Name: Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Öğrenin, KSHV ile enfekte endotel hücrelerinde malign dönüşüm mekanizmalarını in vitro model kullanarak nasıl çalışılacağını. Bu yöntem, Kaposi sarkomu ve anjiyogenezle ilişkili kanserler için yeni tedavi hedefleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser K12 HD068322 (SCM) tarafından desteklenen; R01 CA179921 ve P51 OD011092 (AVM); ve 14PRE20320014 Amerika Kalp Derneği (SB) Ödülü.

Not: Bu protokol için açıklanan tüm yordamları BSL-2 koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
 1. KSHV hisse senedi hazırlık <ol><li>hazırlamak TNE arabellek: 292.24 mg EDTA GKD 2 O dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. GKD 2 O 605.7 mg Tris dağıtılması, 225 mL getirmek ve pH 8 ayarlayın. EDTA ve Tris çözümleri birleştirmek, 4,38 g NaCl ekleyin, 500 ml nihai ses düzeyini ayarlama, filtre sterilize ve mağaza 4 ° C'de .</li>
	<li>Kültür KSHV pozitif, 37 ° C artı % 5 CO %2 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS) ve yaklaşık 1 antimicrobials ile takıma RPMI oksijen bir kuluçka EBV negatif birincil efüzyon Lenfoma hücre kültürünü BCBL-1 1.2 mL başına 10 6 hücre x için.</li>
	KSHV üretim, ikna etmek için <li>kültürler 1:2 taze orta ile bölünmüş ve 20 ng/mL nihai bir konsantrasyon Phorbol 12-Myristate 13-asetat (PMA) ekleyin ve kültürler için 5 gün kuluçkaya. Alternatif olarak, sodyum bütrat (NaB; 0,1 mM) litik viral çoğaltma ikna etmek 3 gündür hücrelerle tedavi.</li>
	<li>İlk viral parçacıkların hasat için 300 x g hücreleri cips ve supernatants taze tüpler aktarmak için oda sıcaklığında 5 min için de süpernatant kültür santrifüj kapasitesi..</li>
	<li>Daha da böylece hücresel enkaz, transferini önlemek için süpernatant netleştirmek için santrifüj kapasitesi 2500 x g 10 min için de 4'te ° C. 
	Not: Alternatif olarak yüksek hızlı Santrifüjü için açıklama kültür supernatants, filtrasyon yoluyla bir steril 0.45 µm filtre gerçekleştirilebilir. Filtrasyon kullanarak titresi önemli bir düşüş gözlemledik; Bu nedenle, biz düzenli olarak ikinci Santrifüjü yerine adımıysa.</li>
	<li>Sonra 5 mL % 25 Sükroz çözeltisi TNE arabelleği ile yaklaşık 30 mL 6 ultracentrifuge tüplerde süpernatant açıklık kültürünün yerleşimi.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri 75.000 x g vakum altında 4 ° C'de 2 h için de dengeli.</li>
	<li>Kültür süpernatant dikkatle boşaltmak ve mümkün olduğu kadar süpernatant ve sukroz çözümü kaldırmak için her tüpün kenarında leke, sonra TNE arabellek 150 µL içinde görünür olmayabilir virüs Pelet resuspend.</li>
	<li>Resuspended havuzu tüm virüs, karıştırın ve 25 µL aliquots .-80 ° C'de dondurmak</li>
</ol> 2. EC E6 ve E7 Papilloma virüsü genler ile iletim Not: Biz düzenli olarak birincil EC büyüyen için standart doku kültürü şişeler kullanın Ancak, EC yetersiz büyüme aldıysanız o zaman ticari kültür şişeler kullanımı düşünülmelidir.
