Name: Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin köpek arter ve venlerinden primer endotel hücre izolasyonu ve kültürü. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalıklar ve anjiyogenez araştırmaları için saf hücre popülasyonu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Avrupa Komisyonu'nun kültürlenmesindeki teknik yardımları için Hans de Graaf ve Tomas Veenendaal'a teşekkür eder.

Etik bildirimi: Bu çalışmada kullanılan Kan damarları taze köpek kadavra elde edilen artı malzemesi olarak hasat edildi (n = 4), diğer ilişkisiz araştırma (Üniversite 3R politikası) için ötenazi sağlıklı köpeklerden. Anormal kan damarları (intra ve ekstrahepatik portosistemik şantlar, n = 1 adet) Utrecht Üniversitesi Companion Animals Üniversite Kliniği sunulan köpekler sahiplerinin bilgilendirilmiş onam sonra otopsi hasat edilmiştir. 1. İzolasyon ve Kültür İlköğretim Köpek Endotel Hücreleri <ol><li> 2 ml / göz% 0.5 ağırlık / hacim jelatin ile ön-kat 6 oyuklu plakalar, 37 ° C&#39;de% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde bir kuluçka makinesi içinde 2 saat süre ile bırakın. önce birincil hücrelerin ekim aşırı jelatin çözüm çıkarın. </li><li> Aseptik taze köpek kadavra (Şekil 1A) kan damarı (ler) ilgi (örneğin, aort, vena kava, vena porta) çıkarın. damar sisteminin anatomisini korumakÇevrede kabın her iki ucunda, düz forseps koyarak. endotel hücrelerine zarar görmesini önlemek için forseps ile doku gereksiz manipülasyon kaçının. <ol><li> cerrahi makas ile her iki ucunda kenetlenmiş gemi kesin ve kadavra kaldırmak. buz üzerinde Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) taşınması. Not: yaklaşık olarak 5 sm bir tekne uzunluğu, bu prosedür için tercih edilir, ancak 1 cm boyutlarında o da kültür için yeterli hücreleri sağlar. </li></ol></li><li> buz soğukluğunda HBSS ile dolu bir Petri kabı, kan damarı aktarın. Cerrahi makas kullanılarak, damar kendisi sağlam (Şekil 1B) tutmak kabın dışından yapışık doku ve yağ çıkarmak. Optimal görünüm için bir kelepçe veya forseps ile kenara çevredeki dokuyu çekin: keserken emin damar her zaman açıkça görünür olduğundan emin olun. <ol><li> Bitişik harfler ile her türlü tekne dalları kapatın (örneğin, 3-0 polyglactin) ve daha sonra bunları kaldırmakcerrahi makas veya neşter ile. </li></ol></li><li> Dikkatle, kavisli bir Halsted sivrisinek forseps ile bir gemi ucunu girmek geminin diğer ucundaki forseps ucu kelepçe ve dışarı (Şekil 1C-G) tamamen içine kadar sonra yavaş yavaş gemiyi tersini, geri çekin. dış artık endotel hücre tabakasını içermektedir. herhangi bir zorluk gemi tersini üzerine karşılaşılırsa, sürtünmeyi azaltmak için tekrar HBSS daldırın. </li><li> Tamamen kapatmak için ve sindirim prosedürü (Şekil 1H) herhangi olmayan endotelyal damar dokusu maruz kalmasını önlemek için geminin her iki ucunda purse-string sütür koyun. ters gemi işlemek için bağ uçlarını kullanın. </li><li> sindirim ve kültür daha sonra yapılırsa, sindirim protokolü (adım 1.7) öncesinde ters gemi cryopreserve. <ol><li> kriyotüpe içinde ters gemi yerleştirin ve hücre kültür ortamı dondurma ile doldurun. Bir dondurma co kullanarak aşağı -80 ° C&#39;ye kadar Freezentainer. -80 ° C&#39;de saklayın gemiler bir hafta içinde kullanılacak ise. Uzun süreli depolama, -180 ° C&#39;de yer cryovials için. AT izolasyon gerçekleştirirken, bir su banyosu (37 ° C) hızla cryovials çözülme hemen buz soğukluğunda HBSS yerleştirin. 1.7 belirtildiği gibi devam edin. Not: izolasyondan sonra EC toplam verimi sayesinde dondurma işlemi sırasında canlılığı kaybına daha düşük olacağı dikkate alacaktır. </li></ol></li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp gemi aktarın ve (Şekil 1I) (çözülme durumunda veya artık dondurma orta) eritrositler kaldırmak HBSS iki kez yıkayın. </li><li> Aralıklı yumuşak olan 37 ° C &#39;de 1 saat boyunca köpek Endotel Hücrelerinde 30 mi kolajenaz tip II (0.15 U / ml) ve dispase (0.15 U / ml) içeren bir çözeltiye Gelişim Ortamı (CECGM) olan bir 50 ml tüp içinde damar Digest çalkalama. </li><li> g tüpten gemi çıkarın ve x 250 5 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> CECGM a hücre pelletinind tohum 2 ml hücre süspansiyonu oyuk başına (1-3 kuyu damar boyutuna bağlı olarak). Kültür hava içinde% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C &#39;de hücreleri ve haftada iki kez kültür ortamı değiştirin. </li><li> % 80 ulaşıldığında - 70 bir confluency Passage hücreleri. <ol><li> Ölü ya da olmayan bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır önceden ısıtılmış HBSS hücreleri yıkayın. Her bir oyuğa 200 ul rekombinant hücre-ayrılma enzimi (1x) ilave edin ve 5 dakika boyunca ya da tüm hücrelerin müstakil kadar tekrar inkübatör yerleştirin. