Name: hyperpolarized 13 C Metabolik Manyetik Rezonans Spektroskopisi ve Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Öğrenin, dinamik nükleer polarizasyon ile hiperpolarize edilmiş karbon-13 moleküllerini kullanarak prostat karsinom hücrelerinde laktat dehidrojenaz aktivitesini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik metabolik süreçleri canlı organizmalarda izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.K., Münih Teknik Üniversitesi'ndeki Biyomühendislik Enstitüsü'nün (GSB) desteğini minnetle kabul eder. Bu çalışma, SFB İşbirlikçi Araştırma Merkezi 824, "Kanser Tedavilerinin Seçimi, İzlenmesi ve Bireyselleştirilmesi için Görüntüleme" bünyesindeki Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından desteklenmiştir.

1. Numune Stok Çözeltisinin Hazırlanması
<ol>
	<li>1-mmol/L GadM nihai konsantrasyonu elde etmek için konsantre [1-13C]pirüvik asite gadoterat meglumin (GadM, 0.5 mol/L) ekleyin. Bu karışıma, nihai konsantrasyonu 15 mmol/L olacak şekilde trityl radikal tris (8-karboksi-2,2,6,6-tetra-(hidroksietil)-benzo-[1,2-4,5]-bis-(1,3)-ditiyol-4-il)-metil sodyum tuzu (OX063) ekleyin. Tam çözünme gerçekleşene kadar vorteksleyin. 
	NOT: Bu stok çözelti hazırlığı, 3.35-T preklinik DNP hiperpolarizör ile kullanım için tasarlanmıştır. 7-T klinik hiperpolarizör kullanıldığında, daha yüksek manyetik alanda sağladığı faydalar ihmal edilebilir düzeyde olduğundan gadoterat meglumin gerekli değildir. Gadolinyum bazlı bir kontrast maddenin eklenmesi, ulaşılabilir katı hal polarizasyonunu ve polarizasyon hızını artır. Ancak sıvı halde kontrast madde, T1 relaksasyon süresini kısaltır.</li>
</ol>
2. Hücre Kültürünün Büyütülmesi
<ol>
	<li>PC3 hücrelerini 125-cm2 büyüme alanına sahip bir kültür flaskında büyütün. %10 fetal calf serum (FCS) içeren F-12K besiyeri kullanın ve hücreleri nemlendirilmiş bir atmosferde, 37 °C ve %5 CO2 koşullarında tutun. Çözünürleştirme adımından önce, besiyerini kültür flaskından uzaklaştırın. 
	NOT: Her hücre hattı, hücre çoğaltımı için özel bir hazırlama protokolü gerektirir. Gereksinimler için hücre hattı sağlayıcısına danışın.</li>
</ol>
3. Deney için Hücrelerin Hazırlanması
<ol>
	<li>Hücre besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri ~ 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>Balona 5 mL tripsin ekleyin ve hücre kültürü balonlarını 3 ila 5 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.</li>
	<li>Tripsini inaktive etmek için yaklaşık 5 mL F-12K medyumu ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri otomatik bir hücre sayıcı kullanarak sayın. Karıştırın. 10 µL hücre solüsyonunun ... ile 10 µL boyama çözeltisinin. Pipetle iyice karıştırın ve aktarın 10 µL karışımın "sayım lamı" haznesine.</li>
	<li>Flasklardaki hücreleri uzaklaştırın ve sayın. İstenen sayıda hücre içeren uygun hacimleri aktarın (ör. 5 x 106 10'a kadar8) plastik tüplere.</li>
	<li>Hücreleri 1.20 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.</li>
	<li>Hücreleri, toplam hacim şu miktara ulaşana kadar %10 FCS içeren F-12K ortamında yeniden süspande edin: 800 μL ve bunları bir reaksiyon kabına (2 mL) aktarın. Reaksiyon kabını sıcak suyla doldurulmuş plastik bir tüpe yerleştirin.</li>
</ol>
4. Çözündürme Ajanının Hazırlanması
NOT: Çözünme ajanı, hiperpolarize numuneyi çözmek için kullanılan bir sıvıdır. Biyolojik uygulamalarda çözünme, genellikle PBS veya 1 g/L etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren tris(hidroksimetil)aminometan (Tris) gibi H2O bazlı veya döteryum oksit (D2O) bazlı tamponlarla gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>20 mmol/L PBS tamponunun hazırlanması
	<ol>
		<li>10 mL çözücü hazırlamak için; 36 mg monosodyum fosfat (NaH2PO4), 247 mg disodyum fosfat (Na2HPO4) ve 10 mg EDTA'yı, D2O içindeki 20 mmol/L sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisinde çözün. Tam çözünme gerçekleşene kadar uygun şekilde karıştırın. 
		NOT: Hiperpolarizasyonu bozabilecek olası ferromanyetik iyonları uzaklaştırmak için tampona EDTA (1 g/L) eklenir. NaOH, pH 7,4 değerine ulaşmak için piruvat asidini 1:1 mol oranında nötralize etmek amacıyla kullanılır.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Değişken Sıcaklık Eklemeli Parçanın (VTI) Soğutulması
<ol>
	<li>DNP-NMR polarizatör programının ana penceresinde, "Cooldown" seçeneğine tıklayın. 
	NOT: Bu işlem vakum pompasını çalıştırır ve VTI'yi yaklaşık 5,0 mbar'a kadar tahliye eder. Ardından, VTI ile sıvı helyum rezervuarı arasındaki iğne valf tamamen açılarak sıvı helyumun VTI'ye akmasını sağlar. Akış hızı, helyum kaynama sıcaklığına ulaşana kadar VTI'de optimal miktarda sıvı helyum bulundurmak için iğne valf aracılığıyla düzenlenir. Daha sonra VTI neredeyse tam vakuma kadar tahliye edilir ve sıcaklık yaklaşık 1,4 K'ye ulaşır. VTI, %65 oranında sıvı helyum ile doldurulur. Bu noktada, cihaz numune yerleştirmeye hazırdır.</li>
</ol>
6. Numune Hazırlama ve Yerleştirme
<ol>
	<li>Bir mikropipet kullanarak, plastik bir kaba ~ 8 µL 13C işaretli numune stok çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Plastik kabı yerleştirme çubuğuna takın ve ana program penceresindeki "Insert sample" (Numuneyi yerleştir) düğmesine basarak numune yerleştirme işlemini başlatın. "Normal sample" (Normal numune) seçeneğini belirleyin ve "Continue" (Devam et) düğmesine tıklayın. 
	NOT: Bu işlem sırasında, önce VTI'ye sıvı helyum akışını kesmek için iğne valf kapanır ve ardından VTI içindeki basınç artar. VTI içindeki numune tutucu sıvı helyumdan yukarı kaldırılır, VTI'nin üst kısmındaki giriş valfi açılır ve hava nemi nedeniyle oluşabilecek dış kontaminasyonu önlemek için giriş valfinden gaz halindeki helyum akışı sağlanır.</li>
	<li>İstendiğinde, plastik kabın takılı olduğu yerleştirme çubuğunu VTI'nin içine doğru aşağı itin. VTI'nin altındaki numune tutucuya ulaştığınızdan emin olun. Aksi takdirde, gaz halindeki helyum numuneyi VTI'den dışarı itebilir.</li>
	<li>Yerleştirme çubuğunu ayırın ve çıkarın.</li>
	<li>Dialog penceresindeki "Next" (İleri) düğmesine tıklayarak işlemi tamamlayın. Numune yerleştirme prosedürü 10 s'den uzun sürmemelidir. 
	NOT: Ardından giriş valfi kapanır, gaz halindeki helyum akışı kesilir, numune kabının bulunduğu numune tutucu sıvı helyumun içine daldırılır ve sıvı helyumun VTI'ye akmasını sağlamak için iğne valf açılır. 5 - 10 dk sonra VTI, 1.4 K'nin altına soğutularak tüm serbest elektronların polarize olması sağlanır.</li>
	<li>Numunenin bulunduğu plastik kabın, yerleştirme çubuğuna takılı kalmadığını veya helyum gazı tarafından VTI'den dışarı itilmediğini kontrol ederek VTI'ye doğru şekilde yerleştirildiğini onaylayın. Ardından "Finish" (Bitir) düğmesine tıklayın.</li>
</ol>
7. Mikrodalga Taraması (isteğe bağlı)
NOT: Bir mikrodalga taraması, hedef bileşikteki 13C çekirdeklerinin hiperpolarizasyon hızını maksimize etmek için optimal mikrodalga frekansının belirlenmesini sağlar.
<ol>
	<li>Mikrodalga taramasını ölçmek için RINMR programını başlatın, "HYPERSENSENMR" yazın, ardından "Select Config" ve "Do Microsweep" seçeneklerine tıklayın.</li>
	<li>İşlemi başlatmak için ana program penceresindeki "calibrate" sekmesini seçin.</li>
	<li>"Generate" butonuna tıklayın ve başlangıç ile bitiş frekansını (örneğin, 94.10 GHz-94.20 GHz), frekans adım boyutunu (örneğin, 20 MHz), gücü (10 mW) ve süreyi (60 s) belirleyin. "Continue", "Enable" ve "Start" seçeneklerine tıklayın. 
	NOT: Bu ayarlar ile hiperpolarizer, önce numuneyi 94.10 GHz mikrodalga frekansı ve 10 mW güç kullanarak 60 s boyunca polarize eder. Ardından, 90° radyo frekans (RF) darbesi uygular ve yerleşik spektrometre kullanarak hiperpolarize 13C sinyalini toplar. Bu adımlar, belirtilen frekans aralığındaki her adım için tekrarlanır. Sonraki hiperpolarizasyon işlemi için, ölçülen en yüksek sinyal genliğine sahip mikrodalga frekansını seçin.</li>
</ol>
8. Polarizasyon
<ol>
	<li>Polarizasyon artışını ölçmek için RINMR programını başlatın, "HYPERSENSENMR" yazın ve "Select Config" ile "Solid Build-up" seçeneklerine tıklayın.</li>
	<li>DNP-NMR polarizör programının ana penceresinde, hiperpolarizasyon işlemini başlatmak için "Polarization" seçeneğine tıklayın.</li>