<ol><li>Kültür birincil insan dermal mikrovasküler veya lenfatik EC 37 ° C artı %5 oksijen bir kuluçka CO 2 EC büyüme orta (EGM; EC Bazal orta EGM-2 [içeren FBS, BulletKit ile birlikte [EBM] içerir hidrokortizon, insan fibroblast büyüme faktörü-B, vasküler EC büyüme faktörü, insülin benzeri büyüme faktörü-1, askorbik asit, insan epitelyal büyüme faktörü, antibiyotik ve heparin]) içinde bir T75 hücre kültür şişesi için yaklaşık % 50 izdiham.</li>
	<li>İletim için kültür PA317 LXSN 16E6E7 24 , 35 37 ° C de oksijen bir kuluçka artı % 5 CO 2 ile %10 FBS ve içinde antimicrobials takıma DMEM hücreleri bir Yaklaşık % 90 birleşmesi onlar kadar T150 hücre kültür cep şişesi. Sonra bir gecede kuluçkaya orta 16 mL.</li>
	<li>300 x g oda sıcaklığında 5 min için de centrifuging tarafından PA317 orta netleştirmek.</li>
	<li>Açıklık PA317 Orta 12 mL EC kültür ve yerleşimi hücrelerle EGM kaldırmak ve 4 h için kuluçkaya 
	Not: 300 x g eritilmiş süpernatant 12 mL dikkatli sonraki kaldırma tarafından rahatsız değil kompakt bir Pelet sonuçlarında 5 min için de şartına orta 16 mL Centrifuging. Ancak, birincil EC kültür PA317 LXSN 16E6E7 hücrelerinin transferi (ambalaj hücre kültürünü EC hızla büyümek) bir endişe ise, o zaman filtrasyon şartına süpernatant transferi önce 0,45 µm filtre aracılığıyla gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>PA317 orta 6 mL taze EGM ile değiştirip gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Refeed EC ile 12 mL taze EGM ve bir daha da 48 h. kuluçkaya</li>
	<li>EC alt kültür için orta kaldırın ve PBS katyonlar, olmadan 12 mL yıkayın ve ticari enzimatik ayrılma çözüm (örneğin, TrypLE) tarafından 3 mL ekleyin ve 3 dk. 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak ve 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi. Elde edilen hücre Pelet taze EGM resuspend ve 3 x T75 şişe şişe başına 12 mL EGM son hacmi ile eşit bölün.</li>
	<li>E6 ve E7 ile transduced EC için seçmek için G418 200 µg/mL sonra transduced EC olması enfeksiyon için kaplama veya sıvı azot içinde donmuş iki pasajlar için son bir konsantrasyon ekleyin.</li>
</ol> 3. Enfeksiyon Transduced EC KSHV ile <ol><li>gün önce enfeksiyon EC yukarıda açıklandığı gibi ticari enzimatik ayrılma çözüm kullanarak tekrar tekrar Enzimatik sindirim tarafından hasat. Hücre Pelet EGM 1 mL resuspend. Trypan mavi bir 1/10 seyreltme hazırlamak için 5 µL hücre kullanın. Saymak bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri ve 2. 5 x 10 5 canlı hücrelerde EGM 2 mL 6 iyi plakaları bir kuyu başına tohum.</li>
	<li>Enfeksiyon gününde, EGM kaldırmak ve iyi yıkama PBS 3 mL kalsiyum ve magnezyum içeren hücreleri ve 2 mL EBM ekleyin. 
	Not: EGM heparin bağlama için viral parçacıkların ve hedef EC sonraki enfeksiyon yapılmasını engeller EGM yerine EBM enfeksiyon sırasında kullanmak için gerekli gibi</li>
	<li>KSHV, hücrelerle bulaştırmak için her şey için 5 ila 20 µL virüs stok ekleyin ve karıştırmak için plaka girdap. Sahte enfekte hücreleri TNE arabelleği eşit bir birim için her şey eklemek için.</li>
