Name: Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Öğrenin, HepG2 hücreleri kullanılarak geliştirilen HBV muhabir sistemiyle hepatit B virüsü çoğaltma döngüsünün erken aşamalarını nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, anti-HBV ajanların yüksek verimli taramasını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'nın (AMED) Hepatit Araştırma Programı ve Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'nın (MEXT) Bilimsel Araştırma Hibeleri tarafından desteklenmiştir.

Reporter protein kodlayan rekombinant HBV 1. Üretim <ol><li> HepG2 hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Hücre kültürü ortamı hazırlayın (Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS ile takviye (DMEM)), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 100 U / ml esansiyel olmayan amino asitler). </li><li> Kültür ortamında 10 ml Transfeksiyondan bir önceki gün içinde 10 cm&#39;lik bir kollajen kaplı tabak Plaka 4 x 10 6 HepG2 hücreleri. Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de, HepG2 hücreleri inkübe edin. Not: yaklaşık olarak 4 x 10 6 HepG2 hücreleri kültür ortamında 10 ml, 10 cm kollajen kaplı tabak içinde plakalanır, bunlar% 70-90 konfluent ertesi gün olacaktır. </li></ol></li><li> transfeksiyon <ol><li> PUC1.2HBV ö epsilon 15 5 ug ve pUC1.2HBV / NL 15 5 ug ile transfekt HepG2 hücreleri transfeksiyon kullanılaraküreticinin talimatlarına göre reaktif. </li><li> Sonraki gün, kültür ortamı çıkarın ve taze kültür ortamı 10 ml. </li><li> Bir hafta sonra transfeksiyon 50 ml tüp rekombinant HBV ihtiva eden kültür ortamı aktarmak 1.3.1 adıma devam edin. transfekte edilmiş hücreleri içeren plaka taze kültür ortamı 10 ml. Not: Rekombinant HBV üretimi 4 hafta süre ile muhafaza edilir. Rekombinant HBV ihtiva eden kültür ortamı 1 ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li><li> Rekombinant HBV saflaştırılması <ol><li> santrifüj ile rekombinant HBV (5 dakika boyunca 2300 x g) ihtiva eden kültür ortamından hücre debrisini uzaklaştırmak. </li><li> 0.45 um&#39;lik bir membran filtresinden süpernatant geçirin. </li><li> Kültür ortamına:% 26 PEG / 1.5M NaCI (130 g, NaCl, 49 g, 0.5 M EDTA, pH 8.0, 1 ml, 1 M HEPES pH 5 ml 7.6 500 ml polietilen glikol 6000) bir eşit hacmi ekleme ihtiva eden rekombinantHBV ve hafifçe karıştırın. 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant atılır ve TNE 0.5 ml (10 mM Tris, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA) içinde pelet çözülür. </li><li> 5 dakika için 2300 x g&#39;de santrifüjleme ile çöpleri çıkarın. </li><li> TNE içinde 0.8 ml% 20 sükroz üzerinde yük yeniden birleştirici HBV ihtiva TNE 0.5 mi. </li><li> 15 ° C&#39;de 3 saat boyunca 100,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> mümkün olduğunca süpernatant kadar atmak ve pelet kaydedin. kültür ortamının başlangıç ​​40 ml başına serumsuz DMEM, 1 ml içinde süspanse edin. </li><li> 4 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 0.45 um&#39;lik bir filtre ile filtrelenir. -80 ° C de, 0.5 ml alikotları ve mağaza hazırlayın. Not: orijinal virüs numunenin raportör proteini kirlenme gözlenirse, 2 saat boyunca 100,000 x g&#39;de TNE içinde% 5-30 sükroz yoğunluk gradyanı ile ultra santrifüj ile virüs arındırmak ya da ileri geri CsCI yoğunluk dengelenmiş santrifüj50 saat boyunca 150.000 x g&#39;de m 1.1-1.6 g / ml olmuştur. </li></ol></li></ol> Rekombinant HBV 2. Enfeksiyon <ol><li> % 10 FBS, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 250 ug / ml G-418 ve 100 U / ml ile takviye edilmiş DMEM içinde HBV enfeksiyonuna duyarlı olan stabil bir şekilde NTCP (HepG2 / NTCP) 15&#39;i ifade eden kültür HepG2 hücreleri nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de gerekli olmayan amino asitler,. </li><li> Enfeksiyondan bir gün önce, plaka yaklaşık 5 x 10 4 HepG2 / kültür ortamına 0.1 ml, 96-çukurlu kollajen kaplı plaka NTCP hücreleri 14. </li><li> 37 ° C su banyosu içinde çözülme rekombinant HBV şişede kalan buz küçük bir bit olana kadar. </li><li> Aşağıdaki birleştirerek bulaşmasına orta hazırlayın: 1X fosfat tamponlu salin (PBS), dimetil sülfoksit, 2 ul (DMSO),% 40 PEG8000 10 ul rekombinant HBV 10 ul ve taze kültür ortamına 78 ul96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu. </li><li> 96 gözlü plakanın bir oyuğuna rekombinant HBV çözeltisi 100 ul ekle. </li><li> Enfeksiyondan bir gün sonra, virüs fraksiyondan kirletici raportör proteinini çıkarmak için, göz başına 300 | il PBS ile enfekte edilmiş hücrelerde 3 kez yıkayın. </li><li> Bir hafta ya da daha az,% 2 DMSO içeren kültür ortamında 200 ul enfekte hücreler inkübe edin. </li></ol> 3. Analiz <ol><li> Bir hafta sonra enfeksiyon, PBS ile enfekte edilmiş hücrelerde 3 kez yıkayın. </li><li> enfeksiyonlu hücrelere liziz tamponunda 50 ul ekle. </li><li> 5 dakika boyunca kültürü plakası sallayın, ve daha sonra 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Luminometre plakasına haberci substratın 50 ul ekle. </li><li> raportör alt-tabakayı içeren bir luminometre plakasına hücre lizatının 20 ul ekle. kısaca vorteks ile karıştırın. </li><li> Luminometreye plaka koyun ve 15 okuma başlatın. </li></ol>