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer hücreleri ve% 10 cenin buzağı serumu (FCS) içeren kültür ortamı 10 ml (CEGM) eklenerek tripsinizasyon durdurun. 250 x g hızında 5 dakika süreyle santrifüj. Jelatin önceden kaplanmış plaka veya şişede kültür devam edin. </li></ol></li></ol> 2. Karakterizasyonu <ol><li> Kültür Köpek aort endotel hücreleri (CnAOECs) ve bir mikroskop ile haftada iki kez birincil ve ticari hücre hatlarının morfolojisi karşılaştırın. NOT: TO, tipik&gt;% 70 konfluansa ulaştığında iyi görülmektedir yamalar EC desen büyüyen. <ol><li> % 0.5 ağırlık / hacim jelatin önceden kaplanmış T75 şişesinin üzerine CECGM Kültür CnAOECs. haftada bir kez Passage hücreleri confluency 70 -% 80. <ol><li> geçirilmesi için önceden ısıtılmış bir kez HBSS ile yıkama hücreleri, 1 ml yeniden birleştirici hücre ayrışma enzimi (1x) ekleyin. 5 dakika boyunca veya tüm hücreler müstakil kadar inkübatör geri şişeyi yerleştirin. % 10 FCS içeren 10 ml kültür ortamı (CEGM) eklenerek tripsin inaktive. 250 x g&#39;de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj süpernatan atılır ve 1 ml kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Hücre süspansiyonu, 10 ul bir kısım almak ve 1 seyreltin:% 0.4 tripan mavisi ile 1. Otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı ve yeni T75 şişesi içinde 4.0 x 10 5 canlı hücreleri plaka. % 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C&#39;de bir şişeye ve kültür önceden ısıtılmış CECGM 10 ml ekleyin. </li></ol></li></ol></li><li> Kültür CaPECs ve CnAOECs geçişi 1 RNA izole edin. <ol><li> Bir pelet gibi en az 1 x 10 3 hücreleri toplamak örnek hazırlama reaktifi (SPR) 20 ul ekle ve hücreleri lize etmek için 1 dakika için inkübe edilir. İnkübasyondan sonra, dikkatli bir şekilde -70 ° C&#39;de, toplam RNA ve mağaza ihtiva eden hücre lizatı toplar. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatları izlenerek bir cDNA sentez kiti (örneğin, iScript) kullanılarak cDNA&#39;ya mRNA dönüştürün. qPCR gerçekleştirmek için hazır olana kadar uzun süre için 4 ° C&#39;de bir hafta kadar ya da -20 ° C&#39;de saklayın cDNA. </li><li> endotel hücre kaynağını teyit etmek için endotelyal işaretleyici CD31 gen ifadesini ölçün. MIQE Özetleyerek yönergeleri 10 kullanılarak deney düzeneği ve kantifikasyonunu gerçekleştirin. Normalleşmesi için, referans genler GAPDH, RPS19 ve B2MG 11 ifadesini ölçmek. <ol><li> nükleaz içermeyen su elde edilen cDNA bir 10-kat seyreltme hazırlayın. </li><li> hazırlamakStandart hattı için bir araya getirilmiş cDNA örnekleri bir 4-kat seyreltme ve şablon olmayan kontrol olarak nükleaz serbest su kullanın. qPCR reaksiyonları için 50 kat, toplam seyreltme ulaşmak için numune beş kez seyreltilir. 4 ul cDNA ve geri ve ileri doğru primer (Tablo 1) 20 pmol ile karıştırılmış fluorofor 6 ul kullanılarak 384 oyuklu bir formatta iki kez pipetle 10 ul reaksiyonları. </li><li> denatürasyon için 95 ° C de 10 saniye 39 döngü, ardından Taq polimeraz aktivasyonu için 5 dakika, tavlama ve uzama için Tm 30 saniye boyunca 95 ° C&#39;ye kadar bir program ayarlama. Her bir primer grubu için Tm Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> erime eğrisi gerçekleştirin yükseltilir tek bir ürün sağlamak için her çalıştırmak aşağıdaki analiz eder. Referans genlerin ortalama bağıl miktarda kullanarak numunelerin ifade düzeylerini normale ve reaksiyon verimi% 95 ile% 105 arasında ise ACt hesaplayın. </li></ol></li><li> Bir Angi EC işlevselliğini değerlendirmekogenesis deneyi. <ol><li> önceden soğutulmuş bir anjiyojenez sürgünün her çukuruna hücre dışı matrisin 10 ul ilave edilip iyice yüzeyini kaplayan bir pipet ucu ile yayılır. buz üzerinde hücre dışı matris tutmak ve jele hava kabarcıklarının giriş önlemek. 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de, bir kuluçka makinesi içinde suda ıslatılmış kağıt havlu ile bir Petri kabındaki slayt koyarak jel katılaşmaya. </li><li> 1.0 x 10 4 birincil ekle EC 50 ul Endotel Gelişim Ortamı ile sabitleştirilir. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 6 saat süre ile slayt inkübe edin. </li><li> 6 saat sonra görüntüdeki tüm kuyu içerdiğinden emin yapma, 20X büyütme ile fotoğraf çekmek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Failure+Models%3A+Traditional+and+Novel+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Vasc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy.</a> Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).</li>