	<li>Plakalar, 400 x g için oda sıcaklığında 30 dk santrifüj kapasitesi ve sonra 90 dk. 37 ° C'de plakaları kuluçkaya</li>
	Çalışmanın amacı bir zaman uyumlu viral enfeksiyon, örneğin, erken de novo enfeksiyon, olaylarda gerektiren erken olayları araştırmak için ise <li>Bu noktada viral inoculum kaldırın. Durulama ve 2 mL hücrelerle refeed taze EGM. Aksi takdirde, 2 mL EGM ekleyin ve kültürler gecede kuluçkaya.</li>
	<li>2 mL EGM hücrelerle gün enfeksiyon ve sonra her gün sonra refeed.</li>
	Hücreleri yaklaşık % 90 birleşmesi, ne zaman <li>yukarıda açıklandığı gibi ticari enzimatik ayrılma çözüm kullanarak tekrar tekrar Enzimatik sindirim tarafından hasat, daha sonra toplam geçiş sayısı ve geçit belirterek hücreleri bir T75 içine üç kuyulardan havuz sonrası enfeksiyon.</li>
	<li>Genişletmek sahte ve KSHV-enfekte EC 1:3 bölmeleri için hangi zamanda hücreleri olabilir deneylerde kullanılan veya sıvı azot içinde donmuş en az iki daha fazla geçişleri ile. 
	Not: EC E6 ve E7 ile transduced gibi bölme ile sahte ve KSHV enfekte hücreleri kültürleri bakım izdiham (~ 85-%90) ulaşmadan önce bölünmesi.</li></ol>
 4. teyit enfeksiyon KSHV ayirt tarafından ile Not: KSHV gecikme süresi ilişkili nükleer antijen (LANA-1/ORF73) olarak algılanmasını sağlar enfeksiyonu güvenilir niceliksel ölçüsüdür. Anti-LANA antikorlar piyasada.
<ol><li>Boyama, önceki gün her ile sahte veya KSHV-enfekte EC 1 x 10 5 24-şey tabakta hücreleri başı plaka iki kuyu iyi 1 mL EGM ve gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama hücreleri iki kez 500 µL PBS artı kalsiyum ve magniseum. Yıkama 30 s sallanan bir platformda.</li>
	<li>Bir harici ventillated duman başlık, 500 µL % 4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 15 dakika ile hücreleri saptamak.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği (%0.1 Triton X-100 artı %0.02 keçi serum PBS artı Özellikler) 500 µL.</li>
	<li>Blok 500 µL % 2 keçi serum, oda sıcaklığında 30 dakika yıkama arabellekte hücrelerle.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.</li>
	<li>Bir şey, sahte veya KSHV-1:10 EC 200 µL birincil antikor ile seyreltilmiş enfekte etiketbir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dk için yıkama arabellek 0. Yıkama arabellek yalnızca 200 µL içinde kalan iki wells kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.</li>
	<li>Tüm dört wells 200 µL ikincil antikor seyreltilmiş 1: 100 yıkama arabellekte bir rocker üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika ile etiketleyin.</li>
	<li>Yıkama hücreleri üç kez yıkama arabelleği 500 µL.</li>
	<li>Her şey için orta içeren DAPI ve bir coverslip montaj 20 µL uygulamak ve ters bir floresan mikroskop kullanarak boyama değerlendirmek.</li>
	<li>KSHV enfekte hücreleri yüzde enfeksiyon LANA-pozitif çekirdek en az 200 hücrelerdeki sayısını sayarak belirler. Rekombinant KSHV-Bac16 da izlenen GFP ifade kültürlerin gözlem yoluyla ile enfeksiyon.</li>
</ol>

