Peptit kaynaklı Yöntem Bitkiler Genler ve Proteinler Hücresel karşısında ve Organel Engeller Transport

Bu peptit türevli yöntemin genel amacı, bitkilerdeki hücresel ve organeller arası bariyerler boyunca genlerin ve proteinlerin taşınmasını sağlamaktır. Bu yöntem, belirli genlerin ekspresyonunu yönetmek için çeşitli genleri ve proteinleri ileten, rasyonel olarak tasarlanmış peptit konjugatları aracılığıyla bitkilerin modifikasyonu ile temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin sağladığı doğrudan avantaj, hücresel ve organeller arası sınırları aşabilen peptitlere dayalı, bitki yaprakları üzerinde uygulanan basit bir şırınga destekli transfeksiyon prosedürü kullanmasıdır.

Geleneksel yöntemler maliyetli olduğu, bazı bitki türlerine uygulanamadığı ve hücre içi organelleri hedefleyemediği için bu basit, etkili ve özgün bitki transformasyon yöntemini geliştirdik. Jo-Ann Church, laboratuvarımdan teknisyen Yoko Horii ile birlikte prosedürü uygulamalı olarak gösterecektir. Peptit plazma DNA formülasyonunu metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlayın.

Peptid plazma DNA'ya eklendiğinde, bulanık bir çözelti oluşacaktır. Karışım, metin protokolünde belirtilen nihai hacme ulaşana kadar ultrapure su ile seyreltildiğinde berraklaşır. Seyreltilmiş çözeltinin 800 microliter'ını dinamik ışık saçılım analizi için bir küvete aktarın.

Oluşturulan komplekslerin hidrodinamik çapını ve polidispersite indeksini bir zetananosizer ile belirleyin. Ölçümler için 25 °C'de, 173 derecelik bir geri saçılma tespit açısıyla 633 nanometrelik bir helyum neon lazer kullanın. Boyut ölçümlerinin ardından, çözeltiyi 25 °C'deki suyun varsayılan dielektrik sabiti, kırılma indisi ve viskozite parametrelerinde zeta potansiyeli ölçümleri yapmak üzere katlanmış bir kapiler hücreye aktarın.

Kompleks çözeltisini atomik kuvvet mikroskobu ile gözlemlemek için, mika tabakasının yeni açılmış cleaved yüzeyine 10 µL damlatın ve mikanın kapalı plastik bir Petri kabında gece boyunca havada kurumasını bekleyin. 25 °C'de, tapping modunda, 1,3 N/m yay sabitine sahip bir silikon cantilever kullanarak komplekslerin havada görüntüsünü alın. 22 °C'de, 16 saat ışık ve 8 saat karanlık döngüsü altında yetiştirilmiş üç haftalık Arabidopsis thaliana kullanın.

Gen ekspresyonunun miktar tayini için üçleme oluşturacak şekilde, transfeksiyon için en az üç yaprak seçin. Bir yaprağın transfeksiyonu için, iğnesiz bir mililitrelik plastik şırıngaya 100 µL kompleks çözelti doldurun. Ardından, şırınga ucunu yaprağın abaksiyal yüzeyine yerleştirin.

Şırınga ucunu yaprağa hafifçe bastırın ve karşı taraftan lateks eldivenli bir elin işaret parmağı ile karşı basınç uygularken şırınga pistonunu yavaşça aşağı itin. Başarılı infiltrasyon, yaprakta suyla doymuş bir alanın yayılmasıyla gözlemlenebilir. Kolayca tanımlayabilmek için infiltre edilen yaprakları etiketleyin.

Peptit plazmid DNA ile transfekte edilmiş bitkiyi bir yetiştirme kabininde 12 saat boyunca inkübe edin. Transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için önce transfekte edilmiş yaprağın tamamını kesin. Renilla Luciferase raporlayıcı vektör kullanılarak yapılan transfeksiyon deneyleri için, transfeksiyon verimliliğini bir Renilla Luciferase analiz kiti kullanarak kantitatif olarak belirleyin.

İlk olarak, çıkarılan her bir yaprağı 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Her tüpe 100 µL 1X Lizis Tamponu ekleyin. Aynı şekilde, transfekte edilmemiş kontrol yapraklarının lizatlarını üç tekrarlı olarak hazırlayın.