<ol><li>Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+in+cirrhosis%3A+incidence+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors.</a> Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).</li>
<li>Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+strategies+are+required+to+cure+and+eliminate+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).</li>
<li>Wursthorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peginterferon+alpha-2b+plus+adefovir+induce+strong+cccDNA+decline+and+HBsAg+reduction+in+patients+with+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B.</a> Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).</li>
<li>Stuyver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+for+antiviral-resistant+human+hepatitis+B+virus+mutations+in+the+polymerase+region%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region.</a> Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).</li>
<li>Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+for+infection+with+hepatitis+B+virus+that+uses+primary+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).</li>
<li>Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+experimental+infection+of+primary+human+hepatocytes+with+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus.</a> Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).</li>
<li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li>
<li>Murakami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+direct+acting+antiviral+agents+for+HBV+using+in+silico+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).</li>
<li>Ladner, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+human+hepatitis+B+virus+%28HBV%29+in+stably+transfected+hepatoblastoma+cells%3A+a+novel+system+for+screening+potential+inhibitors+of+HBV+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> Elife. 3, (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+infectious+hepatitis+B+virus+vectors+carrying+substantially+sized+transgenes+by+redesigned+viral+polymerase+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation.</a> PLoS. One. 8, 60306(2013).</li>
<li>Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+replicative+and+nonreplicative+hepatitis+B+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors.</a> Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).</li>
<li>Hong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+hepatitis+B+virus+vectors+efficiently+deliver+protein+and+RNA+encoding+genes+into+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes.</a> J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Nishitsuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reporter+system+to+monitor+early+stages+of+the+hepatitis+B+virus+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle.</a> Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hepatitis+B+virus+genotypes+on+the+intra-+and+extracellular+expression+of+viral+DNA+and+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens.</a> Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).</li>
<li>Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=dxIrrMrot3gC&printsec=frontcover&source=gbs_ge_summary_r&cad=0">Field Virology. Volume 1</a>. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).</li>
<li>Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+elements+of+hepatitis+B+virus+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Viral.+Hepat%22%5BJournal%5D)">Regulatory elements of hepatitis B virus transcription.</a> J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).</li>
<li>Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+transcription+in+the+infected+liver%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus transcription in the infected liver.</a> EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).</li>
<li>Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+major+transcripts+of+ground+squirrel+hepatitis+virus%3A+the+presumptive+template+for+reverse+transcriptase+is+terminally+redundant%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant.</a> Cell. 42 (1), 297-308 (1985).</li>
<li>Haines, K. M., Loeb, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+of+the+RNA+primer+and+the+DNA+template+influence+the+initiation+of+plus-strand+DNA+synthesis+in+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus.</a> J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).</li>
<li>Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1690862">Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription.</a> Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