Oncogenesis bir organizma36içinde önemli güvenlik önlemlerinin circumvents multistep bir süreçtir. KS lezyonlar kronik inflamasyon gerçek eklem dokusu Uru için bir spektrum boyunca var gibi aydınlatma KSHV tarafından aracılı belirli patofizyolojik süreçlerin bazı çalışmalar dönüşümü9çekmek için hücre kültür modellerinde yürütülmelidir gerektirir. Bu kaybı temas inhibisyonu ve anchorage bağlı büyüme, fenotipleri hücresel dönüşümü, gösterge kolayca geliştirmek mi unutulmamalı...

Kaposi sarkomu (KS) en çok geliştiren gelişmiş bağışıklık suppression1ayarı dermal, Mukozal ve visseral sitelerini etkileyen bir multifokal angioproliferative tümördür. Dört epidemiyolojik formu tarif edilmiştir: Klasik, genellikle Akdeniz ve Orta Doğu mirası; büyük insanı etkileyen bir tembel formu iyatrojenik, organ nakli takip immünsupresif ilaçlar ile tedavi sonucunda; salgın, bir AIDS tanımlama kanser; ve endemik, Afrika endemik bölgelerde çocuklarda yaygın bir HIV bağımsız formu. HIV tedavisinde etkili kombinasyonu anti-retroviral uyuşturucu rejimleri gelişiyle, salgın KS gelişmekte olan ülkelerde daha az yaygın olarak teşhis edilir. Ancak, klinik olarak agresif endemik ve salgın formları arasında en sık tanı kanser birçok Afrika ülkeleri2,3,4kalır. Bu nedenle, kimlik KS tedavisi için Patogenez hedefli etkili ilaçların bir araştırma önceliktir.
Histolojik olarak, KS lezyonlar geniş ama anormal neovaskülarizasyon sayede iğ hücreleri EC kökenli kesintili damar ağları5formu karakterizedir. Bu anormal gemiler ("vasküler yırtmaçlı") lezyonlar onların karakteristik renk ver eritrositler ekstravazasyonu izin. Ayrıca, lezyonlar kronik inflamasyon (yani, lenfosit, makrofaj ve plazma hücreleri) karakterize çok sayıda lökosit içerir. KS proliferatif hiper lezyon ve bir gerçek tümör6,7,8,9özelliklere sahiptir düşündüren regresyon bağışıklık sulandırma takip KS lezyonların tanımlanmıştır.
KS herpesvirus (KSHV), KS, hastalığının 199410dakika sonra tespit edilmiştir. Modeller geliştirilmiştir sonra birçok vitro hücre kültürü beri Patogenez çalışmalar etkinleştirmek için hücreleri de dahil olmak üzere tümör biyopsi malzeme ve ilköğretim explanted veya EC Revers ifade KSHV vitro11 ile enfekte , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. mevcut modelleri hiçbiri tam olarak KS tümör microenvironment tablodur, ama tüm değerli bilgi KSHV enfeksiyon pathobiology anlayışımız için bulunmuştur. Diğer bilinen tumorigenic insan herpesvirus Epstein - Barr virüsü (EBV), KSHV kolayca hücre kültüründe de novo enfeksiyon19,20,21, takip dönüştürmek değil 22. ancak, bu sınırlama birincil insan EC ya mikrovasküler veya lenfatik kökenli E6 ile karışık transducing tarafından üstesinden ve HPV E7 genler 16 KSHV23,24 mantar enfeksiyonu önce yazın . Bu eksojen oncogenes ifade önemli ölçüde KSHV vitro dönüşüm potansiyelini kısmen daha fazla Retinoblastom protein ve p5323,24inhibisyonu sağlayarak artırır. Bu EC iletim yöntemi ev sahibi anahtar değişiklikleri tanımlamak için birden çok laboratuvarlar bu KSHV enfeksiyon tarafından indüklenir ve KS hücre hayatta kalma ve nükleer silahların yayılmasına karşı25,26 kolaylaştırmak için görünen hücre gen ekspresyonu izin verdi , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. burada açıklanan protokoller basit ve son derece tekrarlanabilir ve üretimi Primer hücre daha çok uzun süre kültürlü ve sahte enfekte kontrol eder ve yaş ve geçiş Bahisler KSHV enfekte EC neden olur oncogenic mekanizmaları KSHV tarafından istihdam incelenmesi için izin verir. Protokol vahşi KSHV satırından birincil efüzyon Lenfoma hücre BCBL-1, E6/E7-ölümsüzleştirilmiş EC de son derece duyarlı türü üretim için bir yöntem bulunmasına karşın rekombinant BACmid ile enfeksiyon KSHV-BAC1630türetilmiş. İletişim kuralları BAC16 hazırlanması için başka bir yerde açıklanan33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 hücreleri</td><td>NIH AIDS Reaktif Programı</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Yenidoğan dermal mikrovasküler endotel hücreleri</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Bazal Orta</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Gelişmiş Biyoteknoloji</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLETMExpress, fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS içermez, kalsiyum ve magnezyum</td><td></td><td></td><td></td> içerir</tr></tbody></table>

hücresel dönüştürme kaposi sarkomu herpesvirus tarafından eğitim için bir vitro modeli

