Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Bu prosedürün genel amacı, uygun kontroller bağlamında malign dönüşümü yönlendiren değişiklikler de dahil olmak üzere, konakçı hücre gen ekspresyonundaki KSHV ile ilişkili değişikliklerin incelenmesini sağlamak için KSHV ile enfekte endotel hücrelerinde yaş ve pasaj eşleştirmeli sahte hazırlamaktır. Bu yöntem, konak hücre biyolojisinde KSHV ile ilişkili kanserlere yol açan temel patofizyolojik değişikliklerin tanımlanmasına yardımcı olabilir, böylece hastalığın önlenmesi veya tedavisi için yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu sistemin ana avantajı, KSHV ile enfeksiyonu takiben endotel hücrelerinin malign transformasyonunun hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde meydana gelmesi ve onkojenik süreçteki erken olayların yaş ve pasaj uyumlu kontrol hücreleri ile incelenmesine izin vermesidir.

Bu viral onkogenez modeli, Kaposi Sarkomu gelişimi hakkında fikir verebilse de, diğer kanser türlerine de uygulanabilir. Kaposi Sarkomu vasküler bir tümör olduğundan, bu hücre kültürü modelinin etkileri, patolojik anjiyogenez tarafından yönlendirilen diğer hastalık süreçlerini anlamaya doğru uzanır. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi sterilize edilmiş TNE tamponunu hazırlayın ve filtreleyin.

Ardından çözeltiyi dört santigrat derecede saklayın. KSHV pozitif EBV negatif primer efüzyon lenfoma hücre hattı BCBL-1'i 60 mililitre RPMI ortamı ile doldurulmuş bir T150 şişesinde kültürleyin. Mililitre başına yaklaşık 1 ila 1.2 kez 10 ila altıncı hücrenin bir süspansiyonunu elde etmek için hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte tutun.

Uygun yoğunluğa ulaşıldığında, hücreleri bir ila iki taze ortamla bölün ve KSHV üretimini indüklemek için mililitre başına 20 nanogramlık bir nihai konsantrasyona PMA ekleyin. Sonra kültürleri beş gün boyunca kuluçkaya yatırın. Beş günlük inkübasyondan sonra, hücre süspansiyonlarını oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g'de döndürerek viral partikülleri hasat edin.

Ardından süpernatanları yeni bir tüpe aktarın. Hücresel kalıntıları gidermek için süpernatanları 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 2.500 kez g'de bir kez daha santrifüjleyin. Artık açıklığa kavuşturulduğuna göre, TNE'de beş mililitre% 25 sükroz çözeltisini, altı ultrasantrifüj tüpünde yaklaşık 30 mililitre süpernatan ile kaplayın.

Dengeli tüpleri vakum altında dört santigrat derecede iki saat boyunca 75.000 kez g'de santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatanı boşaltın ve mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarmak için her tüpün kenarını kurulayın. Daha sonra peletlenmiş virüsü 150 mikrolitre TNE tamponunda yeniden süspanse edin ve tüm örnekleri bir araya getirin.

Havuzlanmış süspansiyonu iyice karıştırın ve 25 mikrolitrelik alikotlara bölün. Stok virüsünü eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bir T75 şişesinde EGM ortamında birincil insan dermal mikrovasküler veya lenfatik endotel hücrelerinin kültürü.

Hücre kültürünü yaklaşık% 50 birleşmeye ulaşılana kadar 37 santigrat derece% 5 karbondioksitte tutun. Endotel hücrelerinin transdüksiyonundan önce, PA317 LXSN 16E6E7 hücrelerini, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitte 20 mililitre DMEM ile doldurulmuş bir T150 hücre kültürü şişesinde kültürleyin. Yaklaşık% 90 birleşme elde edildiğinde, ortamı PA317 hücre kültüründen 16 mililitre taze ortam ile değiştirin ve hücreleri gece boyunca inkübe edin.

Bir gece boyunca inkübasyonun ardından, ortamı PA317 hücre kültüründen toplayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleme ile berraklaştırın. EGM ortamını% 50 birleşik endotel hücre kültüründen 12 mililitre arıtılmış PA317 ortamı ile değiştirin. Hücreleri dört saat boyunca inkübe edin.

Daha sonra altı mililitre PA317 ortamını altı mililitre taze EGM ortamıyla değiştirin ve hücreleri gece boyunca inkübe edin. Daha sonra, ortamı endotel hücre kültüründen çıkarın ve hücreleri 12 mililitre taze EGM ile besleyin. Hücreleri 48 saat daha inkübe etmeye devam edin.