	<li>Numune için optimal mikrodalga frekansını (mikrodalga taraması sırasında elde edilen) ve gücü (örneğin, 10 mW) seçin ve "Next" butonuna tıklayın.</li>
	<li>"Polarization build-up monitoring" seçeneğini etkinleştirin ve "Finish" butonuna tıklayın.</li>
	<li>Numuneyi &gt; 95% oranında polarize edin ([1-13C]piruvat için ~ 60 dk). 
	NOT: Polarizasyon sırasında, mikrodalgalar VTI'ya ve numuneye yönlendirilerek 13C spinlerinin hiperpolarize edilmiş eşleşmemiş elektron spinleriyle hizalanması sağlanır. Hiperpolarizasyon artışını ölçmek için 5°'lik bir çevirme açısına (FA) sahip RF darbeleri periyodik olarak ( örneğin, her 30 s'de bir) uygulanır ve elde edilen sinyal bir polarizasyon artış eğrisi olarak çizilir.</li>
</ol>
9. Çözünme
<ol>
	<li>Polarizasyon ulaştığında &gt; %95, DNP-NMR polarizör programının ana penceresindeki "Dissolution" (Çözünme) seçeneğine tıklayarak çözünme işlemini başlatın.</li>
	<li>Açılır menüden çözünme işlemini seçin ve "İleri"ye tıklayın. 
	NOT: Polarizör, sürükleyici gazın zamanlamasını seçerek istenen çözünme sürecinin tanımlanmasına olanak tanır.</li>
	<li>Çözünürlük ajanının yaklaşık 5 mL'sini, polarizörün çözünürlük kısmındaki ısıtmalı bir kaba üst valf aracılığıyla yükleyin. Gerekli olan çözünürlük ajanının kesin hacmini aşağıdaki denklemle hesaplayın: 
	<img alt="Statik denge denklemi; V_{DA} formülü." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Denklem 1"> 
	burada VDA çözücü maddenin istenen hacmi, mPA, mOX063, ve mGad piruvat, OX063 ve gadoterat meglumin kütleleri sırasıyla numune stok çözeltisine eklenir.</li>
	<li>Çözünme çubuğunu giriş valfinin üzerindeki aktif konuma yerleştirin. 
	NOT: Bu, cihazın çözünme düzeneğinin VTI'daki numune kabına bağlanmasını sağlar.</li>
	<li>Çözünme işlemini başlatmak için "Finish" (Bitir) düğmesine tıklayın. 
	NOT: Çözündürme ajanı helyum gazı ile 3 bar basınçla basınçlandırılır ve ardından şu sıcaklığa kadar ısıtılır: 200 °Cve bu durum basınç artışına neden olur. Basınç 10 bar seviyesine ulaştığında, VTI'ya sıvı helyum akışını durdurmak için iğne vana kapanır. Numune tutucu, kabı sıvı helyumdan yukarı kaldırır. Çözündürme çubuğu VTI'nın içine indirilir ve numune kabına bağlanır. Çözündürme tamponu ve helyum gazı içeren ısıtma kabından kaynaklanan basınç, koşullandırılmış çözündürme ajanını çözündürme çubuğu üzerinden kaba doğru iterek numunenin hızla çözünmesini sağlar. Çözelti daha sonra plastik borular aracılığıyla toplama balonuna akar. Ardından, bağlı olduğu kapla birlikte çözündürme çubuğu VTI'dan yukarı kaldırılır.</li>
	<li>Bağlı olan kapla birlikte çözünme çubuğunu "temizlik" konumuna getirin ve "Bitir"e tıklayarak işlemi tamamlayın.</li>
</ol>
10. 13C Hiperpolarize Sinyalin Tespiti
<ol>
	<li>13C metabolik manyetik rezonans spektroskopisi in vitro
	<ol>
		<li>Karıştırın 200 µL toplama balonundaki 20 mmol/L çözünmüş hiperpolarize örneğin ... ile 800 µL hücre çözeltisinin. 
		NOT: [1-13Pyruvat konsantrasyonu 4 mmol/L'dir.</li>
		<li>Süspansiyonu bir mikropipet kullanarak iyice karıştırın ve ~ miktarını aktarın 600 µL 5 mm'lik bir NMR tüpüne.</li>
		<li>5 mm'lik NMR tüpünü 1-T NMR spektrometresine yerleştirin. Yazılımın ana penceresinde, yüz adetlik bir seriyi uygulayarak ölçümü başlatmak için "Run" seçeneğine tıklayın. 10° Her 3 saniyede bir RF darbeleri. 
		NOT: Hiperpolarize örneğin hücrelerle ilk karıştırılması ile spektroskobik veri toplama işleminin başlangıcı arasındaki süreyi ölçün. Polarizasyon kaybını minimize etmek için karıştırma işleminin 30 saniyeyi geçmediğinden emin olun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>13C metabolik manyetik rezonans görüntüleme
	<ol>
		<li>... için bir kap oluşturmak üzere in vitro MRI spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilen deneylerde, 5 mL'lik bir şırınga alın ve bunu, spektrometrenin izo-merkezinden spektrometrenin erişilebilir alanına kadar ulaşacak uzunlukta olan bir katetere (d = 1,2 mm) bağlayın.</li>
		<li>Doldurun in vitro deney için istenen konsantrasyondaki hücre çözeltisini içeren kap (örneğin, 108) veya enzimatik bir solüsyon ile.</li>
		<li>Yerleştirin in vitro MRI mıknatısının izosantrındaki kap. Yerleştirin 13Kap üzerindeki C-ayarlı radyo frekans alıcı bobini. Konsantre bir tane yerleştirin 13C-etiketli kalibrasyon fantomu (örneğin, 10 mol/L 13C-üre) yakınlarda.</li>
		<li>"in vitro NMR tarayıcısının izomerkezine yakın konumlandırılmış kap.</li>
		<li>Tarayıcının standart 3 düzlemli lokalizasyon sekansını çalıştırın ve şunları ayarlayın: in vitro gerektiğinde, kabın izo-merkeze olan konumu.</li>
		<li>Çalıştırın 1T2 ağırlıklı, şu bölgeyi kapsayan "anatomik" sekans in vitro konteyner lokalizasyonu. Şu ayarları kullanın: aksiyal yönlendirmeli 2D spin ekosu, tekrarlama süresi (TR) = 2.00 ms, eko süresi (TE) = 20 ms, kesit kalınlığı = 1 mm, şu alanı kapsayan görüş alanı: in vitro kap ve her uyarma başına 16 eko. Bu adım sırasında alan şimlemesinin protonlar üzerinde yapıldığından emin olun.</li>
		<li>Anatomik görüntülerde, ilgilen bölge merkezli 5 ardışık kesit seçin. Şunu reçete edin: 13Seçilen anatomik kesitleri kapsayan C spektroskopik kalibrasyon alımı gerçekleştirin. Şu ayarları kullanın: aksiyal oryantasyonlu 12 x 12 merkezcil kodlamalı 2D Block-Siegert kalibrasyon dizisi, TR = 1.0 ms, kesit kalınlığı = 5 mm, anatomik görüntülerle eşleşen görüş alanı, tarama sayısı (NS) = 64, bant genişliği = 5.00 Hz ve FA = 90°.</li>
		<li>Seçin 13C spektroskobik kalibrasyon dizisi (daha fazla bilgi için bkz. Schulte ve ark. 2011)75 darbe dizisi kütüphanesinden. "Download" seçeneğine tıklayarak darbe dizisini bilgisayardan tarayıcıya indirin. Spektroskopik ön taramayı çalıştırmak için "Spectra Prescan" seçeneğine tıklayın. Spektrum genlik grafiğinde, piki şuradan ayarlayın: 13C kalibrasyon fantomunu tarayıcı frekansının merkezine yerleştirin. Alıcı kazançlarını maksimuma ayarlayın. İşlemi başlatmak için "Start" düğmesine tıklayın. 13C spektroskopik kalibrasyon dizisi. Bildirilen iletim kazancı ve merkez frekansına dikkat edin.</li>
		<li>Set a 13Seçilen anatomik kesimleri kapsayan C kimyasal kayma görüntüleme (CSI) alımı gerçekleştirin. Şu ayarları kullanın: aksiyal oryantasyonlu, 12 x 12 merkezcil kodlamalı 2D eko-planar spektroskopik görüntüleme (EPSI), TR = 40 ms, kesit kalınlığı = 5 mm, anatomik görüntülerle eşleşen görüş alanı, NS = 30 ve bant genişliği = 5.0 Hz. 
		NOT: EPSI, hem uzamsal hem de spektral bilgiyi eş zamanlı olarak elde etmek için tek bir RF uyarımından sonra k-uzayındaki tek bir hattı tekrarlanan şekilde örnekler. Görüntüleme teknikleri hakkında daha fazla bilgi için Durst tarafından yazılan makaleye bakınız. ve ark. 201576.</li>
		<li>İndirin 13C CSI dizisini uygulayın ve spektroskopik ön taramayı başlatın. Tarayıcı frekansını ayarlayın ve kalibrasyon dizisi çıktısında belirtilen kazancı iletin.</li>
		<li>Hiperpolarize çözelti toplama balonuna aktarıldıktan sonra, yaklaşık 3 mL'sini bir şırıngaya çekin ve ardından bunu şu kısma bağlı katetere enjekte edin: in vitro kap. Edinimi başlatın. Edinme işlemi tamamlandıktan sonra, sonraki rekonstrüksiyon işlemleri için ham veri dosyasını kaydedin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
1. Veri Rekonstrüksiyonu
<ol>
	<li>Elde edilen verileri analiz etmek için tanımlanan iki kinetik modelden birini uygulayın.
	<ol>
		<li>LDH kinetiğini tanımlamak için kullanılan ilk yöntemde, kinetik değer (k) için laktat sinyalinin toplamını (MLAC) tüm hiperpolarize moleküllerin sinyaline (MGirdi sağlanmadı. Lütfen çevrilmesini istediğiniz metni iletiniz.)21,77. 
		<img alt="Kimyasal kinetikteki dinamik denge sabiti k için, k=M_LAC/ΣM_x formülünü gösteren denklem." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Denklem 2"></li>
		<li>Diğer yöntemde, laktat ve piruvat sinyallerini zaman içinde ölçün ve bunları kinetik bir modele uydurun.17,25,71Metabolik değişim oranını hesaplamak için, kPA→LACve laktatın etkin sinyal sönümleme hızı, rLAClaktat için şu sonuçları veren iki bölgeli değişim diferansiyel modelini kullanan aşağıdaki lineer diferansiyel denklemleri kullanın: 
		 
