CNS içine Hedeflenen Madde Teslimat için Fare Mikrocerrahi İnfüzyon Tekniği yoluyla İç Karotis Arter

Bu cerrahi tekniğin genel amacı, kafatasına nüfuz etmeden fare beynine eksojen maddeler vermektir. Bu yöntem, beyindeki ilaçların, patojenlerin ve eksozomların etkisiyle ilgili sinirbilimdeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hayvanda minimal travmaya neden olması, nöronal ağın bütünlüğünü koruması ve beyindeki maddenin yüksek konsantrasyonlarına ulaşmasıdır.

Fareyi bir indüksiyon odasında uyuşturmak için oksijenle karıştırılmış izofluran uygulayarak başlayın. Anestezi indüksiyonundan sonra, hayvanı stereo mikroskop altında cerrahi yüzeye aktarın ve cerrahi bir anestezi düzlemini korumak için burun konisini yerleştirin. Solunum hızının nefes nefese kalmadan saniyede bir ila iki solunum mesafesinde olduğundan emin olun.

Ek olarak, hayvanın bıyık stimülasyonuna veya ayak parmağı tutamına tepki vermediğinden emin olun. Kuruluğu önlemek için her göze bir damla oftalmik kayganlaştırıcı uygulamak için steril bir çubuk kullanın. Ameliyat bölgesini jiletle tıraş ettikten sonra, alanı %70 etanol ve klorheksidin ile hazırlayın.

Stereo mikroskoptan bakarken, boyunda göğüs kemiğinin üstünden çenenin altına kadar orta hat kesisi oluşturmak için cerrahi makas ve forseps kullanın. Trakeayı ortaya çıkarmak için yağ ve bağ dokusunu dikkatlice ayırmak için forseps kullanın. Ardından, boynu uzatmak ve alanı daha fazla ortaya çıkarmak için boynun arkasına yaklaşık sıfır nokta beş santimetre çapında yumuşak, yuvarlak bir nesne yerleştirin.

Daha sonra, kancalar veya bir doku ekartörü kullanarak trakea etrafındaki dokuyu ayırın. Trakeanın sol tarafında, sol ortak karotis arteri veya CCA'yı ortaya çıkarmak için bağ dokusunu dikkatlice cımbızlayın. Forseps kullanarak, hem dış hem de iç karotis arterlerin başlangıcında CCA çatallanmasını ortaya çıkarmak için tüm bağ dokusunu dikkatlice çıkarın.

ECA ve ICA açığa çıktıktan sonra, dış karotis arterin altına bir santimetrelik naylon sütür segmenti yerleştirmek için forseps kullanın. Ardından bir santimetrelik ikinci bir segment yerleştirin. Ardından ECA'nın mümkün olan en yüksek noktasına kalıcı bir düğüm atın.

ECA'nın mümkün olan en alçak noktasında, CCA çatallanmasının hemen üzerinde, daha gevşek, çıkarılabilir bir düğüm atın. Ardından, CCA'yı mümkün olan en düşük noktada kapatmak ve ICA'yı kapatmak için damar klipslerini kullanın. Dış karotis arterde küçük bir kesi yapmadan önce iç karotis arterin düzgün bir şekilde kapatılması kanamayı önleyecektir.

Şimdi, mikrodiseksiyon yayı makası kullanarak, ECA'da iki düğüm arasında iki milimetrelik bir kesim yapın. Kesikleri küçük tutmak önemlidir, çünkü büyük bir kesik demlenecek maddenin sızmasına neden olacaktır. İnfüzyon sistemini, infüze edilecek maddenin 250 mikrolitresini içeren bir tüberkülin şırıngasına altı inçlik kılcal boru takarak monte edin.

Ardından, kılcal borunun ucunu ECA'daki kesiğe yavaşça sokun. Ucu, çatallanma ile CCA üzerindeki klips arasındaki yarıya ulaşana kadar ilerletmeye devam edin. Alt ECA düğümünü bağlayın.

Düğümün kılcal akışkanlığa izin verecek kadar gevşek ve sızıntıyı önleyecek kadar sıkı olduğunu doğrulayın. Ardından, klibi ICA'dan çıkarın. Şırınga pistonuna hafifçe basınç uygulayın ve saniyede yaklaşık 10 mikrolitre madde infüzyonuna izin verin.

Test maddesinin infüzyonunu takiben, klipsi tekrar ICA'ya yerleştirin. Kılcal boruyu yavaşça çıkarın. Ardından, alt ECA düğümünü tamamen bağlayın.

Klipsi ICA ve CCA'dan çıkarın. Ardından ekartörü veya doku kancalarını ve yastığı çıkarın. Dikilecek bölgeyi steril tuzlu su ile temizleyin ve ardından naylon dikişler kullanarak kesiyi kapatın.

Ameliyat sonrası rahatsızlığı hafifletmek için onaylanmış bir anti-enflamatuar ajan ve analjezik uyguladıktan sonra, hayvanı en az bir saat boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde bir kafese koyun ve iyileşmeyi izleyin. Bu histogram, sol internal karotis arter yoluyla viral infüzyondan yedi gün sonra gerçek zamanlı PCR'lerle HIV tespitini göstermektedir. Beklendiği gibi, virüsün seviyeleri sol yarımkürede daha yüksektir.

Bu immünofloresan görüntü, iç karotis arter yoluyla hücre dışı vezikül infüzyonundan sonra bir eksozom belirteci olan GFP etiketi CD63'ü gösteren bir fare beyin bölümünü göstermektedir. Yeşil renkle gösterilen hücre dışı vezikülleri ifade eden CD63, fare beyni mikro damarı ile ilişkilidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 20 dakika içinde yapılabilir.

Geliştirilmesinden sonra bu teknik, nörodejeneratif hastalıklar alanındaki araştırmacıların farelerde ilaç, patojenler ve eksozom etkileşimlerini keşfetmelerinin yolunu açtı.