<li>van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+liver+shunts+in+dogs+elucidate+pathways+regulating+embryonic+development+and+clinical+disorders+of+the+portal+vein%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein.</a> Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).</li>
<li>Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phosphorylation+of+the+mTORC2%2FAkt%2F4E-BP1+pathway+in+newly+derived+canine+hemangiosarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines.</a> BMC Vet. Res. 8 (1), 128(2012).</li>
<li>Boilson, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circulating+progenitor+cells+in+left+ventricular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction.</a> Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinolysis+and+proliferative+endarteritis%3A+two+related+processes+in+chronic+infections%3F+The+model+of+the+blood-borne+pathogen+Dirofilaria+immitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124445(2015).</li>
<li>Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+radicals+mediate+endothelial+cell+damage+by+complement-stimulated+granulocytes.+An+in+vitro+model+of+immune+vascular+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage.</a> J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).</li>
<li>Aranguren, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+a+novel+transcription+factor+code+determining+the+human+arterial-specific+endothelial+cell+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature.</a> Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).</li>
<li>van Balkom, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+require+miR-214+to+secrete+exosomes+that+suppress+senescence+and+induce+angiogenesis+in+human+and+mouse+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells.</a> Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).</li>
<li>Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+%28HUVEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).</a> J. Vis. Exp. (3), e183(2007).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIQE+precis%3A+Practical+implementation+of+minimum+standard+guidelines+for+fluorescence-based+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments.</a> BMC Mol. Biol. 11, 74(2010).</li>
<li>Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+canine+reference+genes+for+accurate+quantification+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression.</a> Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).</li>
<li>Heishima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-214+and+MicroRNA-126+Are+Potential+Biomarkers+for+Malignant+Endothelial+Proliferative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases.</a> Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).</li>
<li>Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterisation+of+canine+mitral+valve+interstitial+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells.</a> Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).</li>
<li>van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+congenital+portosystemic+shunts%3A+disconnections+dissected%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected.</a> The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).</li>
<li>Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+%28VEGF%29+levels+in+the+blood+serum+of+dogs+with+malignant+neoplasms+of+the+oral+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Vet.+Hung%22%5BJournal%5D)">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity.</a> Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+study+of+hydralazine%2C+a+potential+anti-angiogenic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent.</a> Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Köpek EC odaklanan çalışmalarda CnAOEC birincil hat köpek 3, 12, 13 endotel soy modellemek için kullanılır. İnsan çalışmalarında, HUVEC kültürü hala altın standart olarak kabul edilmektedir. Açıkçası, göbek kordonu elde edilen EC üzerinde sadece odaklanan Kardiyovasküler araştırmalarda bir firma kısıtlama olduğunu. Endotel hücreleri arteriovenöz özelliklerinin belirlenmesiyle belirli bir gen ifade desen var. Doğum sonrası damarlarda bu farklılıkların hesaba katmak için biz endotelyal hücrelerin spesifik anato...

