Sıçanlar Kronik Kalp Enfarktüsü histolojik Niceleme

Bu histolojik prosedürün genel amacı, enfarktüs boyutunu ve sol ventrikül yeniden şekillenmesini değerlendirmek için bir miyokard enfarktüsü sıçan modeli kullanarak enfarktüs genişleme indeksi ve kalp yapısal parametrelerinin morfometrik kantifikasyonunu gerçekleştirmektir. Bu yöntem, miyokard enfarktüsünü takiben rejeneratif tedavinin etkisi veya enfarktüs genişlemesini azaltmayı amaçlayan yeni stratejiler gibi kardiyak alandaki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, enfarktüs boyutunu doğru bir şekilde değerlendirmek ve yeniden şekillenme boyunca sol ventrikül değişikliklerini hesaba katmak için hasat edilen sıçan kalbinin sistematik örneklemesinin kullanılmasıdır.

Bu yöntemin izlenmesi, miyokard enfarktüsünün kronik sıçan modelinde enfarktüs boyutu hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca farelere veya akut miyokard enfarktüsü veya iskemi reperfüzyonu gibi diğer iskemik modellere de uygulanabilir. Bu işleme başlamak için, anestezi altında miyokard enfarktüslü bir hayvana sternotomi yapın.

Cerrahi makasla deriye ve sternum boyunca kaslara bir kesi yapın. Ardından, göğsü çıkarmak için soldan ve sağdaki kaburgaları kesin. Bundan sonra, LAD ligasyonundan sonra kalan yapışıklıkları çıkarın.

Aortu kesin ve kalbi çıkarın, ardından dokuyu PBS ile yıkamadan önce bir dakikadan daha az bir süre boyunca bir molar potasyum klorür ile PBS'ye yerleştirin. Dokuyu korumak için, ventriküllerin içindeki PBS dikkatlice çıkarılmalıdır. Daha sonra, enfarktüslü kalbi akrilik bir sıçan kalbi matrisine aktarın ve uzunlamasına konumlandırın.

Ardından bir saat boyunca eksi 20 santigrat derecede tutun. Bir saat sonra sistematik örnekleme için, kalbi bir tıraş bıçağı kullanarak doğrudan matriste kesin. Her bölümün iki milimetre kalınlığında olduğundan emin olun.

Daha sonra, bölümleri 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca %1 TTC'de inkübe ederek TTC boyama işlemini gerçekleştirin, ardından oda sıcaklığında 20 ila 60 dakika boyunca %4 PFA'da inkübe edin. Daha sonra, bölümleri iki milimetre ara parçalı iki cam plaka arasına yerleştirin ve 15x büyütmeli bir kamera ile birleştirilmiş stereolojik mikroskop ile fotoğraf çekin. Beyaz renkte görünen enfarktüs bölgesini ve kırmızı renkte görünen sağlıklı miyokardı görselleştirmek için bir TTC boyama prosedürü yapıldı.

Büyük bir miyokard enfarktüsü için, apeksten tabana transmural enfarktüsler gözlendi. Daha küçük enfarktüsler, apeksten kalbin orta bölümüne kadar görülebilen beyaz enfarktüslü doku sundu. Küçük, transmural olmayan enfarktüsler için, apeksten sadece bir veya iki bölümde fibrotik doku gözlendi.

Bölümleri dondurmak için, her bir bölümü kriyotomi için montaj ortamı olan plastik bir kalıba yerleştirin ve tepeyi kalıpta aşağı doğru konumlandırın. Blokları 2-Metilbütan buharları ile sıvı nitrojen soğutma altında 10 ila 15 dakika dondurun. Bundan sonra, dokuları eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Parafinizasyon için, her bir bölümü, tepe noktası altta bakacak şekilde bir gömme kasetine yerleştirin, ardından kasetleri 24 saat boyunca %4 PFA'da tutun. Daha sonra, gece boyunca bir doku işlemcisine yerleştirin. İşlem tamamlandıktan sonra, her kalp bölümünü parafine gömerek bloklar yapın.

Bu prosedürde, manuel bir mikrotom ile parafin bloklarından 5 mikron kalınlığında doku kesitleri hazırlayın. Ardından, Masson-Goldner trikrom boyama ile her sıçan için her kalp bölümünden bir slayt boyayın. Parafin bölümleri için dokuları 60 derecede bir fırında eritin.