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon KSHV ile endotel hücrelerinin (EC) tarafından başlatılan ve en sık immünosupresyon ayarında geliştirir Proliferasyona iğ hücreleri oluşur alışılmadık bir tümör var. Onlarca yıllık araştırma rağmen KS en uygun tedavi kötü tanımlanmış kalır ve klinik sonuçlar kaynak sınırlı ayarları özellikle olumsuz. KS lezyonlar patolojik anjiogenezi, kronik inflamasyon ve oncogenesis tarafından tahrik edilmektedir ve bu süreçlerin çalışmaya çeşitli vitro hücre kültür modelleri geliştirilmiştir. EC-lineage hücreleri Spindl Hücre habercisi en uygun vitro vekilleri sağlamak böylece KS endotel kökenli KSHV enfekte hücrelerden doğar. Ancak, AK bir sınırlı vitro ömrü olduğundan ve KSHV tarafından istihdam oncogenic mekanizmaları daha az bu tumorigenic diğer virüsler daha verimli olduğu gibi bu ilkokulda dönüştürme işlemleri değerlendirmek zor olmuştur ya da Revers ölümsüzleştirilmiş EC Bu nedenle, bir roman kültür EC tabanlı model kolayca KSHV mantar enfeksiyonu takip dönüşümü destekleyen geliştirilmiştir. HPV tip 16 E6 ve E7 genlerinin Ektopik ifade genişletilmiş kültür, yaş ve geçiş Bahisler sahte ve KSHV-enfekte EC için izin verir ve gerçekten dönüştürülmüş gelişimini destekleyen (yani tumorigenic) enfekte hücre kültürlerinde fenotip . KS bu uysal ve son derece tekrarlanabilir model klinik ayarları içine çeviri için yüksek potansiyele sahip birkaç temel sinyal yolları keşfi kolaylaştırdı.

Birincil EC morfolojisi klasik "Arnavut kaldırımı taşı" olarak tanımlanır ve bu Morfoloji Papilloma virüsü E6 ve E7 genlerinin (şekil 1A) ifade tarafından değiştirilmez. İfade yalnız E6 ve E7 genlerinin dönüştürülmüş bir fenotip neden değil; Böylece, hücreleri inhibisyon temas duyarlı ve izdiham kültür ulaşan üzerine bölen sona erecek. Hücreler ancak çoğalırlar ve trypsinization ve kültürlerin yaş ve geçiş Bahisler kullanmak için sahte enfekte denetimleri olarak bakım içi...

Kaposi sarkomu (KS) enfeksiyon oncogenic virüs insan herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) ile indüklenen bir tümördür. Burada açıklanan endotel hücre kültür model benzersiz olarak hangi konak hücreleri KSHV dönüşümleri mekanizmaları eğitim için uygundur.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Bu prosedürün genel amacı, uygun kontroller bağlamında malign dönüşümü yönlendiren değişiklikler de dahil olmak üzere, konakçı hücre gen ekspresyonundaki KSHV ile ilişkili değişikliklerin incelenmesini sağlamak için KSHV ile enfekte endotel hücrelerinde yaş ve pasaj eşleştirmeli sahte hazırlamaktır. Bu yöntem, konak hücre biyolojisinde KSHV ile ilişkili kanserlere yol açan temel patofizyolojik değişikliklerin tanımlanmasına yardımcı olabilir, böylece hastalığın önlenmesi veya tedavisi için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu sistemin ana avantajı, KSHV ile enfeksiyonu takiben endotel hücrelerinin malign transformasyonunun hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde meydana gelmesi ve onkojenik süreçteki erken olayların yaş ve pasaj uyumlu kontrol hücreleri ile incelenmesine izin vermesidir.Bu viral onkogenez modeli, Kaposi Sarkomu gelişimi hakkında fikir verebilse de, diğer kanser türlerine de uygulanabilir. Kaposi Sarkomu vasküler bir tümör olduğundan, bu hücre kültürü modelinin etkileri, patolojik anjiyogenez tarafından yönlendirilen diğer hastalık süreçlerini anlamaya doğru uzanır. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi sterilize edilmiş TNE tampo

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Konak hücre faktörleri, kuruluş ve Kaposi sarkomu (KS) bakım çok önemli bir rol oynamaktadır. Biz KSHV enfekte DMVEC hücreleri değişmiş konak hücre faktörleri belirlemek için yöntemler anahat ve KS tümör dokusu. Virüs tarafından değiştirilmiş Hücresel gen roman tedavi için potansiyel hedef (ler) olarak hizmet edecektir.

Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) Yol Açtığı düzensiz Genler belirlenmesi

Biz bir model herpes, gamma herpes 68 (γHV68) litik çoğaltma konak sinyal molekülleri arasında önemli rolleri tanımlamak için bir protokol açıklar. Genetiği değiştirilmiş fare suşları ve γHV68 litik replikasyon için embriyonik fibroblastlar kullanarak, protokol fenotipik karakterizasyonu ve viral litik çoğaltma virüs konak etkileşimler moleküler sorgulama hem de izin verir.