Köpekler kardiyovasküler hastalık araştırmaları için büyük bir hayvan modeli olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda doğuştan (genetik) vasküler anormallikler 1, 2 muzdarip olabilir. Ticari endotel hücre hatları genellikle endotel hücre (EC) işlevselliğini değerlendirmek için kullanılan bu hastalıkların incelenmesi. köpekler için köpek aortundan alınan (CnAOEC) mevcuttur ticari bir endotelyal hücre hattı vardır. Bu hücre hattı çoğunlukla kontrol, normal EC 3-5 olarak çalışmalarda kullanılmaktadır. kan dolaşım araştırmada en yaygın olarak kullanılan endotel hücre çizgileri sırasıyla insan göbek kordonu damar ve arter türetilen insan Göbek Daman Endotel Hücreleri (HUVECs) ve İnsan Umbilikal Arter Endotel Hücreleri (HUAECs) vardır. HUVECler 1980&#39;lerden 6 yılından bu yana damar araştırmalarda altın standart olarak kullanılmıştır. Onlar endotel fonksiyonu ve hastalık adaptasyonunu incelemek için klasik model sistem olarak kabul edilmektedir. Farklı kan damarları izole endotel hücreleri appearanc değişirE ve mikroçevresinin 7 genetik arka plan ve maruz kalma nedeniyle işlevsellik. Buna ek olarak, HUVECler ve HUAECs, göbek kordonu şartlarına göre tamamen taklit yetişkin kan damarlarının onlar ve hastalığa yanıt maruz olmayabilir gelişimsel vasküler yapı elde edilir. Bu nedenle, genel olarak kardiyovasküler hastalık için HUVEC bulunan sonuçları ve HUAECs tercüme yetersizdir. adaptasyon ve yetişkin EC davranışını incelerken, ilgilenilen damarın birincil EC daha doğrudan bir yaklaşım olarak kullanılmalıdır. bu hücrelerin izole edilmesi için, çeşitli yöntemler bildirilmiştir. Ayrıca, HUVEC için kullanılan bir çok tarif edilen yöntem, enzimatik sindirim çözeltisi 8 kap yıkama edilir. Bu çoğu zaman, düz kas hücreleri, fibroblastlar ve 9 olmayan EC ile kontaminasyon sonuçlanır. izolasyon için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, Floresan-takiben kıyılmış damar doku enzimatik sindirimi olanFarklılaşma (CD) 31 7, 8. FACS ayıklama endotelyal hücre belirteci küme ve daha sonra, hücre kültürü göre (FACS) aktif hücre hücrelerin nispeten büyük miktarlarda gerektirir ve bu nedenle ince kan damarlarından endotelyumun izolasyon için uygun değildir. Bu nedenle yüksek saflıkta çeşitli köpek kan damarlarından saf endotel hücre popülasyonunu izole etmek için yeni bir sağlam bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. Yeni izolasyon yönteminin etkinliğini test etmek için, izole ve büyük ve küçük her ikisi de farklı köpek arterler ve venler, saf Canine Primer endotel hücre (CapeC) kültürleri elde etti. Bu yöntem aynı zamanda doğuştan içi veya dışı hepatik portosistemik şant, köpekler 2 ortak bir hastalık olarak hastalıklı ve / veya anormal damarlardan kaynaklanan endotel hücrelerinin kültürü sağlar. kabın en int olarak kalmaktadır, bu yöntem, vasküler düz kas hücreleri gibi aynı geminin alakalı ek hücre tiplerinin izolasyonu sağlarİşlem sırasında hareket ederler.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz tip II</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>Köpek Endotel Hücreleri Büyüme Ortamı&nbsp;</td><td>Hücre Uygulamaları</td><td>Cn211-500</td><td></td></tr><tr><td>CnAOECs</td><td>Hücre Uygulamaları</td><td>Cn304-05</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)&nbsp;</td><td>GE Sağlık</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>SPR</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8898</td><td></td></tr><tr><td>iScript sentez kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td></td></tr><tr><td>SYBR yeşil süper karışım</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>Geri Kazanım Hücresi Dondurma Ortamı</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12648-010</td><td>Kullanmadan önce buz üzerinde tutun</td></tr><tr><td>Dondurma kabı, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi makas (Mayo veya Metzenbaum)</td><td>B. Braun Medical</td><td>BC555R</td><td></td></tr><tr><td>Sivrisinek forseps&nbsp;</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB440R</td><td></td></tr><tr><td>Sivrisinek forseps kavisli</td><td>B. Braun Medical</td><td>FB441R</td><td></td></tr><tr><td>poliglaktin 3-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP311H</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik sayma haznesi</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Sayma Slaytları, Çift Odacıklı</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>BD356231</td><td>Buz üzerinde yavaşça çözülür</td></tr> <tr><td>ve mikro;-Slayt Anjiyogenez</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td></td></tr><tr><td>Endotelyal Büyüme Ortamı</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 SingleQuot Kit&nbsp;</td><td>İstanbul</td><td>CC-4176</td><td></td></tr></tbody></table>