		<img alt="Biyokimyasal süreç için diferansiyel denklem; zamanla meydana gelen hız değişimini betimler; formül analizi." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Denklem 3"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Not: Efektif laktat sinyal sönümlenme hızı rLAC laktat boylamsal gevşeme süresine bağlıdır (T1,LAC), laktattan piruvata doğru ters yönlü metabolik değişim oranı kLAC→PAuygulanan FA ve TR ile piruvatın (MPA) ve laktat (MLAC), her bir ardışık uyarılmadan sonra meydana gelen geri dönüşümsüz sinyal azalması dikkate alınarak: 
 
<img alt="Metabolik hız denklemi, rLAC formülü; biyokimyasal araştırmalarda kinetik analiz." src="/files/ftp_upload/54751/54751eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Denklem 4">
Bu nedenle, rLAC tek bir ayrılmaz sinyal sönümlenmesi terimiyle sonuçlanır. Flip açısı ve tekrarlama süresi düzeltilebildiği için ve LAC→PA akışı olsa dahi, Harrison et al. 201278 sonuçlarına dayanarak, laktattan piruvata değişim hızının (kLAC→PA) hesaplamaya dahil edilmesine gerek olmadığını varsayıyoruz. Sonuçları, kLAC→PA'nın varsayılandan daha az kritik bir rol oynadığını göstermektedir. Bu mod, laktatın T1 relaksasyon süresinin nicelleştirilmesine olanak tanır. Bu model, ölçüme piruvat verilmesinden bağımsızdır; bu durum in vitro deneylerde kritik değildir ve ihmal edilebilir. Ancak in vivo ölçümler için önemli bir rol oynamaktadır79.