Endotel hücrelerini alt kültüre almak için, ortamı çıkarın ve hücreleri 12 mililitre katyonsuz PBS ile yıkayın. Daha sonra üç mililitre ticari bir enzimatik ayrışma çözeltisi ekleyin ve hücreleri üç dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin.

Peletlendikten sonra, hücreleri taze EGM ortamında yeniden süspanse edin ve süspansiyonu eşit olarak üç T75 şişesine bölün. Kültürlerin hacmini şişe başına 12 mililitre EGM'ye ayarlayın. Daha sonra, transdüksiyonlu endotel hücrelerini seçmek için mililitre başına 200 mikrogram G418 ekleyin.

Transdüksiyona uğrayan endotel hücrelerini, daha önce gösterildiği gibi enzimatik sindirim ile hasat edin. Endotel hücre peletini bir mililitre EGM ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunun beş mikrolitresini 45 mikrolitre Tripan Mavi Çözeltisi ile karıştırın ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.

Altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına iki mililitre EGM ortamında 2.5 kez 10 ila beşinci canlı hücreye tohumlayın. Ertesi gün, EGM ortamını çıkarın ve her bir kuyucuktaki hücreleri kalsiyum ve magnezyum içeren üç mililitre PBS ile yıkayın. Daha sonra her kuyucuğa iki mililitre EBM ortamı ekleyin.

Hücreleri KSHV ile enfekte etmek için, her bir oyuğa beş ila 20 mikrolitre virüs stoğu ekleyin ve süspansiyonları karıştırmak için plakayı döndürün. Sahte enfekte hücreler içeren her bir oyuğa eşit miktarda TNE tamponu ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 400 kez g'de santrifüjledikten sonra, 37 santigrat derecede 90 dakika inkübe edin.

Daha sonra her bir oyuğa iki mililitre EGM ortamı ekleyin ve kültürleri gece boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, EGM ortamını her bir oyuktan çıkarın ve iki mililitre taze EGM ile değiştirin. Hücreler yaklaşık% 90'lık bir birleşmeye ulaştığında, daha önce gösterildiği gibi enzimatik sindirim ile hasat edin.

Hücreleri üç kuyudan alarak, enfeksiyon sonrası geçişteki toplam geçiş sayısı ile etiketlenmiş bir T75 şişesine toplayın. Test etmeden veya dondurmadan önce, sahte ve KSHV ile enfekte olmuş endotel hücre kültürlerini en az iki ek geçiş için bir ila üç arasında bölerek genişletin. Burada, klasik parke taşı görünümünü ortaya çıkaran, birleşik sahte enfekte endotel hücrelerinin mikroskobik bir görüntüsü sunulmaktadır.

Bu hücrelerdeki hücresel bölünme, kültür birleştiğinde temas üzerine inhibe edilir. KSHV ile enfekte endotel hücreleri, Kaposi Sarkomu iğ hücrelerini anımsatan uzun iğ benzeri morfoloji geliştirir. Sahte enfekte hücrelerin aksine, KSHV ile enfekte olmuş endotel hücreleri, çok katmanlı hücre odaklarının gelişmesine yol açan birleşime ulaştıklarında bile çoğalmaya devam eder.

Substrat ile teması kaybettiğinde, sahte enfekte endotel hücreleri apoptotik hücre ölümüne, anoikis'e uğrar, ayrıca yumuşak agarda koloniler oluşturmazlar. Aksine, KSHV ile enfekte olmuş hücreler, yumuşak agarda kültürlendiğinde anoikis ve büyüyen kolonilere karşı dirençlidir. KSHV ile enfekte endotel hücrelerinde iğ şeklindeki morfolojinin gelişimine, viral latans proteini ORF73 ve daha az ölçüde bir viral süreçsellik faktörü ORF59'un ekspresyonu eşlik eder.

Yeşil bir floresan proteini ile etiketlenmiş KSHV BAC16 ile enfekte olduğunda, endotel hücreleri iğ şeklinde morfoloji geliştirdi ve gözlenen fenotipteki KSHV enfeksiyonu arasındaki geçici ilişkiyi doğrulayan GFP ekspresyonu gösterdi. Geliştirilmesinden sonra, bu hücre kültürü modeli, araştırmacıların KSHV enfeksiyonu tarafından indüklenen konak hücre mRNA ve protein ekspresyonundaki değişiklikleri değerlendirmelerinin yolunu açtı. Sonuç olarak, umut verici terapötik hedefleri temsil eden KSHV aracılı onkogenezin altında yatan anahtar patojenik mekanizmalar tanımlanmıştır.

Unutmayın, KSHV bir BSL-2 ajanıdır ve uygun biyogüvenlik muhafaza prosedürleri ve uygulamaları ile ele alınmalıdır.