HBV genomu çekirdeği, polimeraz, yüzey ve X ORF (Şekil 1) dahil olmak üzere dört ana açık okuma çerçevelerini (ORF) sahiptir. Bu dört HBV ORF transkripsiyon sıkıca dört rehberleri tarafından düzenlenir: prekor / çekirdek geliştirici arttırıcı II içeren, S1 promotör, S2 promotör ve X yükseltici zenginleştirici 18 I içeren. 3.5 kb ve 3.4 kb mRNA&#39;ların sırasıyla prekor ve Core proteinler çevrilir. Büyük zarf proteini (L) en büyük alt-genomik mRNA (2.5 kb) için üretilir, ve orta ...

Hepatit B virüsü (HBV) ile kronik enfeksiyon kronik karaciğer hastalıklarında 1 için önemli bir risk faktörüdür. Mevcut tedavi stratejileri interferon uyarımlı gen fonksiyonlarının 2 ile HBV pol fonksiyonu ve / veya enfekte olmuş bireylerde bağışıklık yanıtlarını aktive tip I interferon verilmesini de dolaylı bastırıcı HBV proliferasyonunu inhibe nükleotid analoglan dayanmasına rağmen, bu tedaviler HBV ortadan kaldırmaz DNA tamamen 3. Ayrıca, bir anti-pol maddeler karşı dirençli olan HBVlerin çıkışı endişe 4 taşımaktadır. şirketinden insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV) veya hepatit C virüsü (HCV), yaşam döngüsünün farklı adımlarını hedefleme kombine anti-viral ajanlar uygulanması başarılı bastırmak ya da virüs (ler) ortadan kaldırmak için gösterilmiştir. Bu fikrin, H farklı aşamalarında doğrudan etki anti-HBV ajan (lar) gelişimine benzerBV yaşam döngüsü gelecek HBV terapileri kurulması için önemlidir. Genel olarak, hedef virüs in vitro kültür sistemi basit bir kurulması anti-virüs maddelerinin geliştirilmesini kolaylaştırır. Bununla birlikte, anti-HBV maddeleri taramak için in vitro kültür sistemlerinin geliştirilmesi için en az iki engeller bulunmaktadır. İlk HBV enfeksiyonu / proliferasyonu için uygun bir in vitro hücre kültürü sisteminin olmamasıdır. Kurulan hücre hatlarında yayılır, HIV ve HCV gibi diğer virüsler, aksine, bunun nedeni, dar konukçu aralığının içeren deney sınırlamaları in vitro HBV yetiştirmek için zordur. Bu HBV enfeksiyonunun, 5, 6 karşı hassas olan, insan hepatoma hücre hattı HepaRG, belirli hücre kültür sistemlerinin kullanılması, 7, bu problemlerin üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, ürokinaz ty izole PXB hücreleri,PE plazminojen aktivatör transjenik / primer insan hepatosit (Ph) ile aşılanır SCID fareleri, HBV enfeksiyonu ve çoğaltma 8 duyarlı olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, HepaRG HBV replikasyon seviyesi HBV enfeksiyonu / çoğaltma seviyelerinin tutarsız ve &#39;tekrarı sonuçlara neden olabilir kültürden sonra hücre farklılaşması durum, bağlıdır. PXB yaygın HBV enfeksiyonu deneyleri için kullanılan ama durumu ile sınırlıdır. Bir tetrasiklin uyanlabilir HBV sentezleme hücre soyu, HepAD38, aynı zamanda yaygın HBV replikasyonunu incelemek için kullanılmıştır, ama bu sistem, sadece, transkripsiyon sonrası olup, HBV enfeksiyonu 9 giriş adımında değerlendirme sağlar. Son zamanlarda, HBV için işlevsel bir reseptör olarak, sodyum taurokolat cotransporting polipeptidin tanımlanması (NTCP) değişken bir HBV kültürü sisteminin 10 geliştirilmesine imkan tanımıştır. Gerçekte, bu tür Huh7 olarak duyarlı olmayan hepatokarsinoma hücrelerinin NTCP ekspresyonu veHepG2 HBV enfeksiyonunun 10 sağlar ve bu nedenle, HBV hassas hücre hatlarının seçimi deney sınırlamaları birçok çözme genişletilmiştir. İkinci bir sorun, HBV enfeksiyonu ve çoğaltma değerlendirmek için basit bir deney sisteminin olmamasıdır. HBV enfeksiyonu değerlendirilmesi genellikle HBV DNA, RNA ve proteinler analiz ederek yapılır. Ancak, bu virüs belirteçlerinin ölçümü genellikle masraflı ve zaman basit değil zaman tüketen vardır. Bu nedenle, basit bir deney sisteminin geliştirilmesi, bir raportör gen kullanılarak, HBV deney sistemleri ile ortaya çıkan problemlerin üstesinden gelinebilir. Bununla birlikte, bir HBV kapsid içinde paketlenebilir genom boyutu sınırlı olduğundan, - en az 3.7 kb 11 - Bir raportör genin boyutu mümkün olduğu kadar kısa olması gerekir. Ayrıca, viral replikasyon için gerekli olan