Rolf F. Schulte ve Marion I. Menzel, GE Global Research'te çalışıyor.

13Hiperpolarize problarla CMRSI, metabolizmayı gerçek zamanlı olarak in vitro ve in vivo olarak izlemek için umut verici bir yöntemdir. Bu deneysel süreci kullanırken çok önemli bir husus, özellikle in vitro deneylerle ilgili olarak uygun standardizasyondur. İlk olarak, her deneyde aynı hiperpolarize malzeme konsantrasyonunu elde etmek için numunenin hazırlanmasının düzgün ve tutarlı bir şekilde yapılması gerekir. Bu, hem hiperpolarize edilecek numunenin hem de tamponun hassas bir şe...

Halen, kanser geniş bir yelpazede tümör evrelemesinde, yeniden değerlendirilmesinde, tedaviye yanıt izleme ve nüks tespiti için en yaygın olarak kullanılan klinik yöntem [18F] -FDG PET olduğunu. 1 Ancak, son zamanlarda, çeşitli roman ve alternatif yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Bu yöntemlerden biri de 13 CMRSI olduğunu. Bu teknik, in vitro ya da gerçek zamanlı olarak in vivo metabolizma değerlendirmek için minimal invaziv MRI ardından, bir biyolojik numune içinde 13C-molekülünün giriş kapsar. Bununla birlikte, böyle [18F] -FDG PET veya bilgisayarlı tomografi gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 13 CMRSI en büyük zorluk, düşük sinyal-gürültü oranıdır. NMR sinyali polarizasyon seviyesi, toplam nüfus iki enerji Devletleri sıkma yarım çekirdekler nüfus değişimi bir oranı (Şekil 1A) ile doğru orantılıdır. Polarizasyon th ürünü olançekirdeklerin e dönermıknatıslık oranı (γ) ve sıcaklık üzerine uygulanan manyetik alan şiddeti. 1H çekirdeklerinin Tipik bir polarizasyon nispeten düşük bir sinyal-gürültü oranı veren 3 T, 0.001%,% 0.005 kadar düzenindedir. Bugünün state-of-the-art MR nedeniyle sadece biyolojik numunelerde 1 H yüksek bolluk ve 1 H yüksek dönermıknatıslık oranı başarılı bir görüntüleme yöntemi olmuştur (y olan 1H = 42,576 MHz / T). Ancak, karbon gibi diğer çekirdekler, gözlemleyerek daha talep ediyor. Sadece kararlı, manyetik etki karbon izotop, 13C, tüm karbon atomlarının% 1,1 oluşturur. Buna ek olarak, 13 ° C (γ 13C = 10,705 MHz / T) dönermıknatıslık oranı daha düşük bir algılama verimliliği yol 1 H dört kat daha düşüktür. Özetle, düşük 13C bolluğu ve düşük γ 13C termal 13 C ölçümleri 1 hassasiyeti 0,0176% elde etmek için nedenIn vivo 'H-NMR ölçümü. Dinamik Nükleer Polarizasyon 13 C ölçümlerinin nispeten zayıf duyarlılığı aşmak için bir yöntem DNP olduğunu. Başlangıçta Albert W. Overhauser tarafından 1953 yılında metal tanımlanmıştır. Yazısında, o şöyle demiştir: "iletim elektronlarının elektron spin rezonans doymuş ise, çekirdekler kendi dönermıknatıslık oranı elektron spin o olsaydı onlar olurdu aynı derecede polarize olacağı gösterilmiştir." 2 Sonra o yıl, Carver ve Slichter deneysel Overhauser hipotezini 3 doğruladı. 1958 yılında, Abragam ve Proctor sıvılardaki elektronlar için bu etkiyi tarif ve adını "katı etkisi." 4 K altındaki sıcaklıklarda, elektron spin polarizasyon yaklaşık% 100'e ulaştığında ve nükleer spin polarizasyon (Şekil 1B) 4 daha yüksek büyüklükte fazla üç emir olduğunu. Telektronun dönermıknatıslık oranı (y e = 28024,944 MHz / T) nükleer dönermıknatıslık oranları daha yüksek büyüklükte üç emir olduğu için onun oluşur. Elektron ilgili elektron yakın bir frekans ile, mikrodalga ışıma altında nükleer spin spin böyle Overhauser etkisi, katı etkisi, çapraz etkisi ve termal karıştırma etkisi elektron ve çekirdekler arasındaki zayıf etkileşimler, polarizasyon transferine izin paramanyetik rezonans (EPR) frekans 5,6. DNP teorisi daha fazla elektron ve termal karıştırma dahil etmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bugüne kadar, DNP hiçbir birleşik kantitatif teorik açıklama 7,8 yayımlanmıştır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Şekil 1: Dinamik Nükleer Polarizasyon ve hiperpolarizasyona anlama. Spin nüfusunun) şematik bir karşılaştırmasıTermal denge polarizasyon devlet ve hyperpolarized devlet. B) bir polarizasyon sıcaklığına bağlıdır. Bir elektron polarizasyonu (e -) 1.4 K. DNP altında% 100 10 5 kat kadar onların kutuplaşmayı arttırır 13 C çekirdeklere E- gelen kutuplaşma transferini sağlar ulaşır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 13C NMR kullanılarak biyolojik sistemlerin çalışmalarında DNP tanıtmak için, daha sonraki hızlı numune çözünme geliştirilmeye vardı. 50 yıl Overhauser hipotezi, Jan H. Ardenkjaer-Larsen ve ark sonra. Minimal hiperpolarizasyon kaybı 6 ile sıvı haline hiperpolarize dondurulmuş örnek getirme teknik açıdan zor sorunu çözüldü. Çözünme DNP yeni bir araştırma alanı 13 CMRS denilen açıldıBen, araştırmak ve çeşitli hastalık durumları 9,10 karakterize etmek için yeni bir yöntem sağlar. çiftlenmemiş elektronun, bir tritil radikal tris (8-karboksi-2,2,6,6-tetra (hidroksietil) benzopiran [1,2-4,5] bis- (1,3) olarak stabil taşıyıcılar -dithiole-4-il) -metil sodyum tuzu (OX063) ya da (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il) oksil (TEMPO), genellikle kullanılır. Bu arzu edilen 13 C-etiketli molekül ile karıştırıldı ve buna tekabül eden EPR frekansına yakın bir frekans ile mikrodalga ışımasına maruz kalmaktadır. Bu tekniği kullanarak, 13 C çekirdeklerin kutuplaşma% 37 11 kadar artırılabilir. Bu, termal denge polarizasyon 11,12 kıyasla 10 5 kat bir polarizasyon gelişmesine yarar. Ancak, mikrodalga ışınlama durdurulur ve / veya 13 C-molekül sıvı halde aktarılır en kısa sürede, polarizasyon polarize edilmiş 13C çekirdeğinin uzunlamasına gevşeme zamanı (T 1) ile bozunur. BöyleceHızlı çözünme teknikleri icat veya biyolojik uygulamalar 13 için çok önemlidir deneysel ölçüm (yani, enjeksiyon) önce süresini kısaltarak sonraki tekniği. Aday molekülü başarılı 13 CMRSI çalışmaları için yerine getirmek için gereken üç önemli gereksinimleri vardır. İlk olarak, ilgilenilen 13C çekirdeği yeterince uzun bir T 1 (&gt; 10 s) sahip olmalıdır. 