köpek arter ve venlerin primer endotel hücreleri İzolasyon ve kültür

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Kardiyovasküler hastalık hem insan hem de veteriner hekimlikte incelenir. Endotel hücreleri, vaskülogenez, (tümör) anjiyogenez ve aterosklerozu incelemek için in vitro model olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır. İnsan endotel hücreleri (EC'ler) üzerinde in vitro araştırmalar için mevcut standart, İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerinin (HUVEC'ler) ve İnsan Umbilikal Arter Endotel Hücrelerinin (HUAEC'ler) kullanılmasıdır. Köpek endotel araştırmaları için, köpek aort endotelinden türetilen sadece bir hücre hattı (CnAOEC) mevcuttur. Şu anda tam olarak anlaşılamamış olsa da, arterlerden veya venlerden kaynaklanan EC'ler arasında bir fark vardır. EC'ler üzerinde in vitro işlevsellik çalışmalarına daha doğrudan bir yaklaşım için, Köpek Primer Endotel Hücrelerini (CaPEC'ler) çeşitli damarlardan izole etmek için yeni bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, fibroblastlar ve düz kas hücreleri gibi hızlı büyüyen hücrelerle kontaminasyon olasılığını azaltır, bu da damarın enzimatik solüsyonlarla yıkanması veya tüm hücreleri içeren dokunun sindirilmesinden önce damarın kıyılması gibi standart izolasyon yöntemlerinde yaygın olan bir sorundur. Tanımladığımız teknik, köpek modeli için optimize edilmiştir, ancak insan gibi diğer türlerde de kolayca kullanılabilir.

Farklı kan damarları başarıyla açıklanan izolasyon protokolü (Şekil 2) tabi tutuldu. Teşrih ve sağlıklı köpeklerden aort, vena kava, vena porta ve koroner arter ters mümkün olmuştur (her köpekten tüm damarları, n = 4). Aynı yaklaşım EC iki doğumsal portosistemik şant (ekstrahepatik ve intrahepatik, n = 1 adet) izole edilmiştir ile. Aort kolayca ters olmasına rağmen, aort segmentleri abdominal aorta daha zorlu idi. göğüs segmentlerde aort sindirim çözüm kesinlikle endotel...

Primer endotel hücrelerinin kan damarlarından yeni izolasyon yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bu protokol, ilgilenilen kan damarlarını tamamen tersine çeviren ve sadece endotel tarafını enzimatik sindirime maruz bırakan yeni bir tekniği tanımlar. Elde edilen saf endotel hücre kültürü, kardiyovasküler hastalıkları, hastalık modellemesini ve anjiyogenezi incelemek için kullanılabilir.

