hyperpolarized ¹³ C Metabolik Manyetik Rezonans Spektroskopisi ve Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, dinamik nükleer polarizasyon kullanarak karbon 13 etiketli molekülleri hiperpolarize etmek ve in vitro olarak karbon 13 manyetik rezonans, retroskopik görüntüleme kullanarak enizmatik dönüşümlerini ölçmektir. Bu yöntem, karbonun rezonans sinyalini 10.000 ila 100.000 kat arttırır ve katmanlı bileşiklerin metabolik ürünlerinden ayırt edilmesini ve görüntüleme ile vücutta lokalize olmasını sağlar. Bu yöntemin VR tekniklerine kıyasla en büyük avantajı, canlı organizmalarda doğal olarak oluşan maddelerin metabolizmasının gerçek zamanlı olarak bir görünümünü sağlamasıdır.

Ayrıca bu yöntem, kanserin metabolizması ve in vitro olduğu gibi içgörü sağlayabilir. Ayrıca hayvan modellerine ve insan hastalara da uygulanabilir. Bu tekniğin uygulanması tümör lokalizasyonunu aşmaktadır.

Metabolik tümör alt tiplerini bulmak ve ayırt etmek ve en son tekniklerle birlikte tedaviyi izlemek için kullanılabilir. Prosedüre başlamak için, önce bir milimolar gadoterat meglumin çözeltisi ve konsantre bir karbon 13 piruvat hazırlayın. 15 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için karışıma trityl radikali OX063 ekleyin ve tamamen çözün.

DNP Polarizer yazılımında, değişken sıcaklık ekinin veya VTI'nin sıcaklığını 1.4 kelvin'in altına düşürmek için Soğut'a tıklayın. VTI soğuduktan sonra, karbon 13 etiketli numune çözeltisinin yaklaşık sekiz mikrolitresini plastik bir numune kabına koyun. Kabı numune yerleştirme çubuğuna takın.

Yazılımda, tıklayın Örnek Ekle'Normal Örnek Seç've sonra İleri'Bu, numune tutucuyu kaldırır ve VTI'ya giriş valflerini açarak numunenin yerleştirilmesine izin verir. İstendiğinde, s'yi itmek için yerleştirme çubuğunu kullanın.amp kap VTI'nin içine. Numune kabını çıkarın ve yerleştirme çubuğunu dikkatlice geri çekin.

Numunenin çubuktan ayrıldığını ve kapatma prosedürü sırasında VTI'dan dışarı itilmediğini onaylayın. Valfleri kapatmak ve numune kabını sıvı helyumun içine indirmek için İleri'ye tıklayın ve ardından Bitiş'e tıklayınOptimum polarizasyon frekansını bulmak için önce RINMR yazılımını başlatın. Konfigürasyon ekranında, Örnek Seç'e tıklayın ve Mikro Tarama Yap'a tıklayın.Verilerin saklanacağı dosyayı oluşturun.

DNP Polarizer yazılımına geri dönün. Kalibre Et sekmesini seçin, mikrodalga süpürme parametrelerini ayarlayın ve ardından mikrodalga süpürme işlemini başlatın. Mikrodalga taraması bittiğinde, maksimum ölçülen sinyal genliği ile frekansı not edin.

RINMR yazılımına dönün ve Katı Yapı'Ardından, DNP Polarizer yazılımında Polarizasyon'a tıklayınOptimum mikrodalga frekansını ve gücü girin. İleri'ye tıklayın'Polarizasyon Birikimi İzlemeyi Etkinleştir've Bitir'e tıklayın,%95'in üzerinde bir polarizasyon elde etmek için numuneyi yeterli bir süre boyunca polarize edin. Polarizasyon sırasında, hiperpolarizör numune egzoz tüpüne bir toplama şişesi bağlayın ve spektrometrenin yanına yerleştirin.

Üç saniyelik aralıklarla 110 derecelik RF darbelerinin 13 karbon tarama serisine sahip bir tesla NMR spektrometresi kurun. Piruvat polarizasyonu sırasında hücre kültürü hazırlığına başlayın. Hücre ortamını hücre kültürü şişelerinden çıkarın.

Hücreleri yaklaşık 10 mililitre fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın. Kültür şişesine beş mililitre tripsin ekleyin. Kültürü 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin ve ardından tripsini hacimce% 10 fetal buzağı serumu içeren yaklaşık beş mililitre F12K ortamı ile devre dışı bırakın.

Ardından, istenen sayıda hücre içeren hücre süspansiyon hacmini plastik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre örneğini 1200 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 800 mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için paleti %10 FCS ile yeterli F12K ortamında yeniden askıya alın.

Süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü ılık suyla dolu plastik bir kaba koyun. Karbon 13 manyetik rezonans spektroskopisi ile veri toplamaya başlamak için, hücre numunesi hazırlandıktan ve piruvat polarizasyonu yüzde 95'ten büyük olduğunda, DNP Polarizer yazılımında Çözünmeyi Çalıştır'a tıklayın. Çözünen çözünme maddesi hacmini, çözünme odasının üst valfi aracılığıyla yükleyin.

Çözme çubuğunu aktif konuma getirin. İleri'ye tıklayarak onaylayınHücre örneği deney için hazır olduğunda, Bitiş'çözünme işlemini başlatmak için DNP Polarizer yazılımında. Çözünme işlemi bitene kadar bekleyin.

800 mikrolitre hücre örneğine 200 mikrolitre hiperpolarize piruvat çözeltisi ekleyin. Bir pipetle iyice karıştırın ve ardından karışımın yaklaşık 600 mikrolitresini beş milimetrelik bir NMR tüpüne yerleştirin. NMR tüpünü spektrometreye yükleyin ve ölçümü başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.