13C-etiketin seçimi çok önemlidir. En iyi aday çekirdekleri bir bağ vasıtasıyla 1H-çekirdekleri ile doğrudan temas karbonlar vardır. Orijinal maddeden önemli ölçüde farklı bir kimyasal kayma ile alt baş metabolik ürün elde 3 T 1 kez - aynı zamanda hızlı bir şekilde 2 metabolize edilmesi gerekmektedir. Alansal dağılımı elektron ve 13 ° C arasındaki mesafeyi azaltır ve böylece örnek karışımı trans sağlayan bir amorf cam, düz bir halde oluşturmalıdırpolarizasyon ferin. Aday molekülün doğal amorf bir cam meydana gelmez, bu gliserol ya da dimetil sülfoksit 14 kadar yüksek bir camlama madde içinde eriyebilir olması gerekir. Bu şartlar Aday moleküllerin nispeten az sayıda sonuçlanır. Ancak, hatta uygun bir molekülün başarılı keşfinden sonra, hiperpolarizasyon için bir çalışma protokolü gelişmekte 9,14,15 teknik olarak zor olabilir. 36, [2- 13C] pirüvat 37, [1- 13C] etil piruvat 38, [1- 13 C - Son yıllarda, çok sayıda alt-tabakalar gibi [1- 13C] piruvat 12,16 olarak, başarılı bir şekilde polarize olmuş ] laktat 39, [1- 13C] fumarat 40-43, 13 Cı-bikarbonat 36,44,45, [1- 13C] sodyum asetat 43,46 - 49, 13 C-üre 6,36,50,51 , [5- 13C] glutamiNE 15,52,53, [1- 13C] glutamat 53,54, [1- 13C] 2-oksoglutarat 55, [1- 13C] alanin, ve diğer 14,56. Hiperpolarizasyon için özellikle ilgi çekicidir ve yaygın olarak kullanılan alt-tabaka [1- 13C] pirüvat olup. Çok çeşitli hastalıkların 14,17,22 hücresel enerji metabolizmasını araştırmak üzere klinik öncesi çalışmalarda kullanılmıştır. [1 13 C] pirüvat metabolize olan sonradan önce hücre zarından nispeten uzun T 1 ve hızlı ulaşım dahil olmak üzere başarılı hiperpolarizasyon için tüm gereksinimleri karşılamaktadır. [1 13 C] piruvat ile klinik öncesi çalışmalar halen klinikte 57 çevrilmektedir ediliyor. Piruvat metabolizması İyi bir kanser hücrelerinin DNA ve onların metabolik yollar değişikliklere mutasyon arasında doğrudan bir bağ var olduğu bilinmektedir. Zaten 1920'lerde, Otto Warburg discov60 - sağlıklı doku 58 göre tümörlerde glikoz ve laktat üretimi metabolizma artışı olduğunu göz önünde bulundurmuştur. Daha sonra, bu, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü ve oksidatif fosforilasyon ve nükleotidler ve lipid sentezleri gibi başka metabolik yol, çeşitli münavebeli tarif edilmiştir. Piruvat glikolizin nihai ürünü olan. Tümör, bu LDH 61 ile katalize anaerobik glikoliz maruz koenzim nikotinamid adenin dinükleotidin indirgenmiş formu ile reaksiyona (NADH), laktat ve koenzim (NAD +) oksitlenmiş formda elde edilir. Seçenek olarak ise, piruvat transaminaz alanin (ALT) ile katalize alanin oluşturulması için glutamat ile transaminasyon reaksiyonu maruz kalır. Her iki reaksiyon kolayca geri dönüşümlüdür. Piruvat, aynı zamanda, karbon dioksit ve asetil-CoA'nın, R, piruvat dehidrogenaz (PDH) ile katalize dekarboksilasyonu maruzBu aşamada geri dönülmez bir şekilde reaksiyon epresenting. Bu reaksiyon oranları Alternations tümör metabolizması 17,21,22,25,62 ile bağlantılı olabilir. Metabolik yollar Şekil 2'de özetlenmiştir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> Şekil 2: piruvat majör metabolik tepkime diyagramı. Piruvat / laktat dönüşüm LDH ile katalize edilir ve pirüvat / alanin dönüşüm ALT ile katalize edilmektedir. Piruvat tersinmez ve PDH CO 2,-asetil CoA'ya dönüştürülmesi ve CO2 bikarbonat 80 olan bir pH değerine bağımlı bir denge halindedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Hiperpolarize [1- 13C] piruvat ve metabolitlerinin tespiti daha önce farede gösterilmiştir Osanat 37,63 - 65, karaciğer 66, kas ve böbrek 62,67. Bir çalışmada, normal ve aç bırakılmış sıçan karaciğer 66 arasındaki laktat-alanine-oranında önemli farklılıklar gösterdi ve karaciğer kanseri 68,69 bir yüksek yükseltilmiş ve hiperpolarize [1- 13C] laktat düzeyi sergilemiştir. Tümör derecesi eksize tümörlerin histolojik grade ile yüksek korelasyon gösteren hyperpolarized laktat düzeyleri ile, hiperpolarize [1- 13 C] piruvat 22 kullanarak fare prostat (TRAMP) bir transgenik adenokarsinomaya tespit edilebilir olduğuna dair kanıtlar vardır. Alt ile piruvattan katalize alanin sıçan karaciğer kanseri 23 yararlı bir marker olarak önerilmiştir. Piruvat-laktat metabolik akı ölçümü, izlenmesi iskemi 63,65,70 ve sitotoksik kemoterapi 17,40, hedeflenen ilaç tedavisine yanıt olarak kullanılmıştır &lt;destek&gt; 24,25,41 ya da hayvan modellerinde, radyoterapi 26. Ayrıca, glioblastoma ve meme kanseri fare modellerinde 25 fosfatidilinositol 3-kinaz (PI3K) inhibitörü LY294002 yanıtının saptanması için kullanılmıştır. Beyindeki piruvat metabolizması değişiklikleri 26 ve prostat kanseri 24,71, aynı zamanda tedaviden sonra gözlenmiştir tümörler. prostat Kanseri Prostat kanseri tüm dünyada 72 erkeklerde ölüme bağlı yaşlı erkek ve ikinci lider kanser baskın kanser türüdür. Bugüne kadar hiçbir güvenilir, non-invaziv yöntemler sıkı algılama ve hastaların evreleme sağlamak için yeni metabolik görüntüleme teknikleri için acil ihtiyaç vurgulayan prostat kanseri 73,74 erken tanı ve karakterizasyonu için kullanılabilir. Prostat kanseri hastada 13 CMRSI ile birlikte çözünme DNP olanaklarını göstermek için bir model olarak kullanıldı57 s. Bu çalışma, prostat kanseri görüntüleme için bir ilk klinik istihdam deneme [1- 13 C] piruvat ve 13 CMRSI devam edildi ve sadece son zamanlarda (NCT01229618) tamamlandı gelmiştir. Bu çalışmanın arkasındaki motivasyon hücreleri ile bir preklinik ortamda 13 CMRSI yönteminin uygulanması daha detaylı ve daha geniş bir kitleye için göstermek için idi. PC3 prostat karsinomlu hücre çizgisi in vitro [1- 13C] laktata [1- 13C] piruvat LDH katalize metabolizma Ölçüm, in vitro çalışmalarda çözünme DNP olası uygulanabilirliğini ve önemli adımlar adres ve deneyler sırasında zorluklar.

