Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Bu prosedürün genel amacı, basit ve uygun fiyatlı ancak çok yönlü bir dikiş tekniği kullanarak küçük nanodesenli kalıplardan geniş bir nanodesenli substrat alanı üretmektir. Bu yöntem, hücre fenotipinin substrat nanotopografi modülasyonunun incelenmesine ve fokal adezyon proteinlerinin ekspresyonu gibi hücresel ve moleküler seviyelerde işlev görmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve uygun maliyetli olmasıdır.

Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi PDMS prepolimerinde silanize silikon kalıbı hazırlayın. Silinize silikon kalıbı 60 milimetrelik bir Petri kabına koyun. PDMS prepolimerini Petri kabındaki silikon kalıbın üzerine dökün.

Petri kabını plastik bir kurutucuya yerleştirin ve tüm kabarcıklar kaybolana kadar yaklaşık 10 dakika gazdan arındırın. Petri kabını sıcak bir plakaya aktarın ve PDMS prepolimerini dört saat boyunca 70 santigrat derecede sertleştirin. Cımbız kullanarak PDMS kalıbını silikon kalıptan dikkatlice soyun.

Optik mikroskop altında nano ızgaralar gibi anizotropik PDMS nano modellerinin yönünü belirleyin ve PDMS kalıplarının arka tarafında bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Silikon alt tabakayı çeker ocakta etanol ile temizleyin ve ardından basınçlı hava ile kurulayın. Her PDMS kalıbının desensiz alanlarını bir bıçakla kesin.

PDMS kalıpları, desensiz alanı en aza indirmek ve kompresör kuvveti uygulandığında nanodesen deformasyonuna dokunmaktan kaçınmak için mümkün olduğunca yakın hizalanmalı, ancak çevredeki kalıba dokunmamalıdır. Kesilmiş PDMS kalıbını, nanodesen yüzü aşağı bakacak şekilde silikon alt tabakanın ayna tarafına yerleştirin ve ardından diğer kalıpları çevredeki kalıplara yakın ancak onlara dokunmayacak şekilde hizalayın. PDMS'yi bazal katmanda sertleştirmeye çalışmak çok önemlidir, çünkü kürlenmemiş PDMS çoklu kalıplar arasındaki boşluktan akabilir ve nanodesenlere zarar verebilir.

Bununla birlikte, tamamen kürlenmiş PDMS, çoklu kalıpları birbirine bağlayamaz. Bir PDMS yapışkan tabakası hazırlamak için, 0,5 milimetre kalınlığında bir tabaka oluşturmak için temiz bir cam slayt üzerine bir gram gazı alınmış PDMS prepolimeri dökün. PDMS katmanını 100 santigrat derecede sıcak bir plakada üç ila beş dakika pişirin.

Katmana dokunmak için bir iğne kullanın ve katmanın kısmen kürlendiğinden ancak tamamen kürlenmediğinden emin olun. PDMS katmanını hizalanmış PDMS kalıplarının arka tarafına yerleştirin, bu düzeneği hızlı bir şekilde ters çevirin ve sıcak plakaya aktarın. PDMS yapışkan tabakası ile PDMS kalıplarının arka tarafı arasında iyi bir temas sağlamak için tertibatın üstüne metal bir blok kullanarak bir sıkıştırma kuvveti uygulayın.

PDMS yapışkan tabakasını bir saat boyunca 100 santigrat derecede sertleştirin. Sıcak plakayı kapatın, metal bloğu çıkarın ve tek dikişli PDMS kalıbını silikon alt tabakadan soyun. Dikişli PDMS kalıbını PS plakasına nano baskı yapmak için, PS plakasını üç inçlik bir silikon gofret üzerine yerleştirilmiş bir alüminyum ara parçaya yerleştirin.

PS plakasını sıcak bir plaka üzerinde 250 santigrat derecede 30 dakika ısıtın. Ardından, dikişli PDMS kalıbını, nanodesenler yüzü aşağı bakacak şekilde erimiş PS plakasına yerleştirin. Ardından, dikişli PDMS kalıbının cam sürgüsüne bir alüminyum plaka yerleştirin.

Alüminyum plaka üzerine metal bloklar kullanarak basınç uygulayın ve üç dakika bekleyin. Metal bloğu alüminyum plakadan kaldırın ve değiştirin ve basınç basıncını 25 kilopaskal'a yükseltin. Ardından, 50 kilopaskal'a yükseltilmiş basınçla bu adımı tekrarlayın.

Sıcak plakanın sıcaklığını 240 dakika boyunca 250 kilopaskal tutarlı basınç altında 50 ila 15 santigrat derece arasında tutun. Sıcak plakayı kapatın ve tüm kurulumu soğutun. Sıcaklık 50 santigrat derecenin altına düştükten sonra metal blokları çıkarın ve dikişli PDMS kalıbını PS plakasından dikkatlice soyun.

PDMS kalıbını bir PS ince film üzerine nano baskı yapmak için, dikişli PDMS kalıbını nanotopografi ile yüzü aşağı bakacak şekilde sıcak bir plaka üzerine yerleştirilmiş PS ince filmin üzerine yerleştirin. PDMS kalıbının cam sürgüsü üzerinde metal bloklar kullanarak PDMS kalıbına 12 kilopaskal basınç basıncı uygulayın. Sıcak plakanın sıcaklığını 180 santigrat dereceye yükseltin ve 15 dakika koruyun.

Sıcak plakayı kapatın ve tüm kurulumu soğutun. Sıcaklık 50 santigrat derecenin altına düştükten sonra metal blokları çıkarın ve dikişli PDMS kalıbını PS filmden dikkatlice soyun. İçi boş bir çelik kemer zımbası kullanarak, nanodesenli PDMS alt tabakalarını belirli bir çok kuyulu plakanın konfigürasyonuna uyacak şekilde diskler halinde kesin.

Ardından, PDMS disklerini çok kuyulu plakanın kuyucuklarına yerleştirmek için cımbız kullanın. PDMS substratlarını 30 dakika boyunca% 70 etanol kullanarak sterilize edin. Daha sonra etanolü aspire edin ve bunu 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz bırakarak takip edin.

PDMS substratlarını 1X steril fosfat tamponlu tuzlu su ile üç kez yıkayın. Daha sonra, PDMS substratlarını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücre dışı matris proteini ile kaplayın. PDMS alt tabakalarını steril PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın.

Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda insan A549 akciğer kanseri hücrelerini %10 fetal sığır serumu ile askıya alın ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın. Hücreleri, PDMS substratları üzerinde santimetre kare başına 2.000 hücre tohumlama yoğunluğunda plakalayın. Hücreleri 37 santigrat derecede bir gün boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir atmosferde kültürleyin ve daha sonra gözlemleyin.

PS plakası ve ince film üzerinde oluşturulan nanodesen burada gösterilmektedir. Oklar, dikişli PDMS kalıplarının aralıklarındaki polimer yükselmesini gösterir. Bu SEM görüntüleri, PDMS ile çalışan substratların, dikiş tekniği uygulanarak elektron ışını litografi ile yazılmış nanomodelden aslına uygun olarak aktarıldığını göstermektedir.

Nano ızgaralar ve nanosütunlar üzerinde büyütülen A549 hücrelerinin temsili SEM görüntüleri burada gösterilmektedir. Hücreler nano ızgaralar üzerinde hizalanmış hücre morfolojisi gösterirken, hücreler nanosütunlar üzerinde rastgele yayılır. Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla, küçük tanımlı nanodesenli kalıbı dikerek geniş bir nanodesenli alt tabaka alanının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Toluen ve paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve prosedürleri gerçekleştirirken daima uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.