Incelenmesi Protein Fonksiyonu, Spatiotemporal Yerelleştirme ve Protein Etkileşim Ağları için İndüklenebilir LAP-etiketli Kararlı Hücre Hatları

Bu prosedürün genel amacı, protein fonksiyonunu, uzay-zamansal lokalizasyonu ve protein etkileşim ağlarını araştırmak için indüklenebilir lokalizasyon ve afinite saflaştırması veya LAP etiketli kararlı hücre hatları oluşturmaktır. Bu yöntem, moleküler ve hücre biyolojisinde protein fonksiyonu, protein hücre döngüsü sıfırın altında lokalizasyon ve protein etkileşimleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, protein gruplarının yüksek verimli analizine uygun olması ve biyolojik yolların protein bileşenlerini incelemek için kullanılabilmesidir.

Bu prosedüre başlamak için, ilgilenilen genin açık okuma çerçevesini LAP etiketli vektöre klonlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi HEK293 hücrelerine aktarın. Transfeksiyondan bir gün sonra, eksi Tet DMEM/F12 ortamını yeni ortamla değiştirin. Transfeksiyondan iki gün sonra, hücreleri %25'lik bir birleşmeye bölün.

Hücrelerin takılması için yaklaşık beş saat bekleyin. Ardından, önceden belirlenmiş konsantrasyonda higromisin içeren eksi Tet DMEM / F12 ortamını ekleyin. HEK293 hücreleri için mililitre higromisin başına 100 mikrogram kullanın.

Şeffaf plakaya karşı opak noktalara benzeyen farklı hücre odakları görünene kadar ortamı gerektiği gibi değiştirin. Her hücre odağının üzerine 20 mikrolitre tripsin ekleyin ve 200 mikrolitrelik bir pipet ucu ile iki kez yukarı ve aşağı sıkın. Hücreleri 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve higromisin içeren eksi Tet DMEM / F12 ortamında sürekli büyüme ile hücreleri genişletin.

Protein komplekslerinin tandem afinite saflaştırması veya TAP izolasyonu için doğrulanmış LAP etiketli hücre hattını genişletin. Bunu yapmak için, tüm HEK293 hücrelerini sürekli olarak daha büyük plakalara ve / veya silindir şişelere ve eksi Tet DMEM / F12 ortamına 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte geçirin. Tet / Dox ile indüklenebilir hücre hatları için, hücreler yaklaşık% 70 birleşmeye ulaştığında mililitre Tet / Dox başına 0.2 mikrogramlık bir konsantrasyon ekleyerek hücreleri 10 ila 15 saat boyunca indükleyin.

Hücreleri çalkalama veya tripsinizasyon ile hasat edin. Ardından, beş ila 10 dakika boyunca 875 kez g'de pelet haline getirin. Anti-GFP antikorunu protein A boncuklarına bağlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüpte PBST ile 160 mikrolitre paketlenmiş hacimli protein A boncuğu dengeleyin.

Boncukları 1 mililitre PBST ile üç kez yıkayın. Bu prosedür boyunca her yıkama adımından sonra, boncuklar 10 saniye boyunca 5000 kez g'de santrifüjlenir ve süpernatan çıkarılır. Boncukları 500 mikrolitre PBST içinde yeniden süspanse ettikten sonra, 160 mikrolitre boncuk içeren her tüpe 80 mikrogram afinite saflaştırılmış hızlı anti-GFP antikoru ekleyin.

Oda sıcaklığında bir saat karıştırın. Boncukları bir mililitre PBST ile iki kez yıkayın, ardından boncukları bir mililitre 0.2 molar sodyum borat ile iki kez yıkayın, pH Son yıkamadan sonra, son hacmi bir mililitreye getirmek için 900 mikrolitre sodyum borat tamponu ekleyin. Ardından, 20 milimolar'lık bir son konsantrasyon için boncuk süspansiyonuna 100 mikrolitre 220 molar DMP ekleyin.

Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hafifçe döndürün. DMP ile inkübe edildikten sonra, kalan çapraz bağlayıcıyı etkisiz hale getirmek için boncukları bir mililitre 0.2 molar etanolamin, 0.2 molar sodyum klorür pH 8.5 ile bir kez yıkayın. Ardından, boncukları aynı tamponun bir mililitresinde tekrar süspanse edin ve oda sıcaklığında bir saat döndürün.

Boncukları peletledikten sonra, 500 mikrolitre daha tamponda yeniden askıya alın. Hazırlanan boncuklar dört santigrat derecede birkaç ay stabildir. Hücre lizatlarını hazırlamak için, 500 mikrolitre paketlenmiş hücre hacmini, 0.5 milimolar DTT ve proteaz inhibitörleri ile 2.5 mililitre LAP 300'e yeniden süspanse edin.

90 mikrolitre% 10 nonil fenoksipolietoksiletanol ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Karışımı 10 dakika buzun üzerine koyun. 10 dakika boyunca 21.000 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, bu düşük hızlı süpernatanı toplayın ve jel analizi için 10 mikrolitrelik bir numune ayırın. Düşük hızlı süpernatanı bir TLA 100.3 tüpüne aktardıktan sonra, dört santigrat derecede bir saat boyunca 100.000 kez g'de döndürün. Bu yüksek hızlı süpernatanı bir tüpte toplayın ve jel analizi için 10 mikrolitrelik bir numune ayırarak buzun üzerine yerleştirin.