Yaprağı bir homojenizasyon havanı ile ezin ve elde edilen lizatı 25 °C'de 6 ila 10 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, lizatı bir mikro santrifüj cihazında 12.470 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Berraklaşmış lizattan 20 µL'lik bir miktarı 96 kuyucuklu bir mikroplakadaki bir kuyucuğa aktarın.

Kalan hacmi, üretici protokolüne uygun olarak bir BCA protein analiz kiti kullanarak toplam protein konsantrasyonunun tayini için kullanın. Ardından, kuyucuğa 100 µL bir kat Renilla Luciferase analiz substratı ekleyin ve yavaşça pipetleyerek karıştırın. Mikroplakayı çok modlu bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve ölçümü başlatın.

Yeşil floresan protein raporlayıcı vektör kullanan transfeksiyon deneyleri için, floresansı konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak gözlemleyin. İlk olarak, hava boşluklarının giderilmesine yardımcı olmak için bütün bir yaprağın kenarlarını kesin. Ardından, 10 milileter şırınganın pistonunu çıkarın ve kesilmiş her bir yaprağı veya yaprak kesitini şırınganın içine yerleştirin.

Pistonu yerine takın ve yaprağı ezmeden nazikçe şırınganın tabanına doğru itin. Şırınga yaklaşık yarıya dolana kadar içine su çekin. Şırıngayı yukarı doğru tutun ve havayı uç kısımdan çıkarmak için pistona bastırın.

Ardından, şırınganın ucunu kapatın ve yapraktaki havayı tahliye etmek için pistonu yavaşça aşağı doğru çekin. Yaprak yarı saydam görünene kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın. Sonra, bir mikroskop lamının yüzeyini yapışkan bantla kaplayın.

Bir bıçak kullanarak bandın üzerine yaprak örneğini sığdıracak büyüklükte kare bir alan kesin ve bir numune odası oluşturmak için kare bant parçasını pensetle soyun. Bant, lam ile lamella arasında bir ara parça görevi görecektir. Yaprağı, abaksiyal yüzeyi yukarı bakacak şekilde odaya yerleştirin ve odanın geri kalan alanını suyla doldurun.

Yaprağı, bir lam camı ile hazne içinde mühürleyin ve lam camının kenarlarını yapışkan bantla sabitleyin. Yaprak örneğini, bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak 40x objektif veya 63x su daldırma objektifi altında inceleyin. GFP floresansı, 488 nanometre uyarım dalga boyunda görselleştirilebilir.

0.5 peptit-DNA oranındaki peptit plazma DNA formülasyonunun optimal bir hazırlığı, yaklaşık 290 nanometre ortalama bir çapa ve tekdüze bir boyut dağılımına işaret eden yaklaşık 0.3 değerinde düşük bir polidispersite indeksine sahip olmalıdır. Ek olarak, kompleksler yaklaşık 30 milivolt değerinde bir zeta potansiyeli sergilemelidir. Peptit plazma DNA komplekslerinin temsili bir atomik kuvvet mikroskobu görüntüsü burada gösterilmiştir.

Homojen globular kompleksler gözlemlendi. Peptit plazma DNA formülasyonu kullanılarak, Arabidopsis thaliana'da plazma DNA'nın çekirdek hedefli iletimi ve ekspresyonu, miligram başına yaklaşık 100.000 gibi tahmini bir Renilla Luciferase değeriyle gerçekleştirilebilir. Gen ekspresyonunu değerlendirmek amacıyla, GFP raporlayıcısını kodlayan plazma DNA kullanılarak hazırlanan komplekslerle işlem görmüş yapraklarda mikroskobik gözlem yapıldı.

Görüntüler, hedef dışı peptit plazma DNA kompleksleri ile transfekte edilmiş hücrelerde, GFP ekspresyonuna karşılık gelen yaygın yeşil floresansın net bir şekilde gözlemlendiğini ve sitozole lokalize olduğunu ortaya koymuştur. Bu teknik, geliştirildikten sonra bitki biyoteknolojisi alanındaki araştırmacıların çeşitli protein ve nükleik asit bazlı kargoları canlı bitkilere iletmesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten ve metin protokolünü okuduktan sonra; plazma DNA, çift sarmallı DNA veya RNA ve protein dahil olmak üzere her bir kargo tipi için optimize edilmiş çeşitli formülasyonların nasıl hazırlanacağı, karakterize edileceği ve uygulanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.