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Bu yöntemin genel amacı, kardiyovasküler hastalıkları in vitro ortamda incelemek amacıyla köpeklerden primer endotel hücrelerini izole etmek ve kültürlemektedir. Bu yöntem; anjiyogenez, tümör anjiyogenezi ve ateroskleroz sırasında endotel hücrelerinin davranışları gibi kardiyovasküler araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok küçük kan damarlarından bile saf bir primer endotel hücresi popülasyonunun elde edilebilmesi ve kültüre edilebilmesidir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, damarın ters çevrilmesi ve dikilmesi işlemleri zor görünebileceği için zorluk yaşayabilirler, ancak bu işlemler aslında pratikte kolayca öğrenilir. Primer kanin endotelyal hücreleri veya CAPEC'leri izole etmek ve kültüre etmek için altı kuyucuklu plakaları önceden %0,5 jelatin ile kaplayın ve 37 °C'de ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde iki saat boyunca inkübe edin. Yazılı protokole uygun olarak, kanin kadavrasından ilgili kan damarlarını aseptik olarak çıkardıktan sonra, damarları buz soğukluğundaki HBSS ile doldurulmuş Petri kaplarına aktarın.Ardından, cerrahi makas kullanarak, kesme işlemi sırasında damarın her zaman görünür

isolation-culture-primary-endothelial-cells-from-canine-arteries

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Yalıtma ve kalp kapakçığı endotel hücreleri (VEC) saf kültür popülasyonları için bir yöntem sağlar. VEC tüberkülü veya broşürün her iki taraftan da izole edilmiş ve hemen şu olabilir, altta yatan interstisyel hücre (VIC) izolasyonu basittir.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Bu videoda, tek adımlı kollajenaz sindirimi kullanılarak bir domuz modelinin abdominal aortundan endotel hücrelerinin izolasyonunu gösteriyoruz. Endotel hücreleri, daha sonraki aşağı akış uygulamaları için kültürlenebilir.

Domuz Aort Endotel Hücresi (pAEC) İzolasyonu: Hasat Edilen Domuz Abdominal Aortundan Endotel Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzim Tabanlı Bir Yöntem

Biz yerli, sağlam mikrovasküler endotel kalsiyum sinyalizasyon görselleştirme ve işlemek için bir hazırlık mevcut. Endotel tüpler taze iskelet kası komşu hücreleri içinde ve arasında vivo morfolojisi ve dinamik sinyalizasyon korumak besleyen fare direnç arterlerinin izole. Endotelyal tüp, diğer doku ve organların kılcal hazırlanabilir.

Fare Direnç arterlerden mikrovasküler endotel Tüpler İzolasyonu

Vasküler endotel hücreleri birçok önemli kardiyovasküler hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Bu makale, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve genişletmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Protokolümüz, endotel hücre fizyopatolojisindeki mekanizmaları tanımlamak için etkili bir yol sağlar.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

Bu protokol, fare koroner endotel hücrelerini görüntüleme veya moleküler biyolojik deneyler yapmak amacıyla izole etme yöntemimizi paylaşmak için hazırlanmıştır.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Primer domuz aort endotel hücrelerinin (pAECs) minyatür domuzlardan izolasyonu için etkili bir enzimatik yöntem tanımlanmıştır. İzole primer pAEC'ler ksenotransplantasyonda immün ve koagülasyon yanıtını araştırmak için kullanılabilir.

Minyatür Domuzlardan Birincil Aort Endotel Hücrelerinin İzolasyon ve Kültürü

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, fare yağ depolarının diseksiyonu ve endotel hücre popülasyonunu serbest bırakmak ve daha sonra tanımlamak için ilgili arterlerin izolasyonu ve sindirimi için bir yöntemi detaylandırır. Aşağı akış uygulamalarında kullanılan taze izole edilmiş hücreler, vasküler hücre biyolojisinin ve vasküler disfonksiyon mekanizmalarının anlaşılmasını ilerletecektir.

Vasküler Endotel Hücrelerinin Aşağı Akış Uygulamaları için Farklı Yağ Depolarından İzolasyonu ve Tanımlanması

Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.

Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Öğrenin köpek arter ve venlerinden primer endotel hücre izolasyonu ve kültürü. Bu yöntem, kardiyovasküler hastalıklar ve anjiyogenez araştırmaları için saf hücre popülasyonu sağlar.

Köpek arter ve venlerin Primer Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Daha fazla video keşfet