Ardından, ekli numune kabı ile çözünme çubuğunu temizleme konumuna getirin ve DNP Polarizer yazılımında Bitir'e tıklayın. Karbon 13 manyetik rezonans görüntülemeye başlamak için, hiperpolarizasyon sürecini başlattıktan sonra, hücre sayısı en az 10 ila sekizinci olan 800 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre örneğini üç mililitrelik bir şırıngaya aktarın. Şırıngayı uzun bir katetere bağlayın ve şırıngayı bir MRI tarama yatağına yerleştirin.

Kateterin MRI tarayıcısının dışına ulaşacak kadar uzun olduğundan emin olun. Şırınganın yanına %10 gadoterat meglumin içeren on molar karbon 13 üre içeren bir kalibrasyon fantomu yerleştirin. Şırınganın üzerine karbon 13 ayarlı bir RF alıcı bobini yerleştirin.

Tarama yatağını, ilgilenilen nesne MRI tarayıcısının izo merkezinde olacak şekilde tarayıcıya yerleştirin. Bağlantı şişesini hiperpolarizör numune egzoz tüpüne bağlayın ve kateterin ucuna yakın bir yere yerleştirin. Standart bir üç düzlem lokalizasyon dizisi çalıştırın ve gerekirse şırınga konumunu ayarlayın.

Ardından, şırınga lokalizasyonunu kapsayan proton T2 ağırlıklı bir anatomik dizi oluşturun ve çalıştırın. Elde edilen anatomik görüntülerden, karbon 13 fantomu da dahil olmak üzere ilgilenilen bölgenin beş sürekli dilimini seçin. Bir karbon 13 spektroskopik kalibrasyon alımı ayarlayın ve darbe dizisi kitaplığından 2B blok siegert kalibrasyon dizisini seçin.

Darbe dizisini tarayıcıya indirin ve spektroskopik bir ön tarama yapın. Spektrum büyüklüğü grafiğinde, karbon 13 kalibrasyon fantom tepe noktasını tarayıcı frekansının merkezine ayarlayın. Alıcı kazançlarını maksimuma ayarlayın ve tıklayın taramaKalibrasyon sırasını çalıştırmak için.

Bildirilen iletim kazancını ve merkezi frekansı kaydedin. Ardından, seçilen anatomik dilimler için bir karbon 13 kimyasal kayma görüntüleme alımı ayarlayın. 2D eko-düzlemsel spektroskopik görüntüleme dizisini seçin ve darbe dizisini tarayıcıya indirin.

Spektroskopik ön taramayı çalıştırın ve MRI spektrometresinin kurulumunu tamamlamak için kalibrasyon değerlerine göre merkezi frekansı ve iletim kazancını ayarlayın. Piruvat %95 polarizasyona ulaştığında, DNP Polarizer yazılımında Çözünmeyi Çalıştır'a tıklayın ve çözündürücü maddeyi yükleyin. Çözme çubuğunu aktif konuma getirin.

İleri'ye tıklayın've sonra Bitiş'Çözünmüş hiperpolarize numune toplama şişesine ulaştığında, yaklaşık 1 mililitre hiperpolarize solüsyonu bir şırıngaya çekin ve 200 mikrolitre hücre örneğine ulaşacak şekilde katetere enjekte edin. Deneysel verilerin alımını başlatmak için Tara'yı tıklayın. Veri toplama bittiğinde, çözündürme çubuğunu ekli numune kabı ile temizleme konumuna getirin ve DNP NMR yazılımında Bitir'e tıklayın.

Prostat karsinomu PC3 hücrelerinde piruvatın laktata metabolik değişim hızı, hiperpolarize laktat ve piruvatın karbon 13 NMR spektroskopisi sinyal yoğunluklarının frekans ve zamana göre izlenmesiyle incelenmiştir. Laktat kinetik değerleri, basit bir oran modeli ve iki bölgeli değişim diferansiyel modeli ile değerlendirildi ve hücre sayısına normalize edildi. Her iki modelde de, artan hücre sayısı ile laktat üretiminin azalma eğilimi gözlendi.

Bu, daha yüksek hücre konsantrasyonlarına ve numunenin daha yüksek viskozitesine atfedilir. Hücre sayısı iki kere on ila yedi'nin altında olan numuneler, çok küçük bir laktat sinyali/gürültü oranı ve dolayısıyla büyük standart sapma değerleri gösterir, bu da numunelerin bilgilendirici veriler elde etmek için en az bu sayıda hücre içermesi gerektiğini gösterir. İyi bir spektral çözünürlüğe sahip MRG ile mekansal lokalizasyon, belirli frekans bölgeleri için karbon 13 görüntülerinin elde edilmesine izin verdi.

Mekansal dağılım ham verilerden belirlendi. Karbon 13 görüntüsü, daha önce elde edilen proton görüntüsü ile birlikte kaydedilebilir. Bir kez ustalaştıktan ve uygun şekilde gerçekleştirildikten sonra, bu deney 60 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, dinamik nükleer polarizasyon tekniği kullanılarak istenen bir molekülün hiperpolarizasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini ve basit NMR spektroskopisi ve hücre görüntüleme deneylerinin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, çok hızlı olmak önemlidir. Hiperpolarize numune polarizörden ayrıldıktan sonra, kazandığınız tüm NMR sinyalini iki dakikadan daha kısa sürede kaybettiğinizi unutmayın.

Sonuç olarak, çözünme DNP'si çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu, diyabet gibi hastalıkları incelemeyi veya çeşitli kanser türlerinin metabolik değişikliklerine bakmayı ve aynı zamanda doku pH'ını ölçmeyi içerir.