<table><tbody><tr><td>HyperSense DNP Polarizör</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>3.35 T klinik öncesi DNP hiperpolarizör</td></tr><tr><td>GE/Agilent MR901</td><td>GE Healthcare/Agilent Technologies</td><td></td><td>7 T klinik öncesi MRI tarayıcı, onrodent deneyleri için tasarlanmış küçük delikli</td></tr><tr><td>Spinsolve Carbon</td><td>Magritek</td><td></td><td>1 T NMR spektrometresi kalıcı mıknatıslı</td></tr><tr><td>Döteryum Oksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monbazik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>Disodyum edetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Pirüvik asit - 13C1</td><td>Cambridge İzotopları Laboratuvarları</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Dotarem (0,5 mmol/L)</td><td>Guerbet</td><td></td><td>gadoterat meglumin&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>TRIS (8-Karboksi-2,2,6,6-tetra- (hidroksietil)-Benzo- [1,2&ndash; 4,5] -bis-(1,3) -ditiol-4-il) -metil sodyum tuzu (OX063)</td> <td>GE Healthcare</td><td></td><td>trityl radikali, serbest elektron kaynağı olarak kullanılır</td></tr><tr><td>PC3 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL1435</td><td></td></tr><tr><td>F-12K ortamı&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA Çözeltisi, 1x</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Örnek plastik kap</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013-MSDS</td><td></td></tr></tbody></table>

hyperpolarized 13 c metabolik manyetik rezonans spektroskopisi ve görüntüleme

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Geçmiş yıllarda, tümör evresi, yeniden değerlendirilmesinde, tedaviye yanıt izleme ve çeşitli kanserlerin nüks tespiti için yeni yöntemler 18 F-florodeoksiglukoz ([18 F ile state-of-the-art pozitron emisyon tomografisi ile birlikte ortaya çıkmıştır ] -FDG PET). 13C manyetik rezonans spektroskopi görüntüleme (13 CMRSI) in vivo ve gerçek zamanlı olarak metabolizma izlenmesini sağlayan bir minimal invaziv bir görüntüleme yöntemidir. 13C nükleer manyetik rezonans (NMR) göre herhangi bir başka yöntemle gibi, bu da 13 ° C ve düşük doğal bolluğu nispeten düşük dönermıknatıslık oranda düşük ısı polarizasyon ve daha sonraki bir düşük sinyal-gürültü oranının bir zorlukla karşı karşıya biyolojik örnekler. Bu sınırlamaları aşarak, daha sonraki numune çözünme ile dinamik nükleer polarizasyon (DNP) son zamanlarda yaygın olarak etkin ölçmek için NMR ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) sistemlerinde kullandıÇeşitli biyolojik sistemlerdeki çalışma ve görüntü anahtar metabolik yollar. 13 CMRSI kullanılan özellikle ilginç ve gelecek vaat eden bir molekül, son on yıl içinde, çok daha yakın in vitro klinik öncesi ve kullanılmaktadır, [1- 13 C] piruvat, hücresel enerji metabolizmasını araştırmak için klinik çalışmalarında araştırılmaktadır kanser ve diğer hastalıklar. Bu yazıda, bir 3.35 T preklinik DNP hyperpolarizer kullanarak çözünme DNP tekniğini anahat ve in vitro çalışmalarda kullanımını göstermektedir. Hiperpolarizasyon için benzer bir protokol hem de in vivo çalışmalarda çoğunlukla uygulanabilir. Bunu yapmak için, laktat dehidrojenaz (LDH) kullanılmış ve 13 CMRSI ile bir prostat karsinoma hücre hattı [1- 13 C] laktat, PC3, in vitro [1- 13C] piruvat metabolik reaksiyonu katalize.

“Mikrodalga tarama” sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu sonuçlar, yerel 3,35-T hiperpolarizer için [1-13C]piruvat örneğinin optimal mikrodalga frekansının 94,156 GHz olduğunu göstermektedir. Bundan sonraki tüm hiperpolarizasyon deneyleri (n = 14), 10 mW güçle bu mikrodalga frekansı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mikrodalga ışınlaması 60 ila 80 dk boyunca uygulanmış ve %90'tan yüksek bir katı hal hiperpolarizasyonu elde edilmiştir. Sonuçlar Şekil 4'te sunulmuştur. Hiper...

Dinamik nükleer polarizasyon ve ardından numune çözünmesi, biyolojik sistemlerde gerçek zamanlı metabolizma çalışmalarını mümkün kılmıştır. Hiperpolarize [1-13C] piruvat, in vitro bir prostat karsinomu hücre hattında laktat dehidrojenaz aktivitesini incelemek için kullanıldı.