genom boyunca dağılmış birden çok cis elemanlarının varlığı bölgesi için uygun pozisyonlar sınırlar<html> genomuna haberci genin yerleştirilmesine. Çeşitli raporlar, HBV genomunda 11, 12, 13 içine, HIV-1 Tat, yeşil floresan protein ve DsRed dahil olmak üzere yabancı genleri, eklemek için çalıştılar. Bununla birlikte, bu yeniden birleştirici HBVlerin HBV enfeksiyonu / çoğaltma ya da HBV enfeksiyonu / çoğaltma etkileyen faktörler yüksek verimli tarama taranması için kullanışlı değildir. Bu esas olarak bir araya getiren virüslerin, düşük verimlilik ve yetersiz virüs üretiminin neden raportör gen ekspresyonunun düşük yoğunluktadır. Bu sorunları aşmak için, virüs üretiminin yüksek verim ile bir muhabir HBV inşa. Bu virüs girişinden transkripsiyonu için, HBV replikasyon döngüsünün erken aşamalarında izlenmesi için son derece duyarlıdır. Bu, küçük bir (171 amino asit) lüminesan raportör tasarlanmış olduğu için bu elde etmek için, NanoLuc (NL), bir işaretleyici gen olarak seçilmiştirclass = &quot;xref&quot;&gt; 14. Ayrıca, NL ateşböceği ya Renilla lusiferaz daha parlak 150 kat yaklaşık ve lüminesan Reaksiyon yanlış isabet oranı yüksek verimli tarama düşük olacağını düşündürmektedir ATP&#39;ye bağımsızdır. Rekombinant HBV üretim verimi yaklaşık 1/5 ebeveyn HBV bölgesinin ve önceki HBV yeniden birleştirici virüs rapor seviyelere benzer; anti-HBV maddelerinin kitlesel taranması için kullanılabilir ancak, NL parlaklığı virüsü verimliliği ilgili sorunların üstesinden gelmektedir. Birincil hepatositleri kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması, HepaRG, HepAD38 ve NTCP-kalıt hepatositler, geleneksel yöntem (ler) anti-HBV maddelerinin taranması için yararlı olabilir. Ancak, burada açıklanan sistem, kolay kullanım, yüksek hassasiyet ve tarama için düşük maliyetli gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Bu avantajlar, geliştirmek ve terapötik amaçlar için yeni HBV maddelerin belirlenmesi için kapsamlı incelemeler için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Nano-Glo Luciferase Testi Regent</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Karışık Çözelti</td><td>Nacalai tesque</td><td>09367-34&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm/kollajen kaplı çanak</td><td>Iwaki</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 3000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Termo Fisher Bilimsel</td><td>L3000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol (PEG) 6000&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81255</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol (PEG) 8000&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai tesque</td><td>31319-45&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mol/L EDTA Çözeltisi</td><td>Nacalai tesque</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP, 0,45 & mu; m, polietersülfon, filtre</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen kaplı 96 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>NO3585</td><td></td></tr><tr><td>Pasif Lizis 5x Tampon</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 Mikroplaka Luminometre</td><td>Promega</td><td>E6501</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Nacalai tesque</td><td>30403-55</td><td></td></tr><tr><td>Luminometre plakası</td><td>Greiner bio-one</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>HepG2-NTCP1-myc-clone22</td> <td>-</td><td></td> <td>Referans 15</td></tr><tr><td>pUC1.2HBV delta epsilon</td> <td>-</td><td></td> <td>Referans 15</td>pUC1.2HBV</tr><tr><td>/ NL</td> <td>-</td><td></td> <td>Referans 15</td></tr><tr><td>50 ml tüp</td><td>Violamo</td><td>1-3500-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc antikor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3956</td><td></td></tr><tr><td>HBIG</td><td>Japonya Kan Ürünleri</td> <td>Organizasyonu-IFN</td><td></td></tr><tr><td>-&beta;</td><td>Mochida İlaç</td><td>14987224005413</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr></tbody></table>

