Bir Sıçan Karaciğer Hilar Kelepçe Modeli Kullanılarak Doğrudan Segmental İçi hepatik Dağıtım Yöntemi
2 Nisan 2017
Benzersiz bir sıçan karaciğer hilar kelepçe modeli iskemi-reperfüzyon zedelenmesinin iyileşmesi farmakolojik moleküllerin etkisini incelemek için geliştirilmiştir. Bu model, doğrudan karaciğer taşınmasına izin veren, portal damar dalı ile iskemik karaciğer segment portal kaynağının doğrudan kanül içerir.
Bu benzersiz sıçan karaciğer hiler klemp modelinin genel amacı, iskemi reperfüzyon hasarını iyileştirmede ilgilenilen farmakolojik moleküllerin etkisinin incelenmesini sağlamaktır. Bu yöntem, karaciğer nakli alanında, iskemi reperfüzyon hasarına aracılık etmeye yardımcı olmak için hangi moleküllerin doğrudan karaciğere infüze edilebileceği hakkındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilgilenilen molekülün doğrudan portal ven içine enjekte edilmesi ve dağıtım hacminin azaltılmasıdır.
Bu tekniğin etkileri, iskemi reperfüzyon hasarının azaltılması için organ perfüzatlarına eklenebilecek moleküllerin test edilmesine izin verdiği için tüm organların transplantasyonuna kadar uzanır. Kanülasyon için kullanılan portal ven dalının küçük boyutu nedeniyle bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Ayak parmağınızı sıkıştırarak uygun sedasyon seviyesini onaylayarak başlayın, ardından fareyi diseksiyon mikroskobu altında bir ısınma pedine yerleştirin ve uzuvları kısıtlayın.
Daha sonra, pubisten ksifoide kadar orta hat karın derisi kesisi yapın, ardından linea alba boyunca peritonda benzer bir kesi yapın. Mesaneye veya bağırsağa zarar vermemeye dikkat ederek karın içine girin ve karaciğeri ksifoid sürecinin yakınında anteriordan peritondan serbest bırakın. Karaciğerin sağ lobunun alt sınırında deri ve periton boyunca enine bir kesi yapın ve ksifoid sürecini geri çekmek için kavisli bir sivrisinek kelepçesi kullanın.
Kaburgaları orta hattan mümkün olduğunca açmak için kaburga ekartörleri kullanın ve falsiform, frenik ve gastrik bağları kesin. Daha sonra karaciğeri yukarı çevirmek için nemli steril pamuklu çubuklar kullanın ve portaya erişmek için gerektiği kadar ek bağları kesin. Tuzlu suyla nemlendirilmiş gazlı bez kullanarak, karaciğeri viseral olarak döndürün, ardından portal hilumun üzerindeki gevşek bağ dokusunu ve portal venin uzunluğunu kaplayan gevşek bağ dokusunu çıkarın.
Forseps kullanarak, bir pencere yapmak için gevşek bağ dokusunu posterior sol portal ven, arter ve safra kanalına itin ve damarları 4-0 Potts sütür ile gevşek bir şekilde sarın. Daha sonra arka dalın üzerindeki gevşek bağ dokusunu sağ böbrekteki portal vene kadar temizleyin. Daha sonra, inferior vena kavadan 0,5 mililitre kan almak için bir insülin şırıngası kullanın ve kanı küçük bir şişeye aktarın.
Numuneyi santrifüjleyin ve serum sıvı nitrojen içinde ani dondurma için yeni bir şişede toplayın. İki parça 7-0 sütür kesin. İlk 7-0 halkayı mümkün olduğunca medial sol portal venin etrafına yerleştirin ve damarı geri çekmek için kavisli bir sivrisinek kelepçesi kullanın.
Posterior dala gevşek bir şekilde bağlanmış ikinci bir 7-0 halkayı, portal ven ile kesişme noktasına yakın bir yerde portal ven üzerine yerleştirin. Şimdi, infüzyon pompasını% 0.9 salin içinde üç mililitre reaktif içeren beş mililitrelik bir şırınga ile yükleyin ve boruyu doldurun. Kanülasyon sırasında kanamayı azaltmak için distal portal veni kavramak için bir mikrocerrahi kelepçe kullanın ve 7-0 stay sütür ile portal ven ile kesişimi arasındaki damarda 0,5 milimetrelik bir delik açmak için küçük mikrocerrahi makas kullanın.
27-0'lık bir kateter kullanarak, sol portal venöz sistemi kanüle edin ve kateteri sol ve sağ portal venlerin çatallanmasını geçecek şekilde yerleştirin. Kanülün yerleşimini doğrulamak için bir mililitre normal salin verin ve karaciğerin sol lateral ve medyan loblarının ağarmasını izleyin. Kateterin sağ portal venin kalkışını geçtiğini, ancak medyan lobu besleyen portal venin kalkışının ötesine geçmediğini manuel olarak değerlendirin, ardından Potts sütürünü sıkın, kateteri 7-0 sütürle sabitleyin ve kelepçeyi distal portal venden çıkarın.
