Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Bu prosedürün genel amacı, basit, uygun maliyetli ancak çok yönlü bir dikiş tekniği kullanarak, küçük nanodesenli kalıplardan geniş alanlı nanodesenli altlıklar üretmektir. Bu yöntem; fokal adezyon proteinlerinin ekspresyonu gibi, altlık nanotopografyasının hücre fenotipi ve fonksiyonu üzerindeki modülasyonunun hücresel ve moleküler düzeylerde incelenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve maliyet etkin olmasıdır.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi, silanize edilmiş silikon kalıbı PDMS prepolimeri içinde hazırlayın. Silanize edilmiş silikon kalıbı 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. PDMS prepolimerini Petri kabındaki silikon kalıbın üzerine dökün.

Petri kabını plastik bir desikatöre yerleştirin ve tüm kabarcıklar kaybolana kadar yaklaşık 10 dakika boyunca gazını alın. Petri kabını bir ısıtıcıya aktarın ve PDMS prepolimerini 70 °C'de dört saat boyunca kürleyin. PDMS kalıbını, cımbız kullanarak silikon kalıptan dikkatlice soyun.

Nanogratings gibi anizotropik PDMS nanodesenlerin yönelimini bir optik mikroskop altında belirleyin ve bunu PDMS kalıpların arka yüzüne bir markör kalemle işaretleyin. Silikon altlığı bir çeker ocak içinde etanol ile temizleyin ve ardından basınçlı hava ile kurulayın. Her bir PDMS kalıbın desenlenmemiş alanlarını bir bıçakla kesin.

Desenlenmemiş alanı minimize etmek ve kompresör kuvveti uygulandığında nanopattern deformasyonu ile temas etmeyi önlemek için PDMS kalıplar, çevreleyen kalıba değmeyecek şekilde ancak mümkün olduğunca yakın hizalanmalıdır. Kırpılmış PDMS kalıbı, nanopattern yüzeyi aşağı bakacak şekilde silikon substratın ayna tarafına yerleştirin ve ardından diğer kalıpları çevreleyen kalıplara değmeyecek şekilde yakınına hizalayın. PDMS'i bazal tabakada kürlemeye çalışmak kritiktir; çünkü kürlenmemiş PDMS, birden fazla kalıp arasındaki boşluktan akabilir ve nanopatternlere zarar verebilir.

Bununla birlikte, tamamen kürlenmiş PDMS çoklu kalıpları birbirine bağlayamaz. Bir PDMS yapıştırıcı tabakası hazırlamak için, 0,5 milimetre kalınlığında bir tabaka oluşturacak şekilde bir gram gazı alınmış PDMS prepolimerini temiz bir lam üzerine dökün. PDMS tabakasını bir ısıtıcı plaka üzerinde 100 °C'de üç ila beş dakika boyunca pişirin.

Tabakaya bir iğne ile dokunarak tabakanın kısmen kürlendiğinden ancak tamamen kürlenmediğinden emin olun. PDMS tabakasını hizalanmış PDMS kalıplarının arka yüzüne yerleştirin, bu düzeneği hızlıca ters çevirin ve sıcak plakaya aktarın. PDMS yapışkan tabakası ile PDMS kalıplarının arka yüzü arasında iyi bir temas sağlandığından emin olmak için düzeneğin üzerine metal bir blok kullanarak sıkıştırma kuvveti uygulayın.

PDMS yapıştırıcı tabakasını 100 °C'de bir saat boyunca kürleyin. Isıtıcı plakayı kapatın, metal bloğu çıkarın ve tek dikişli PDMS kalıbı silikon alt tabakadan soyarak ayırın. Dikişli PDMS kalıbı PS plakaya nano baskı ile aktarmak için, PS plakayı üç inçlik bir silikon gofret üzerine yerleştirilmiş bir alüminyum ara parçaya yerleştirin.

PS plakayı bir ısıtıcı tabla üzerinde 250 °C'de 30 dakika boyunca ısıtın. Ardından, nano desenleri aşağı bakacak şekilde dikilmiş PDMS kalıbı, erimiş PS plakanın üzerine yerleştirin. Sonrasında, dikilmiş PDMS kalıbın cam lamı üzerine bir alüminyum plaka yerleştirin.

