kantitatif 3D Siliko Modelleme (q3DISM)

Bu kantitatif 3 boyutlu in silico modellemenin veya q3DISM tekniğinin genel amacı, Alzheimer hastalığının kemirgen modellerinin beyinlerindeki mononükleer fagositler tarafından amiloid-beta alımını ölçmektir. Bu yöntem, Alzheimer hastalarının beyinlerinde biriken ve yaşlılık plakları oluşturan amiloid-beta'nın klirensini ölçmek için Alzheimer araştırmaları alanında acil bir ihtiyacı karşılamaktadır. İlk kez, bu teknik, in vivo makrofajlar tarafından amiloid-beta'nın gerçek 3 boyutlu rekonstrüksiyonunu ve kantitasyonunu mümkün kılıyor Amiloid-beta birikimini incelemek için işaretli 3-Dism'yi kullanmaya başladık çünkü mikrofaj fagositozunu in vivo olarak görselleştirmek ve ölçmek için sağlam bir araca ihtiyacımız vardı.

Bu teknik, hangi ilaçların amiloid-beta'nın etkili bir şekilde temizlenmesi için makrofajları uyardığını değerlendirmek için deneysel Alzheimer hastalığı terapötiklerinin test edilmesinde yararlı olabilir. Doku örnekleri immün boyama için hazır olduğunda, hidrofobik bariyer kalemle çevrili doku bölgesini, nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyon için bloke edici tampon ile doldurun. İnkübasyonun sonunda, blokaj tamponunu, nemlendirilmiş odada gece boyunca 4 santigrat derecede ilgilenilen ilk birincil antikor ile değiştirin.

Ertesi sabah, numuneleri oda sıcaklığında hafif çalkalama ile beş dakikalık üç PBS banyosunda yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, slaytları ışıktan korunan oda sıcaklığında uygun floresan ikincil antikor ile inkübe edin. Bir saat sonra, bölümleri ışıktan korunan PBS'de üç kez daha yıkayın.

Daha sonra hücreleri, az önce gösterildiği gibi önümüzdeki iki ila dört gün boyunca ilgilenilen diğer dokuya uygun birincil ve ikincil antikorlarla etiketleyin. Hücresel ve süper hücresel bölmeleri ve amiloid-beta birikintilerini verimli bir şekilde boyamak için, bir seferde yalnızca bir birincil antikor ve ardından karşılık gelen ikincil antikor ile etiketlemek çok önemlidir. Zaman alıcı ancak sonucu optimize eden bir süreç.

İkincil antikor boyamasının son yıkamasını takiben, bölümlerin karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca tamamen kurumasını bekleyin. Ardından, kurutulmuş numuneleri DAPI içeren floresan montaj ortamı ile kapatılmış bir kapak fişi ile örtün. Numuneleri konfokal mikroskopi ile görüntülemek için 60x mikroskop objektifini seçin ve lense daldırma yağı ekleyin.

Numuneyi mikroskop tablası sürgü tutucusuna yerleştirin ve yağ sürgü ile temas edene kadar objektifi kaldırın. Epifloresan aydınlatma kullanarak, hipokampus veya serebral korteksteki amiloid plaklarını bulmak için odak düzlemini ayarlayın. Daha sonra, hipokampus veya korteksteki amiloid birikintilerini çevreleyen aktive edilmiş mononükleer fagositlerin konfokal görüntülerini elde edin.

Kalitatif 3 boyutlu in silico modelleme için, önce tüm Z düzlemlerinde aynı anda aktive edilmiş makrofaj işaretleyici boyamanın uzamsal yakınlığı için bir analiz yazılımı kolokalizasyon modülünde bilimsel 3 boyutlu görüntü işleme ile konfokal veri kümelerini analiz edin. Aktive edilmiş mononükleer fagositler içinde fagolizozom boyamasına karşılık gelen kolokalizasyon kanalları oluşturun. Kanal A için TRITC'yi ve Kanal için FITC'yi seçin B.In Mod Kontrolü penceresinde Eşik'i seçin.

Yerelleştirme yoğunlukları için Kaynak Kanallar'ı seçin. Yerelleştirme rengini seçmek için Düzenle'yi tıklatın. Ardından, belirli boyamayı dahil etmek ve arka planı ve spesifik olmayan sinyalleri hariç tutmak için her kanalın eşiklerini bağımsız olarak ayarlayın.

Birlikte yerelleştirilmiş vokseller, tüm z yığınlarında aynı anda seçilen yerelleştirme renginde görünecektir. Ardından, Yerelleştirme Kanalı Oluştur'a tıklayın. Oluşturulan colocalizaton kanalı, Display Adjustment (Görüntü Ayarı) penceresinde görünecektir.