bir hepatit b virüsü muhabir sisteminin geliştirilmesi Çoğaltma döngüsü erken aşamaları monitör

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Şu anda, insan immün yetmezlik virüsü 1 (HIV-1) ve hepatit C virüsü (HCV) gibi genomlarında raportör veya işaretleyici protein gibi yabancı genler taşıyan çeşitli virüslerin rekombinant formlarını oluşturmak mümkündür. Bu rekombinant virüsler genellikle enfekte hücrelerde orijinal virüsün yaşam döngüsünü sadık bir şekilde taklit eder ve aynı konak aralığı bağımlılığını sergiler. Rekombinant bir virüsün geliştirilmesi, inhibitörlerin etkili bir şekilde taranmasını ve spesifik konak faktörlerinin tanımlanmasını sağlar. Bununla birlikte, bugüne kadar rekombinant hepatit B virüsünün (HBV) inşası çeşitli deneysel sınırlamalar nedeniyle zor olmuştur. Ana sınırlama, HBV'nin kompakt genom boyutu ve viryonlar halinde paketlenmesi gereken 1.3 genom boyutunu aşmayan oldukça katı bir genom boyutudur. Bu nedenle, genom DNA'sında herhangi bir silme işlemi yapılmayacaksa, yerleştirilecek yabancı bir genin boyutu 0.4 kb'den küçük olmalıdır. Bu nedenle, bu boyut sınırlamasının üstesinden gelmek için bazı HBV DNA'larının silinmesi gerekir. Burada, HBV pol kodlama bölgesinin bir kısmını silerek HBV çekirdek kodlama bölgesinin bir kısmını raportör genle değiştirerek HBV replikasyon döngüsünün erken aşamasını izlemek için bir raportör geni kodlayan rekombinant HBV kodlamasının yapısını rapor ediyoruz. Raportör aktivitesi tarafından izlenen rekombinant HBV enfeksiyonunun tespiti, HBV enfeksiyonunu değerlendirmek için şu anda mevcut olan geleneksel yöntemler kullanılarak yapılan tespitten oldukça hassas ve daha ucuzdu. Bu sistem, anti-HBV inhibitörlerinin, konak faktörlerinin ve virüse duyarlı hücrelerin tanımlanması için yüksek verimli tarama dahil olmak üzere bir dizi uygulama için faydalı olacaktır.