Bir davlumbaz altında, her biri on dakika boyunca iki kez ksilol içinde deparafinize edin. Daha sonra bunları %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol ve ardından her biri üç dakika damıtılmış su ile yeniden sulandırın. Deparafinlenmiş bölümler ve kriyo bölümleri için, bunları gece boyunca Bouin solüsyonunda sabitleyin.

Ertesi sabah, akan musluk suyunda 10 ila 15 dakika durulayın, ardından damıtılmış su kullanarak tekrar durulayın. Bouin ile fiksasyon, muhteşem bir Goldner boyaması sağlamak için en önemli adımdır. Onları Mayer'in hematoksilininde üç dakika inkübe edin.

Üç dakika sonra slaytları çıkarın ve beş dakika damıtılmış suda bırakın. Daha sonra, bir dakika boyunca% 1 asetik asit ile durulamadan önce beş dakika boyunca ponceau asit fuksin içinde inkübe edin. Daha sonra, bölümleri bir dakika boyunca fosfomolibdik asit turuncu g içinde inkübe edin ve ardından bir dakika boyunca% 1 asetik asit içinde durulayın.

Açık yeşil boyada on dakika inkübe edin ve ardından bir dakika boyunca% 1 asetik asit içinde durulayın. Son olarak, bölümleri sırayla 30 saniye boyunca %70 etanol, 30 saniye boyunca %95 etanol ve beş dakika boyunca %100 etanol içinde kurutun. Doku bölümlerine bir damla reçineli montaj ortamı sürün, üzerlerini örtü fişleri ile örtün ve kurumaya bırakın.

Bu adımda, 15x büyütmeli bir kamera ile birleştirilmiş bir stereo mikroskop kullanarak her slayttan bir görüntü elde edin. Aynı ayarlar altında bir cetvelin fotoğrafını çekin. Her kalp diliminden beşer mikronluk ince kesitler kesildi ve Masson-Goldner trikrom ile boyandı.

Sağlıklı dokular kırmızı, bağ dokusu ise yeşil renkte göründü. Ardından, enfarktüsün ortasındaki yara kalınlığını, septum kalınlığını, sol ventrikül boşluğu alanını, enfarktüs alanını ve LV doku alanını ölçmek için görüntü analiz yazılımını kullanın. Bunu yapmak için, ölçeği cetvel resmiyle ayarlayın.

Ölçümlere tıklayın ve dönüştürme faktörünü ayarla'yı seçin. Kalibrasyon çubuğuna bir çizgi çizin. Resmin üzerine sağ tıklayın ve kalibrasyonu sonlandır'a tıklayın.

Çubuk değerini not edin ve Tamam'ı tıklatın. LV'yi nokta nokta seçmek için çoklu segment aracını kullanın ve ardından herhangi bir yere sağ tıklayın, kopyala yapıştır yapın. Bundan sonra, tek segment ölçüm aracını kullanarak yara izini ve septum kalınlığını ölçün. Ardından, RGB modunda otomatik alan ölçüm aracını kullanarak LV boşluğu, enfarktüs ve LV alanlarını otomatik olarak tespit edin.

RGB modunda yalnızca kenarlıkları ve bitişikleri etkinleştirin. Son olarak, tespit etmek için ilgilenilen alanın içine tıklayın. Bundan sonra, enfarktüs boyutunu, enfarktüs alanının AG alanına oranı olarak hesaplayın.

Ardından, bu formülü kullanarak genişleme indeksini hesaplayın. Son olarak, gösterilen formülü kullanarak her kalp için bir ortalama hesaplayın. Goldner boyamasından hesaplanan genleşme indeksi, enfarktüs gelişimini değerlendirmek için iyi bir indekstir.

Şekilde gösterildiği gibi, sol ventrikülün yüzdesi olarak ifade edilen enfarktüs boyutu ve ekokardiyografi ile ölçülen ejeksiyon fraksiyonu ile ilişkilidir. Grafiklerde doğrusal regresyon ve %95 güven aralıkları temsil edilmektedir. Enfarktüs genişleme indeksi buradaki formülde açıklandığı gibi hesaplanmıştır.

Tüm LV alanı, kombine LV kavite ve LV doku alanı olarak ölçüldü. Enfarktüsün yüzdesi gösterildiği gibi hesaplandı. Fonksiyon, LAD ligasyonundan altı hafta sonra yüksek çözünürlüklü ekokardiyografi kullanılarak değerlendirildi.

Bu videoyu izledikten sonra, kalbin sistematik bir örneğinin nasıl alınacağını ve leke bölümlerinin görüntü analizine dayalı olarak enfarktüs boyutunun nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.