Anti-GFP boncuklara bağlanma yoluyla ilk afinite yakalama için, bağlanmamış antikorları çıkarmak ve arka planı azaltmak için antikora bağlı boncukları bir mililitre elüsyon tamponu ile üç kez yıkayarak önceden elüte edin. Bunu hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Boncukları uzun süre yüksek tuzda bırakmayın.

Ardından, boncukları bir mililitre LAP 200 N ile üç kez yıkayın. Ardından, yüksek hızlı süpernatan ekstraktını dört santigrat derecede bir saat boyunca antikor boncuklarıyla karıştırın. Ekstraktı 10 dakika boyunca 21.000 kez g'de santrifüjledikten sonra, jel analizi için süpernatanın 10 mikrolitrelik bir örneğini ayırın. 0,5 milimolar DTT ve proteaz inhibitörleri içeren bir mililitre LAP 200 N ile boncukları üç hızlı yıkama gerçekleştirin.

Boncukları iki kez daha yıkamak için aynı tamponu kullanın ve her yıkama için beş dakikalık bir inkübasyon süresi elde edin. Ardından, Tütün Aşındırma Virüsü veya TEV, proteazı eklemeden önce, 0,5 milimolar DTT içeren ve proteaz inhibitörü içermeyen 1 mililitre LAP 200 N ile boncukları iki kez daha hızlı bir şekilde yıkayın. Boncuklara bir mililitre LAP 200 N'de 10 mikrogram TEV proteaz ekleyin ve tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede döndürün.

Ertesi gün, boncukları topaklayın ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Boncukları, kalan proteini çıkarmak için 0,5 milimolar DTT ve proteaz inhibitörleri içeren 160 mikrolitre LAP 200 N ile iki kez durulayın. S-protein agaroza bağlanma yoluyla ikinci afinite yakalama için, 80 mikrolitre S-protein agaroz bulamacından oluşan bir tüpü bir mililitre LAP 200 N ile üç kez yıkayın.

Boncukları peletledikten sonra, 0,5 milimolar DTT ve proteaz inhibitörleri içeren bir mililitre LAP 200 N ile üç kez yıkayın. Ardından, boncukları bir mililitre LAP 100 ile iki kez yıkayın. 50 mikrolitre 4x Laemmli numune tamponu ekleyerek ve 97 santigrat derecede 10 dakika ısıtarak proteinleri S-protein agarozundan çıkarın.

Kütle spektrometresi analizi ile etkileşime giren proteinleri tanımlamak için, toplanan numuneleri Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile analiz ederek saflaştırmanın kalitesini test edin. Gümüş elde edilen jeli lekeleyin. Ayrıca, LAP etiketli saflaştırmanın çalıştığından emin olmak için elüatları ve probetikleri anti-GFP antikorları ile araştırın.

Stokiyometrik ve substokiyometrik birlikte saflaştırıcı türleri tanımlamak için, son elüsyon örneğini alın ve SDS-PAGE ile ayırın. Jeli kütle spektrometresi uyumlu bir protein boyası ile boyayın. Kütle spektrometresi ile analiz için bantları ayrı ayrı işlemek için jeldeki en belirgin bantları ve aralarındaki boşluğu çıkarın.

Burada, indüklenmemiş ve Dox ile indüklenen LAP-Tau HEK293 hücrelerinden alınan protein örneklerinin temsili bir western blot analizi gösterilmektedir. Hücreler, Tubulin yükleme kontrolünü tespit etmek için anti-Tubulin antikorları ile incelenir ve LAP etiketli Tau proteinini tespit etmek için anti-GFP ile problanır. LAP-Tau'nun yalnızca hücreler Dox ile indüklendiğinde ifade edildiğini unutmayın.

LAP-Tau'yu eksprese eden mitotik hücreler sabitlendi ve anti-Tubulin antikorları ile DNA ve Tubulin için birlikte boyandı ve LAP-Tau'nun hücre altı lokalizasyonu floresan mikroskobu ile analiz edildi. LAP-Tau'nun mitoz sırasında mitotik mil ve mil kutuplarına lokalize olduğunu unutmayın. Burada gösterilen, LAP-Tau saflaştırmasının temsili bir gümüş lekeli jelidir.

Şeritler moleküler ağırlığı, temizlenmiş lizatları ve son elüatları temsil eder. Numuneler %4-20'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırıldı ve saflaştırılmış proteinleri görselleştirmek için jel gümüş lekeli hale getirildi. LAP-Tau'ya karşılık gelen bir bandın bir yıldızla işaretlendiğine ve birlikte saflaştırıcı proteinlere karşılık gelen birkaç başka bandın görülebileceğine dikkat edin.

Bu videoyu izledikten sonra, indüklenebilir LAP etiketli kararlı hücre hatlarının nasıl oluşturulacağını ve proteomik analiz ve protein etkileşim ağlarının tanımlanması için LAP etiketli proteinlerin biyokimyasal saflaştırmalarının nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.