Şekil 1 genomu HBV genomu, transkribe edilmiş RNAlar, virüs proteinleri ve kodlama bölgesinin bir şemasını göstermektedir. genomunda raportör geni ve konumu da gösterilir. Şekil 2, raportör genini ihtiva eden HBV raportör plasmidi ve yardımcı plazmit gösterir. PUC1.2HBV / NL raportör pUC1.2HBV 16 prekor mRNA transkripsiyon başlatma sitesinden nükleotid pozisyonları 223-811 silme ve raportör geni sokulması ile yapılmıştır. Enkapsid...

Burada HBV yaşam döngüsünün erken aşamalarında izlemek için yeni geliştirilmiş hepatit B virüsü (HBV) muhabiri sistemini açıklar. Vitro sistemde BASİTLEŞTİRİLMİŞ yüksek verimli bir strateji kullanılarak anti-HBV maddelerinin taranması yardımcı olacaktır.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Bu rekombinant HBV reporter sisteminin genel amacı, anti-Hepatit B virüsü veya HBV ajanları için kitlesel tarama yapılmasını kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, anti-HBV ajanlarının taranması ve konak HBV faktörlerinin belirlenmesi gibi HBV alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, HBV reporter sisteminin HBV replikasyon döngüsünün erken aşamalarını izleyebilmesidir.Hücre kültürü ortamı hazırlandıktan sonra, transfeksiyondan bir gün önce, 10 cm'lik kolajen kaplı bir kaba ortam içinde 4 × 10⁶ HepG2 hücresi yerleştirin. Hücreleri, nemlendirilmiş %5CO2 inkübatörde 37 °C'de inkübe edin. Üretici talimatlarına uygun bir transfeksiyon ajanı kullanarak, hücreleri 5 µg pUC1 2HBV delta epsilon ve 5 µg pUC1 2HBV/NL ile transfect edin.Ertesi gün, kültür ortamı uzaklaştırılır ve 10 mL taze kültür ortamı eklenir. Ardından, transfeksiyondan bir hafta sonra, rekombinant HBV içeren kültür ortamı 50 mL'lik bir tüpe aktarılır. Sonrasında, transfekte edilmiş hücreleri içeren plağa 10 mL taze kültür ortamı eklenir.Ardından, rekombinant HBV içeren hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için kültür ortamını toplayın ve 2, 300 x g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. S

development-hepatitis-b-virus-reporter-system-to-monitor-early-stages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Nishitsuji, H., et al. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, erken enfeksiyon olaylarının incelenmesi ve yüksek kapasiteli antiviral ilaç tarama uygulamaları için güvenli, replikasyon yeteneği olmayan viral preparasyonların hazırlanmasına olanak tanıyan rekombinant Hepatit B virüsü partiküllerinin üretimini ve saflaştırılmasını göstermektedir.

Rekombinant Hepatit B Virüs Partiküllerinin Üretimi ve Saflaştırılması

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Bu videoda, rekombinant bir HBV raportör sistemi aracılığıyla hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonunu tespit etmek için kullanılan bir in vitro teknik gösterilmektedir. Konakçı hücreleri enfekte ettikten sonra, rekombinant viral genom, substratını oksitledikten sonra biyolüminesans üreten lusiferaz raportör enzimini eksprese eder - viral enfeksiyonu tespit etmeye yardımcı olur.