hyperpolarized 13 C Metabolik Manyetik Rezonans Spektroskopisi ve Görüntüleme

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

Bu prosedürün genel amacı, dinamik nükleer polarizasyon kullanarak karbon 13 etiketli molekülleri hiperpolarize etmek ve in vitro olarak karbon 13 manyetik rezonans, retroskopik görüntüleme kullanarak enizmatik dönüşümlerini ölçmektir. Bu yöntem, karbonun rezonans sinyalini 10.000 ila 100.000 kat arttırır ve katmanlı bileşiklerin metabolik ürünlerinden ayırt edilmesini ve görüntüleme ile vücutta lokalize olmasını sağlar. Bu yöntemin VR tekniklerine kıyasla en büyük avantajı, canlı organizmalarda doğal olarak oluşan maddelerin metabolizmasının gerçek zamanlı olarak bir görünümünü sağlamasıdır.Ayrıca bu yöntem, kanserin metabolizması ve in vitro olduğu gibi içgörü sağlayabilir. Ayrıca hayvan modellerine ve insan hastalara da uygulanabilir. Bu tekniğin uygulanması tümör lokalizasyonunu aşmaktadır.Metabolik tümör alt tiplerini bulmak ve ayırt etmek ve en son tekniklerle birlikte tedaviyi izlemek için kullanılabilir. Prosedüre başlamak için, önce bir milimolar gadoterat meglumin çözeltisi ve konsantre bir karbon 13 piruvat hazırlayın. 15 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için karışıma trityl radikali OX063 ekleyin ve tamamen çözün.DNP Polarizer yazılımında, değişken sıcaklık ekinin veya VTI'nin sıcaklığını 1.4 kelvin'in altına düşürmek için Soğut'a tıklayın. VTI soğuduktan sonra, karbon 13 etiketli numune çözeltisinin yaklaşık sekiz mikrolitresini plastik bir numune kabına koyun. Kabı numune yerleştirme çubuğuna takın.Yazılımda, tıklayın Örnek Ekle'Normal Örnek Seç've sonra İleri'Bu, numune tutucuyu kaldırır ve VTI'ya giriş valflerini açarak numunenin yerleştirilmesine izin verir. İstendiğinde, s'yi itmek için yerleştirme çubuğunu kullanın.amp kap VTI'nin içine. Numune kabını çıkarın ve yerleştirme çubuğunu dikkatlice geri çekin.Numunenin çubuktan ayrıldığını ve kapatma prosedürü sırasında VTI'dan dışarı itilmediğini onaylayın. Valfleri kapatmak ve numune kabını sıvı helyumun içine indirmek için İleri'ye tıklayın ve ardından Bitiş'e tıklayınOptimum polarizasyon frekansını bulmak için önce RINMR yazılımını başlatın. Konfigürasyon ekranında, Örnek Seç'e tıklayın ve Mikro Tarama Yap'a tıklayın.Verilerin saklanacağı dosyayı oluşturun.DNP Polarizer yazılımına geri dönün. Kalibre Et sekmesini seçin, mikrodalga süpürme parametrelerini ayarlayın ve ardından mikrodalga süpürme işlemini başlatın. Mikrodalga taraması bittiğinde, maksimum ölçülen sinyal genliği ile frekansı not edin.RINMR yazılımına dönün ve Katı Yapı'Ardından, DNP Polarizer yazılımında Polarizasyon'a tıklayınOptimum mikrodalga frekansını ve gücü girin. İleri'ye tıklayın'Polarizasyon Birikimi İzlemeyi Etkinleştir've Bitir'e tıklayın,%95'in üzerinde bir polarizasyon elde etmek için numuneyi yeterli bir süre boyunca polarize edin. Polarizasyon sırasında, hiperpolarizör numune egzoz tüpüne bir toplama şişesi bağlayın ve spektrometrenin yanına yerleştirin.Üç saniyelik aralıklarla 110 derecelik RF darbelerinin 13 karbon tarama serisine sahip bir tesla NMR spektrometresi kurun. Piruvat polarizasyonu sırasında hücre kültürü hazırlığına başlayın. Hücre ortamını hücre kültürü şişelerinden çıkarın.Hücreleri yaklaşık 10 mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Kültür şişesine beş mililitre tripsin ekleyin. Kültürü 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin ve ardından tripsini hacimce% 10 fetal buzağı serumu içeren yaklaşık beş mililitre F12K ortamı ile devre dışı bırakın.Ardından, istenen sayıda hücre içeren hücre süspansiyon hacmini plastik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre örneğini 1200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 800 mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için paleti %10 FCS ile yeterli F12K ortamında yeniden askıya alın.Süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü ılık suyla dolu plastik bir kaba koyun. Karbon 13 manyetik rezonans spektroskopisi ile veri toplamaya başlamak için, hücre numunesi hazırlandıktan ve piruvat polarizasyonu yüzde 95'ten büyük olduğunda, DNP Polarizer yazılımında Çözünmeyi Çalıştır'a tıklayın. Çözünen çözünme maddesi hacmini, çözünme odasının üst valfi aracılığıyla yükleyin.Çözme çubuğunu aktif konuma getirin. İleri'ye tıklayarak onaylayınHücre örneği deney için hazır olduğunda, Bitiş'çözünme işlemini başlatmak için DNP Polarizer yazılımında. Çözünme işlemi bitene kadar bekleyin.800 mikrolitre hücre örneğine 200 mikrolitre hiperpolarize piruvat çözeltisi ekleyin. Bir pipetle iyice karıştırın ve ardından karışımın yaklaşık 600 mikrolitresini beş milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. NMR tüpünü spektrometreye yükleyin ve ölçümü başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.Ardından, ekli numune kabı ile çözünme çubuğunu temizleme konumuna getirin ve DNP Polarizer yazılımında Bitir'e tıklayın. Karbon 13 manyetik rezonans görüntülemeye başlamak için, hiperpolarizasyon sürecini başlattıktan sonra, hücre sayısı en az 10 ila sekizinci olan 800 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre örneğini üç mililitrelik bir şırıngaya aktarın. Şırıngayı uzun bir katetere bağlayın ve şırıngayı bir MRI tarama yatağına yerleştirin.Kateterin MRI tarayıcısının dışına ulaşacak kadar uzun olduğundan emin olun. Şırınganın yanına %10 gadoterat meglumin içeren on molar karbon 13 üre içeren bir kalibrasyon fantomu yerleştirin. Şırınganın üzerine karbon 13 ayarlı bir RF alıcı bobini yerleştirin.Tarama yatağını, ilgilenilen nesne MRI tarayıcısının izo merkezinde olacak şekilde tarayıcıya yerleştirin. Bağlantı şişesini hiperpolarizör numune egzoz tüpüne bağlayın ve kateterin ucuna yakın bir yere yerleştirin. Standart bir üç düzlem lokalizasyon dizisi çalıştırın ve gerekirse şırınga konumunu ayarlayın.Ardından, şırınga lokalizasyonunu kapsayan proton T2 ağırlıklı bir anatomik dizi oluşturun ve çalıştırın. Elde edilen anatomik görüntülerden, karbon 13 fantomu da dahil olmak üzere ilgilenilen bölgenin beş sürekli dilimini seçin. Bir karbon 13 spektroskopik kalibrasyon alımı ayarlayın ve darbe dizisi kitaplığından 2B blok siegert kalibrasyon dizisini seçin.Darbe dizisini tarayıcıya indirin ve spektroskopik bir ön tarama yapın. Spektrum büyüklüğü grafiğinde, karbon 13 kalibrasyon fantom tepe noktasını tarayıcı frekansının merkezine ayarlayın. Alıcı kazançlarını maksimuma ayarlayın ve tıklayın taramaKalibrasyon sırasını çalıştırmak için.Bildirilen iletim kazancını ve merkezi frekansı kaydedin. Ardından, seçilen anatomik dilimler için bir karbon 13 kimyasal kayma görüntüleme alımı ayarlayın. 2D eko-düzlemsel spektroskopik görüntüleme dizisini seçin ve darbe dizisini tarayıcıya indirin.Spektroskopik ön taramayı çalıştırın ve MRI spektrometresinin kurulumunu tamamlamak için kalibrasyon değerlerine göre merkezi frekansı ve iletim kazancını ayarlayın. Piruvat %95 polarizasyona ulaştığında, DNP Polarizer yazılımında Çözünmeyi Çalıştır'a tıklayın ve çözündürücü maddeyi yükleyin. Çözme çubuğunu aktif konuma getirin.İleri'ye tıklayın've sonra Bitiş'Çözünmüş hiperpolarize numune toplama şişesine ulaştığında, yaklaşık 1 mililitre hiperpolarize solüsyonu bir şırıngaya çekin ve 200 mikrolitre hücre örneğine ulaşacak şekilde katetere enjekte edin. Deneysel verilerin alımını başlatmak için Tara'yı tıklayın. Veri toplama bittiğinde, çözündürme çubuğunu ekli numune kabı ile temizleme konumuna getirin ve DNP NMR yazılımında Bitir'e tıklayın.Prostat karsinomu PC3 hücrelerinde piruvatın laktata metabolik değişim hızı, hiperpolarize laktat ve piruvatın karbon 13 NMR spektroskopisi sinyal yoğunluklarının frekans ve zamana göre izlenmesiyle incelenmiştir. Laktat kinetik değerleri, basit bir oran modeli ve iki bölgeli değişim diferansiyel modeli ile değerlendirildi ve hücre sayısına normalize edildi. Her iki modelde de, artan hücre sayısı ile laktat üretiminin azalma eğilimi gözlendi.Bu, daha yüksek hücre konsantrasyonlarına ve numunenin daha yüksek viskozitesine atfedilir. Hücre sayısı iki kere on ila yedi'nin altında olan numuneler, çok küçük bir laktat sinyali/gürültü oranı ve dolayısıyla büyük standart sapma değerleri gösterir, bu da numunelerin bilgilendirici veriler elde etmek için en az bu sayıda hücre içermesi gerektiğini gösterir. İyi bir spektral çözünürlüğe sahip MRG ile mekansal lokalizasyon, belirli frekans bölgeleri için karbon 13 görüntülerinin elde edilmesine izin verdi.Mekansal dağılım ham verilerden belirlendi. Karbon 13 görüntüsü, daha önce elde edilen proton görüntüsü ile birlikte kaydedilebilir. Bir kez ustalaştıktan ve uygun şekilde gerçekleştirildikten sonra, bu deney 60 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, dinamik nükleer polarizasyon tekniği kullanılarak istenen bir molekülün hiperpolarizasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini ve basit NMR spektroskopisi ve hücre görüntüleme deneylerinin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, çok hızlı olmak önemlidir. Hiperpolarize numune polarizörden ayrıldıktan sonra, kazandığınız tüm NMR sinyalini iki dakikadan daha kısa sürede kaybettiğinizi unutmayın.Sonuç olarak, çözünme DNP'si çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu, diyabet gibi hastalıkları incelemeyi veya çeşitli kanser türlerinin metabolik değişikliklerine bakmayı ve aynı zamanda doku pH'ını ölçmeyi içerir.