İnfüzyon boyunca hayvanın yaşamsal belirtilerinin sürekli izlenmesiyle, 15 dakikalık bir teslimat süresi boyunca ilgilenilen reaktifin iki mililitresinin infüzyonuna hemen başlayın. İskemik zamanın başlangıcından bir saat sonra, Potts sütürünü ve kateteri çıkarın, ardından arka daldaki 7-0 sütürü portal ven'e sıkıştırın. Reperfüzyonun başlamasından iki saat sonra, inferior vena kavadan yavaşça 0.5 mililitre kan çekin, ardından kanın yeni bir şişeye yavaşça damlatılarak aktarılmasını izleyin.
Damardaki kanamayı durdurmak için gerektiği gibi hafif bir baskı uygulayın. Daha sonra kanı santrifüjleyin ve az önce gösterildiği gibi aşağı akış işlemi için serumun yarısını dondurun. Deneysel son noktada, diyaframı bir daire şeklinde kesin ve karaciğeri periton boşluğuna bağlayan kalan ek bağ dokusunu kesin.
Karaciğeri toplayın ve sol ve orta loblardan dört büyük örnek ve sağ lobdan dört büyük örnek alın. Daha sonra numuneleri ayrı ayrı etiketli şişelere yerleştirin ve sonraki işlemler için dokuları sıvı nitrojen içinde dondurun. Normal salin ve PEG-SOD infüzyonlu hiler klempli hayvanlarda serum alanin aminotransferaz ölçümü, reperfüzyondan 120 dakika sonra serum kontrolü ve deney hayvanı karaciğer enzim ekspresyon seviyeleri arasında anlamlı bir fark olduğunu göstermektedir.
Sağ, hiler olmayan klemp lobda doku malondialdehit ekspresyonu kontrol ve deney grupları arasında anlamlı bir fark göstermedi. Bununla birlikte, sol post-hiler klemp ve reperfüzyon lobu, kontrol reperfüze olmayan, infüzyonsuz lob ve sağ PEG-SOD infüzyonlu lob ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir doku malondialdehit ekspresyonu seviyesi gösterir. Aynı model doku glutatyon ekspresyonu için de gözlenir.
Western blot analizi, PEG-SOD infüzyonu ile tedavi edilen hayvanlarda hiler klemp ve reperfüzyondan sonra sol lobda artmış bölünmüş kaspaz-3 ekspresyon seviyesinin azaldığını gösterir, bu farklılıkların dansitometri ile anlamlı olduğu doğrulanmıştır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa üç saat 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, distal portal ven klempini yerleştirirken kanülasyon için portal ven dalında önemli miktarda traksiyon elde etmeyi unutmamak önemlidir.
Bu prosedüre hakim olduktan sonra, çeşitli farmakolojik maddelerin etkisini keşfetmek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, sol portal venöz sistemin nasıl kanüle edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, farmakolojik moleküllerin iskemi-reperfüzyon hasarı üzerindeki etkilerini incelemek için tasarlanmış özgün bir sıçan karaciğer hilus klempi modelini sunmaktadır. Bu model, maddelerin portal ven aracılığıyla doğrudan karaciğere iletilmesine olanak tanıyarak karaciğer transplantasyonu alanındaki hedef odaklı araştırmaları kolaylaştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Farmakoloji
- Karaciğer Nakli
Arka Plan
- İskemi-reperfüzyon hasarı, karaciğer transplantasyonunda kritik bir sorundur.
- Farmakolojik müdahalelerin anlaşılması transplantasyon sonuçlarını iyileştirebilir.
- Doğrudan infüzyon yöntemleri, terapötik ajanların etkinliğini artırabilir.
- Cerrahi tekniklerin görsel gösterimi, tekrarlanabilirlik açısından esastır.
Çalışmanın Amacı
- Karaciğer iskemi-reperfüzyon hasarında farmakolojik ajanları incelemek için bir model geliştirmek.
- İnfüze edilen moleküllerin karaciğer sağlığı üzerindeki doğrudan etkilerini değerlendirmek.
- Diğer organ nakli senaryolarına uygulanabilir bir metodoloji sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Portal ven kanülasyonu ile sıçan karaciğer hiler klempi modeli.
- Farmakolojik ajanların portal vene doğrudan infüzyonu.
- İnfüzyon işlemi sırasında yaşamsal bulguların izlenmesi.
- Reperfüzyon sonrası serum ve doku örneklerinin toplanması ve analizi.
Temel Sonuçlar
- Tedavi sonrası serum alanin aminotransfer seviyelerinde anlamlı farklılıklar.
- Tedavi edilen karaciğer loblarında artmış doku malondialdehit ekspresyonu.
- Western blot analizi, değişmiş cleaved caspase-3 seviyelerini göstermiştir.
- Farmakolojik ajanların hasarı hafifletme potansiyeli kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Sıçan karaciğer hilum klemp modeli, iskemi-reperfüzyon hasarının incelenmesi için etkilidir.
