Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize Drosophila

Bu prosedürün genel amacı, belirli bir boyamaya gerek kalmadan yaş, genetik modifikasyonlar veya çevresel etkiler dahil olmak üzere çeşitli faktörlerin neden olduğu Drosophila Beynindeki Nörodejenerasyonu ölçmektir. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklar alanındaki temel soruları analiz etmede çok yararlıdır. Mesela hangi genler veya çevresel faktörler bu hastalıklara neden olur veya katkıda bulunur?

Bu yöntemin temel avantajı, kontrol sinekleri ve deney sinekleri tek bir numune olarak ele alındığı için sistematik hataları önlemesi veya en aza indirmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler zorlanabilir, çünkü beynin doğru bölgesinin kaydırak üzerinde olduğundan emin olmak ve kesme sırasında oluşabilecek hasarı önlemek pratik gerektirir. Başlamak için, önce deneğin boynundan yakalarına sinekleri geçirmek için forseps kullanın.

Tüm başlıkları aynı yönde hizalayın ve kafada veya gözlerde herhangi bir hasar olmadığından emin olun. Gözsüz Senoculus Sineklerini rastgele, bilinen konumlara dahil edin, böylece sineklerin sırası bölümlerde kolayca tanımlanabilir. Ek olarak, ilgilenilen sinek türünün açık veya beyaz gözleri varsa, slaytı lekelemek için yeterli pigmentin mevcut olduğundan emin olmak için şerit boyunca aralıklarla kırmızı gözlü sinekler geçirin.

Sineklerin sırasını, birden fazla kullanılıyorsa yaka numarasıyla birlikte kaydedin. Bir yaka bittiğinde, üç nokta beş ila dört saat boyunca Carnoy'un solüsyonuna yerleştirin. Sinek dokusunu gömmeye hazırlamak için bir dizi Etanol, Metil Benzoat ve Parafin yıkaması gerçekleştirin.

Ardından, bilezikleri her bölüm için kauçuk bir buz küpü tepsisine yerleştirin. Erimiş parafini yakaların üzerine nazikçe dökün, hava kabarcıklarından kaçının ve gece boyunca sertleşmesine izin verin. Bilezikleri içeren parafin bloklarını tepsiden çıkarın.

Bir tıraş bıçağı kullanarak parafin bloğunu yakadan ayırın. Yakayı nazikçe kırmak. Kafalar parafin bloğunda kalırken, gövdeler yakada kalacaktır.

Dokuyu bölmek için önce bir ısıtma plakasını 50 santigrat dereceye ısıtın. Isınması için tıraş bıçağı veya metal montaj blokları gibi balmumu ile temas edecek herhangi bir aleti plakanın üzerine yerleştirin. Kesit için istenen yönü belirleyin ve ardından parafin segmentini temas tarafında kısa bir süre eriterek montaj bloğuna takın.

Bir tıraş bıçağıyla, fazla parafini sinek kafalarından uzaklaştırın, böylece gömülü kafaları içeren küçük bir sıra kalır. Montaj bloğunu, kafaları bıçağın kenarına paralel olarak hizalayarak Mikrotom'un nesne tutucusuna yerleştirin. Yedi mikrometre kesitini kesin ve kesit şeridini mikroskop slaytlarına aktarın.

Şeridin genişlemesini sağlamak için slaytları yaklaşık bir dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtılmış bir plakaya yerleştirin. Fazla suyu alın ve ardından slaytları gece boyunca daha fazla kurumaya ayarlayın. Kuruduktan sonra, slaytları 30 dakika ila bir saat boyunca Deparafinizasyon ajanı ile doldurulmuş uzun bir slayt boyama kavanozuna dikey olarak yerleştirerek parafin mumunu çıkarın.

Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. Son olarak, slaytları kavanozdan çıkarın ve her birinin üzerine iki damla gömme ortamı yerleştirin. Bölümleri büyük bir örtü ile örtün ve slaytların bir ila iki gün kurumasını bekleyin.

Floresan mikroskobunda düşük büyütme altında, beynin yönünü belirleyin ve ilgilenilen bölgeye odaklanın. Bu bölge belirlendikten sonra gerekli görüntüleri çekin. Görüntüleme yazılımını kullanarak, kafa başına düşen vakuol sayısını sayın.

İlgilenilen vakuolü seçerek ve kapsanan piksel sayısını belirleyerek vakuol boyutunu ölçün. Bu görüntü, soldan sağa yönlendirilmiş farklı sinek kafalarından bölümleri göstermektedir. Yukarıdan aşağıya, aynı sinek kafasından seri kesitler görselleştirilir.

Gözsüz Senoculus kontrol sineği okla gösterilir. Kesitler, kesme sırasında bölümleri yıkayan doğal olarak bulunan floresan göz pigmenti ile lekelenir. Yedi, 14 ve 21 günlük İsviçre Peyniri Tek sineklerinden parafin baş bölümleri, vakuol sayısı ve alanında yaşa bağlı ilerleyici bir artış göstermektedir.

Bu dejenerasyon, vakuollerin sayılması ve birleşik alanın hesaplanmasıyla ölçülebilir ve anlamlı bulunmuştur. Benzer şekilde, Yabani Tip sineklerde nörodejenerasyonun yaşla birlikte meydana geldiği gösterilmiştir. 10, 30 ve 60 günlük Yabani Tip sineklerin baş bölümlerinin muayenesinde, 10 günlük durumda çok az vakuol oluştuğu veya hiç vakuol oluşmadığı görülmüştür.

30 günlük bireylerin beyinlerinde vakuoller oluşmaya başlamıştı. 60 günlük bireylerde, anlamlı olarak daha fazla ve daha geniş alan vakuolleri mevcuttu. Mastering yapıldıktan sonra, bölümler bir hafta içinde analiz için hazır olabilir.

Bu prosedürü kullanırken, yakadaki sineklerin sırasını dikkatlice kaydetmek önemlidir. Analizden sonra bunları daha sonra tanımlayabileceğinizden emin olmak için. Bu videoyu izledikten sonra, bölümlerin nasıl hazırlanacağını ve Drosophila beyninde bulunan Nörodejenerasyonun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.