hyperpolarized-13c-metabolic-magnetic-resonance-spectroscopy

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Optik dönüş değişimi (Seop) pompa vasıtasıyla hyperpolarized ksenon üretimi tarif edilmiştir. Bu yöntem Xe-129 nükleer spin kutuplaşma ~ 10000 kat büyütme verir ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ve görüntüleme uygulamaları vardır. Gaz fazı ve çözelti durum deney örnekleri verilmiştir.

NMR ve MRG Uygulamaları için Hyperpolarized Xenon

Bu makale, bilateral stimülasyonun primer motor korteks metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için transkraniyal doğru akım stimülasyonunu (tDCS) proton manyetik rezonans spektroskopisi (1 H-MRS) ölçümleriyle birleştirmek için temel bir protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır.

Birincil Motor Cortex Metabolizması Üzerindeki Bi-hemisferik Transkraniyal Elektrik Stimülasyon Etkileri Ölçüm Aracı Olarak Manyetik Rezonans Spektroskopisi Kullanımı

Nöromüsküler hastalıklar genellikle zamansal olarak değişen, uzaysal olarak, heterojen ve çok yönlü patolojisinin sergiler. Bu protokolün amacı, non-invaziv manyetik rezonans görüntüleme yöntemleri kullanılarak bu patolojinin karakterize etmektir.

İskelet Kası Hastalığının kantitatif Manyetik Rezonans Görüntüleme

Çözünme dinamik nükleer polarizasyonu (DNP) tarafından sağlanan duyarlılık artışı, metabolik süreçlerin NMR ve MRI ile gerçek zamanlı olarak takip edilmesini sağlar. Enzimatik reaksiyonları incelemek için tasarlanmış özel bir çözünme DNP kurulumunun özellikleri ve performansları tartışılmaktadır.

NMR ile Gerçek zamanlı enzimatik Reaksiyon Hızı Ölçümleri için çözünme Dinamik Nükleer Polarizasyon Aletler

Çok bölmeli dinamik fantom, hiperpolarize mıknatıs rezonans ajanları kullanılarak metabolik çalışmalar için ilgilenilen bazı biyolojiyi simüle etmek için kullanılır.

Hiperpolarize Manyetik Rezonans Ajanlar Araştırmaları bir Multi-bölmesi Dinamik Tek Enzim Phantom Kullanımı

Yeni bir elektron para-manyetik rezonanstır (EPR) yöntemi, hızlı tarama EPR (RS-EPR), geleneksel bir sürekli dalga (CW) teknikten üstün ve in vivo görüntüleme için yeni alanları açar 2B spektral mekansal görüntüleme için gösterilmiştir. Sonuçlar 250 MHz'de gösterilmiş, ancak teknik herhangi bir frekansta uygulanabilir.

Hızlı Tarama Elektron Paramagnetik Rezonans Görüntüleme Fizyolojik Önemli Parametreler için Yeni bulvarlar açar<em&gt; İn Vivo</em

Hızlı alan döngüsü netometrisi kullanarak, dinamik nükleer polarizasyon yoluyla hiperpolarize edilmiş 13C'lik zenginleştirilmiş bileşiklerin spin-kafes gevşeme süresinin manyetik alan bağımlılığını ölçmek için bir protokol sayılmaktadır. Özellikle, bunu[1-13C] pirüuvat ile gösterdik, ancak protokol diğer hiperpolarize substratlara genişletilebilir.

Hiperpolarize Spin-Kafes Gevşeme manyetik alan bağımlılığının ölçülmesi [1-13C]pirüuvat

Sürekli perfüzyon modunda hiperpolarize 13C etiketli metabolitin izole perfüze edilmiş bir fare kalbine uygulanması için deneysel bir kurulum tanımladık. Özel bir 13C-NMR edinme yaklaşımı, metabolik enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak nicelleştirilmesini sağladı ve multiparametrik 31P-NMR analizi, doku ATP içeriğinin ve pH'ının belirlenmesini sağladı.

Hiperpolarize [1-13 C] Piruvat ve13 C/31P NMR Spektroskopisi ile İzole Perfüze Fare Kalbinde Kardiyak Metabolizmanın İncelenmesi

El yazması, pulmoner gaz değişimini izlemek, görünür alveolar septal duvar kalınlığını değerlendirmek ve yüzey-hacim oranını ölçmek için hiperpolarize Xenon-129 kimyasal kayma doygunluk geri kazanımı (CSSR) kullanmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Yöntem, akciğer hastalıklarını teşhis etme ve izleme potansiyeline sahiptir.

Hiperpolarize Ksenon Spektroskopisinden Elde Edilen Akciğer Yapısı ve Fonksiyonunun Kantitatif Ölçümü

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Öğrenin, dinamik nükleer polarizasyon ile hiperpolarize edilmiş karbon-13 moleküllerini kullanarak prostat karsinom hücrelerinde laktat dehidrojenaz aktivitesini gerçek zamanlı ölçme yöntemini. Bu teknik metabolik süreçleri canlı organizmalarda izlemeyi sağlar.

hyperpolarized¹³ C Metabolik Manyetik Rezonans Spektroskopisi ve Görüntüleme

Daha fazla video keşfet