Model Herpesvirüs Litik çoğaltma Diseksiyon Host-virüs Etkileşim

Canlı hücreler içinde ayrı DNA molekülleri gözlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu teknik ilgi DNA içine yerleştirilmiştir bağlanma yerleri için bir floresan etiketlendi lac represör proteininin bağlayıcı esas alınmaktadır. Bu yöntem, zaman içindeki çok sayıda canlı hücreler rekombinant DNA izlemek için adapte edilebilir.

Floresan Mikroskobu ile Çoklu Nesiller boyunca Canlı Memeli Hücrelerinde Plazmid Çoğaltma İzlenmesi

İnsan Kaposi sarkomu ile ilişkili Herpes (KSHV) ve Epstein-Barr virüsü (EBV) ile yakından ilgili olan bir model herpesvirüs, kemirgen gamma herpes virüsü 68 (γ HV68) ile enfekte olan fareler içindeki antiviral sitokin üretimini ölçmek için bir protokolü tarif eder. Genetik olarak modifiye edilmiş olan fare soyları ve fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) kullanarak, biz antiviral sitokin üretimini in vivo ve ex vivo hem de değerlendirildi. Lentiviral transdüksiyonu ile nakavt embriyonik...

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

Bu hayvan modellerinin doku bölümleri içinde kalıcı bir DNA virüsü genomunun saptanması için in situ hibridizasyon protokolünde bir floresan kurulmuştur. Bu protokol, viral genomun codetection, kendi RNA ürünleri ve tek bir hücre içinde viral veya hücresel proteinleri tarafından enfeksiyon süreci üzerinde çalışırken sağlar.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Floklanmış, koşullu onkojenik alellerle tasarlanmış ve viral Cre aracılı rekombinasyon yoluyla transforme edilmiş farelerden toplanan fenotipik vahşi tip astrositler ve nöral kök hücreler, astrositom patogenezini modellemek için kullanılabilir in vitro ve in vivo dönüştürülmüş hücrelerin sinjeneik, bağışıklığı yetkin yavruların beyinlerine ortotopik enjeksiyonu ile.

Modelleme Astrositom Patogenez İn Vitro Ve In Vivo Kortikal Astrositler veya Şartlı, Genetiği fareler ile Nöral Kök Hücreler kullanma

Biz situ hibridizasyon floresan kullanan bir protokol tarif (FISH) lytically enfekte insan hücrelerinin içinde birden fazla herpesviral RNA görselleştirmek için, süspansiyon veya yapışık. Bu protokol, nükleositoplazmik oran üreten floresan ların niceliğini içerir ve konak ve viral proteinlerin immünoresans (IF) ile eşzamanlı olarak görüntülenmesi için uzatılabilir.

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Bu protokol, Çift Bioluminesans görüntüleme ile tümör ilerlemesini ve anjiyogenezi gerçek zamanlı olarak izlemek için tümör taşıyan bir fare modelinin kurulması açıklanmaktadır.

Tümör Ilerlemesi ve anjiyogenezinin çift Bioluminescence görüntülenmesi

Bu protokol, insan meme hücrelerinin dönüşümünü değerlendirmek için deneysel in vitro araçlar sağlar. Hücre çoğalma hızının takibi, ankraj-bağımsız büyüme kapasitesi ve hücre soylarının 3Boyutlu kültürlerde bazal membran matrisi ile dağılımı nın detaylı adımları tanımlanmıştır.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Bu protokol, BAC16'dan türetilmiş viryonları kullanarak Kaposi sarkomu ile ilişkili herpes virüsünün de novo litik enfeksiyonunu modellemek için bir in vitro sistemi tanımlar. Yöntem, erken viral replikasyon ve yayılımının araştırılmasını sağlar. Enfeksiyöz virüs üretimi, GFP tabanlı enfeksiyöz birim testleri ve kapsüllenmiş viral genomların gerçek zamanlı PCR'si ile ölçülür.

Hücresiz Kaposi Sarkomu ile İlişkili Herpes Virüsü ile De Novo Litik Enfeksiyonun Kurulması ve Miktarının Belirlenmesi

Öğrenin, KSHV ile enfekte endotel hücrelerinde malign dönüşüm mekanizmalarını in vitro model kullanarak nasıl çalışılacağını. Bu yöntem, Kaposi sarkomu ve anjiyogenezle ilişkili kanserler için yeni tedavi hedefleri belirlemeye yardımcı olur.

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Daha fazla video keşfet