- Doğrudan infüzyon teknikleri terapötik etkinliği artırabilir.
- Bulgular, organ transplantasyonundaki gelecekteki stratejilere ışık tutabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu sıçan karaciğer hiler klempi modeli, farmakolojik ajanların iskemik hepatik segmentlere hedeflenmiş bir şekilde iletilmesini sağlayarak sistemik maruziyeti azaltır ve iskemi-reperfüzyon hasarına ilişkin mekanistik içgörüyü artırır. Portal venöz sisteme doğrudan infüzyona olanak tanıyan bu yöntem, dokuya özgü son noktalarda iyileştirilmiş sinyal-gürültü oranı ile sitoprotektif bileşiklerin preklinik değerlendirmesini destekler. Bu yaklaşım, hepatik etkileri sistemik karıştırıcı faktörlerden izole ederek, karaciğer transplantasyonu ve diğer organ perfüzyon stratejileri için öncü adayların risklerinin azaltılmasına yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Test bileşiklerini doğrudan iskemik karaciğer lobuna ileterek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır ve hedef üzerindeki etki mekanizmalarını netleştirir.
- Operasyonel Değer: Gereken bileşik hacmini azaltır ve hedef dışı etkileri minimize ederek assay hassasiyetini ve hedef özgüllüğünü artırır.
- Translasyonel Değer: Hastalıkla ilgili bir I/R modelinde hedef doğrulamayı destekleyerek, daha büyük türlere geçmeden önce patofizyolojik uygunlığa olan güveni artırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Serum ALT ve doku MDA seviyeleri gibi nicelenebilir biyokimyasal okumalar oluşturarak, hepatoprotektif aktivite için standartlaştırılmış bileşik taramasına olanak tanır.
- Tekrarlanabilirlik: Cerrahi model, tutarlı iskemik hasar modelleri sağlayarak deneysel gruplar arasında güvenilir doz-yanıt değerlendirmelerini destekler.
- Ölçeklenebilirlik: Uzmanlaşıldığında prosedür, birden fazla farmakolojik ajanın kontrollü ve segmente özgü bir şekilde tekrarlı olarak test edilmesine imkan verir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Organ temini ve transplantasyonu sırasındaki klinik sıcak iskemiyi taklit ederek greft hasarı ve disfonksiyonu için öngörücü bir model sunar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Cleaved caspase-3 ve lipid peroksidasyonu gibi temel hasar belirteçleri üzerinde antioksidan ve anti-apoptotik ajanların (örneğin, PEG-SOD) değerlendirilmesine olanak tanır.
- Preklinik Süreklilik: Karaciğerdeki hedef etkileşimini, enzim salınımı ve oksidatif stresle ilişkili fonksiyonel sonuçlara bağlayarak öncü bileşik optimizasyonunu kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Model, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe uyum sağlayarak, daha geniş farmakokinetik veya toksikoloji profillemeleri öncesinde sitoprotektif ajanların erken evre mekanistik taramasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: İlaç etkilerini I/R hasarına uğrayan hepatik segmentle sınırlayarak yolak aydınlatılması ve hedef doğrulamayı destekler.
- Tarama: ALT salınımı ve MDA oluşumu gibi nicelleştirilebilir çıktılar aracılığıyla bileşik etkinliğinin standartlaştırılmış değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitikler: Bileşik mekanizmalarını ve potensini karşılaştırmak için çoklu okumalar (enzimatik, oksidatif, apoptotik) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hepatik korumayı transplantasyonla ilgili sonuçlarla ilişkilendirerek organ koruma stratejileri için karar verme süreçlerini destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Cerrahi platform, birden fazla bileşik test kampanyasında yeniden kullanılabilir; böylece model geliştirme ve operatör eğitimindeki yatırım getirisi maksimize edilir.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Farmakokinetik değişkenliği azaltarak ve karaciğer spesifik farmakodinamiğe odaklanarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış vasküler erişim ve segmental perfüzyon yoluyla tekrarlanabilirliği geliştirir, hayvanlar arası değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: İlgili bir patofizyolojik bağlamda hızlı yapı-aktivite ilişkisi testlerine olanak tanıyarak öncü bileşik tanımlama verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Keşif sürecinin erken aşamalarında mekanistik ve etkinlik verileri sağlayarak, transplantasyon programları için sitoprotektif adayların risk ayarlı önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Mikrosirürjikal vasküler kanülasyon ve kemirgen hepatik anatomisi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Mikrosiringler, ince sütürler ve büyütme sistemleri dahil olmak üzere hassas enstrümantasyona bağımlıdır.
- Sıcaklığın korunması ve hayati bulguların izlenmesi dahil olmak üzere standardize perioperatif bakım gerektirir.
- Diğer loblara veya organlara uyarlama, anatomik yeniden haritalama ve damar boyutu ayarı gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında, titiz bir eğitim olmaksızın laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği etkileyebilecek teknik karmaşıklık ve operatör bağımlılığı yer almaktadır.