Viral Enfeksiyonun Tespiti için İn Vitro Rekombinant Virüs Raportör Sistemi

Hepatit C Virüsü (HCV), siroz ve kanser dahil olmak üzere karaciğer bozukluklarına neden olan önemli bir insan patojenidir. HCV enfeksiyöz hücre kültürü sistemi, HCV replikasyonunun moleküler mekanizmasını anlamak ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için gereklidir. Burada, HCV replikasyon döngüsünün çeşitli aşamalarını araştırmak için bir protokol açıklıyoruz.

Hepatit C Virüsü Çoğaltma Analizi için Protokol

Bu spektral farklı raportör florofor safha spesifik ifadesi ile bir viral enfeksiyon ve gen ifadesinin gerçek zaman ölçümünü sağlayan bir flüoresan raportör ineklerdeki çiçek hastalığı virüsünün kullanımını tarif eder. Bu detay doğru virüs çoğaltma, küçük moleküllü inhibisyonuna yanıt olarak etkilendiği aşama belirlenmesi için, bir plaka-bazlı yöntem.

Gen İfade Tüm Dönemlerinde Viral Fonksiyonu sayısallaştırabilmek için vaksiniya Reporter Virüsler

Burada, yeni antiviral ajanları tanımlamak ve değerlendirmek için viral girişin belirli adımlarını inceleyen bir protokol sunuyoruz.

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Biz burada HBV DNA vitro nesil bir Hepatit B virüs enfeksiyonu sistemi üzerinden tarif ve tersini kullanarak (1-2 kopya) entegrasyonu son derece hassas tespiti PCR iç içe.

Algılama düşük kopya sayısı Vitro hepatit B enfeksiyonu tarafından kurulan entegre Viral DNA

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Bu el yazması, insan NTCP, HNF4α, RXRα ve PPARα'yı ifade eden 293T-NE-3NR' ler ve geleneksel hepatik hücreler (HepG2-NE, insan NTCP'yi ifade eden) yeni mühendislik temalı 293T hücreleri (293T-NE-3NR) enfeksiyonu için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Hepatik Olmayan 293T-NE-3NR Hücrelerinde Hepatit B Virüs Enfeksiyonunun Modelilmesi

Konakçı sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit ile bağlanma afinitesini (KD) ölçmek için izotermal titrasyon kalorimetrisini kullanarak, viral giriş öncesi ve sonrası yaşam döngüsü aşamalarını hedefleyen anti-hepatit B virüsü (HBV) bileşiklerini taramak için bir protokol sunuyoruz. Antiviral etkinlik, viral yaşam döngüsü belirteçlerinin (cccDNA oluşumu, transkripsiyon ve viral montaj) baskılanması yoluyla belirlendi.

Terapötik Hedef Olarak Polipeptitin Sodyum Taurokolat Kotransportasyonu Yoluyla Hepatit B Virüsü Girişini İnceleyen Yetkin Bir Hepatosit Modeli

Hepatit B virüsü (HBV) DNA'sının gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı tespiti ve miktarının belirlenmesi, HBV enfeksiyonunun teşhisi ve izlenmesi için hassas ve doğru bir yöntemdir. Burada, HBV DNA tespiti ve bir numunenin viral yük ölçümü için bir protokol sunuyoruz.

Hepatit B Virüsü DNA'sının Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Tabanlı Tespiti ve Miktar Tayini

Öğrenin, HepG2 hücreleri kullanılarak geliştirilen HBV muhabir sistemiyle hepatit B virüsü çoğaltma döngüsünün erken aşamalarını nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, anti-HBV ajanların yüksek verimli taramasını kolaylaştırır.

Bir Hepatit B Virüsü Muhabir Sisteminin Geliştirilmesi Çoğaltma Döngüsü Erken Aşamaları Monitör

Daha fazla video keşfet