Kanal istatistiklerini açmak için yerelleştirme kanalına tıklayın. Eşiğin üzerinde kolokalize edilen A hacim materyalinin yüzdesi, fagolizozomlar tarafından işgal edilen monosit hacmini temsil eder. Kolokalizasyon Modülünü kullanarak, fagolizozomlar içinde kapsüllenmiş amiloid-beta'yı ölçmek için amiloid-beta sinyalleriyle uzamsal yakınlık için kolokalizasyon kanalını analiz edin.

Kanal A yerelleştirme veri setini ve Kanal B için Cy5'i seçin ve az önce gösterildiği gibi bir yerelleştirme kanalı oluşturun. Kanal istatistiklerini tekrar açmak için yerelleştirme kanalına tıklayın. Eşiğin üzerindeki A hacminin yüzdesi kolokalize edildi, amiloid-beta tarafından işgal edilen fagolizozomal hacmi temsil eder.

Surpass Modülünü kullanarak, konfokal görüntü yığınlarını yeniden oluşturun ve monosit fagolizozomları içinde kapsüllenmiş amiloid-beta'nın 3 boyutlu modellerini oluşturun. Ekran Ayarı penceresinde, yalnızca makrofaj boyamayı göstermek için TRITC'yi seçin ve hacim özelliklerinde "yeni yüzey ekle"ye tıklayın. Ayarlar'ın altında, beşinci adımın birinci adımında, algoritma'da Yüzey'i seçin.

Renk'te, ilgilendiğiniz renk türünü seçin ve saydamlığı uygun şekilde ayarlayın. Ardından ilgilenilen bölgeyi seç kutusunu işaretleyin ve ileri'ye tıklayın. Beşinci adımın ikinci adımında, ilgi alanı, ilgilenilen hücrenin etrafına bir pencere çizmek için X, Y ve Z koordinatlarını ayarlayın ve ileri'ye tıklayın.

Beşinci adımın üçüncü adımında, kaynak kanalı, TRITC kaynak kanalını seçin ve Düzgün kutusunu işaretleyin. Yüzey alanı ayrıntı seviyesini 0,4 mikron olarak ayarlayın ve ileri'ye tıklayın. Beşin dördüncü adımı olan eşikte, eşiği, oluşturulan ses seviyesi TRITC kanal sinyaliyle mükemmel bir şekilde örtüşecek şekilde ayarlayın ve ileri'ye tıklayın.

Son olarak, beşinci adımın beşinci adımında, yüzeyleri sınıflandırın, Filtre Türleri bölümünde, oluşturulacak birimlere dahil edilecek veya hariç tutulacak nesneleri boyutlarına göre seçin. FITC kanalı ile fagolizozomlar ve Cy5 kanalı ile amiloid-beta için 3 boyutlu yüzeyler oluşturmak için aynı adımları tekrarlayın. Kalitatif 3-D in silico modellemeden sonra, az önce gösterildiği gibi, transgenik farelerin ve sıçanların beyinlerindeki monosit fagolizozomlarına amiloid-beta alımı analiz edilebilir.

İlginç bir şekilde, CD68 pozitif fagolizozomların kapladığı hacim, hem farelerde hem de sıçanlarda plaklardan uzak olanlarla ilişkili Iba1 pozitif mononükleer fagositlerde önemli ölçüde artar, bu da plakların yakınındaki mononükleer fagositlerin, plaklardan uzakta bulunan hücrelere kıyasla fagositoz için hazır olduğunu gösterir. Plak ile ilişkili mononükleer fagositlerin, plaklardan uzak hücrelere kıyasla transgenik farelerde artmış bir amiloid-beta alımı sergilediği, transgenik sıçanlarda ise genel olarak çok mütevazı bir amiloid-beta fibril alımı gözlendiği ve plaklara olan mesafenin bir fonksiyonu olarak amiloid-beta fibril fagositozunda belirgin bir değişiklik olmadığı da dikkat çekicidir. Bu prosedürü denerken, konfokal görüntülerin kalitesinin çok önemli olduğunu ve kolokalizasyon analizi sırasında tüm kanallar için benzer eşiklerin uygulanması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, nöroinflamasyon alanındaki araştırmacıların, Alzheimer hastalığının kemirgen modellerinin beyinlerindeki fagositik olayları keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, mononükleer fagositler, fagolizozom ve amiloid-beta için kemirgen beyin bölümlerini nasıl etiketleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Serebral amiloid-beta'nın fagositozunu in vivo olarak 3 boyutlu olarak ölçmek için.