Alüminyum plaka üzerindeki metal blokları kullanarak basma basıncı uygulayın ve üç dakika bekleyin. Metal bloğu alüminyum plakadan kaldırıp yerine yerleştirin ve basma basıncını 25 kilopascals değerine yükseltin. Ardından, bu adımı basınç 50 kilopascals değerine çıkarılarak tekrarlayın.

Sıcak plakanın sıcaklığını 50 kilopascal tutarlı basınç altında 15 dakika boyunca 240 ile 250 santigrat derece arasında tutun. Sıcak plakayı kapatın ve tüm düzeneği soğutun. Sıcaklık 50 santigrat derecenin altına düştükten sonra metal blokları çıkarın ve dikilmiş PDMS kalıbını PS plakadan dikkatlice soyun.

PDMS kalıbı bir PS ince film üzerine nano baskılamak için, nanotopografya yüzeyi aşağıya gelecek şekilde birleştirilmiş PDMS kalıbını, bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirilmiş PS ince filmin üzerine yerleştirin. PDMS kalıbının cam lamı üzerine metal bloklar kullanarak PDMS kalıbına 12 kilopascals sıkıştırma basıncı uygulayın. Isıtıcı tablanın sıcaklığını 180 degrees Celsius dereceye yükseltin ve bu sıcaklığı 15 dakika boyunca koruyun.

Isıtıcı plakayı kapatın ve tüm düzeneğin soğumasını bekleyin. Sıcaklık 50 °C'nin altına düştüğünde metal blokları çıkarın ve dikilmiş PDMS kalıbı PS filmden dikkatlice soyun. İçi boş bir çelik yay şeklinde punch kullanarak, nanodesenli PDMS substratları belirli bir çok kuyucuklu plaka konfigürasyonuna uygun diskler şeklinde kesin.

Ardından, PDMS diskleri çok kuyucuklu plakanın kuyucuklarına yerleştirmek için cımbız kullanın. PDMS altlıkları %70 ethanol kullanarak 30 dakika boyunca sterilize edin. Sonrasında, ethanolu aspire edin ve bunu 30 dakikalık UV maruziyeti ile takip edin.

PDMS substratları 1X steril fosfat tamponlu salin ile üç kez yıkayın. Ardından, PDMS substratlarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücre dışı matris proteini ile kaplayın. PDMS substratlarını steril PBS ile her biri beş dakika sürecek şekilde üç kez durulayın.

İnsan A549 akciğer kanseri hücrelerini %10 fetal bovine serum içeren Dulbecco's Modified Eagle Medium içinde süspande edin ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Hücreleri, santimetrekare başına 2,000 hücre ekim yoğunluğunda PDMS alt tabakalara ekin. Hücreleri %5 carbon dioxide içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 degrees Celsius'ta bir gün boyunca kültüre edin ve ardından gözlemleyin.

PS plaka ve ince film üzerinde oluşturulan nanodesen burada gösterilmiştir. Oklar, birbirine eklenen PDMS kalıpların ara boşluklarındaki polimer yükseltilerini belirtmektedir. Bu SEM görüntüleri, ekleme tekniği uygulanarak, elektron demeti litografisi ile yazılan nanodesenin PDMS çalışma altlıklarına aslına uygun şekilde aktarıldığını kanıtlamaktadır.

Nanogratinkler ve nanopillarlar üzerinde büyütülen A549 hücrelerinin temsilci SEM görüntüleri burada gösterilmiştir. Hücreler, nanogratinkler üzerinde hizalanmış hücre morfolojisi sergilerken, nanopillarlar üzerinde rastgele yayılmışlardır. Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla küçük ve tanımlanmış nanodesenli kalıbı birleştirerek geniş alanlı bir nanodesenli substratın nasıl oluşturulacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Toluen ve paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve prosedürleri uygularken her zaman uygun kişisel koruyucu donanım kullanın.