sonra, piramit bloğunu kesmek için bir tıraş bıçağı ve elmas bıçak kullanın, bloğun üst ve alt kısımları birbirine paralel ve eşit açılı kenarlarla kısa, geniş bir yamuk şekli oluşturun. Ardından, hücre peletinin etrafındaki bloğu kesmek için elmas bıçağı kullanın ve hücre peleti agaroz parçasının etrafındaki plastik bölümleri çıkarın. Ultramikrotom ile bir mikrometrelik bölümler kesin ve bölümleri su teknesinden bir cam kaydırağa taşımak için bir kirpik aleti ve metal halka kullanın.

Ardından slaytları kuruması için 37 santigrat derecede sıcak bir tabağa koyun. 0.22 mikrometre filtreli bir şırınga kullanarak, bölümlere bir damla teluatin mavisi çözeltisi ekleyin ve üç dakika inkübe edin. Daha sonra damıtılmış su ile slaytları yükseltin ve bölümlerin kurumasını bekleyin.

Kuruduktan sonra, hücrelerin konumunu belirlemek için bölümleri ışık mikroskobu altında kontrol edin. Ardından, ultra ince bölümleri kesmek için bir elmas bıçak kullanın. Daha sonra bir kirpik aletiyle, iki ila üç bölümü su teknesinden 200 gözenekli ızgaraya taşıyın ve bir cam petri kabına yerleştirin.

Bölümleri kurutmak için tabağı ızgaralarla birlikte 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede sıcak bir tabağa aktarın. % 1 uranil asetat damlaları ekleyin ve ızgaraları lekelemek için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ardından, altı ila sekiz kez durulamak için damıtılmış su kullanın.

Altı ila sekiz kez durulamadan önce oda sıcaklığında Reynolds kurşun sitrat ile beş dakika boyayın. Bölümleri kurutmak için ızgaraları içeren cam petri kabını 37 santigrat derecede sıcak bir plakaya aktarın. Son olarak, kesitleri 87 kilovoltta bir elektron mikroskobu ile analiz edin.

Burada düşük büyütmede gösterilen, bir hücre kümesini doğrulayan küçük bir hücre peleti içeren bloklardan yarı ince toluidin mavisi lekeli bölümlerdir. Bu daha yüksek büyütme oranlı görüntü, hücrelerin bozulmamış morfolojisini gösterir. Bu şekil, uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyanmış ve elektron mikroskobu kullanılarak analiz edilmiş ultra ince kesitlerden hücre kümesinin bir genel görüş alanını temsil etmektedir.

Burada, hücrelerin morfolojisinin ve ultra yapısının iyi korunduğunu gösteren tek bir HSC gösterilmektedir. Tek bir HSC'nin daha yüksek büyütmeli, oldukça ayrıntılı bir elektron mikrografı, hücre içi ultra yapıları gösterir. Ek olarak, yüksek büyütme oranlı görüntüler, mitokondri gibi hücre altı organellerin iyi korunmuş yapısını ve bütünlüğünü yakaladı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik beş ila altı saat içinde ve gelişmiş mavi boyama ve agaroz gömme için gerçekleştirilebilir ve daha sonra normal TEM işlemi düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse beş ila altı gün sürecektir. Bu videoyu izledikten sonra, TEM Analizi için gerçek hücre hazırlığından numunelerin nasıl hazırlanacağını iyi bir şekilde anladınız.